任思宇，吳春艷，汪開毓，王雯慧，劉震坤，楊延輝

( 1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 404155； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130 )

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，俗稱石棒、石蛙等，屬叉舌蛙科棘胸蛙屬，主要分布于我國(guó)南部山區(qū)的溪流生境中。20世紀(jì)80年代初期，國(guó)內(nèi)便開始了棘胸蛙的人工養(yǎng)殖，2000年后逐步實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化發(fā)展。隨著行業(yè)規(guī)模的擴(kuò)大，高致死的細(xì)菌性傳染病逐漸成為制約棘胸蛙養(yǎng)殖的關(guān)鍵因素，目前已有致病性蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)[1]、布氏檸檬酸桿菌(Citrobacterbraakii)[2]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[3-4]及肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[5]等感染棘胸蛙后導(dǎo)致嚴(yán)重死亡的報(bào)道。2019年6月，重慶市石柱縣某養(yǎng)殖場(chǎng)的棘胸蛙出現(xiàn)大量死亡，死亡蛙呈典型的出血性敗血癥癥狀，可見明顯的紅腿與腹水癥；個(gè)別病蛙單側(cè)眼渾濁，整個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病率約40%，某些單獨(dú)養(yǎng)殖室內(nèi)的發(fā)病率接近60%，發(fā)病后死亡率約80%。筆者采集病樣，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)，開展藥敏試驗(yàn)、組織病理學(xué)與超微病理學(xué)等研究，旨在明確該病的致病原因，探索感染后造成的病理損傷，為棘胸蛙的健康養(yǎng)殖與疾病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)病棘胸蛙體質(zhì)量為(130±20) g，采自重慶市石柱縣某養(yǎng)殖場(chǎng)。健康棘胸蛙表現(xiàn)活躍，體表無損傷，體質(zhì)量(120±10) g，購自重慶市彭水縣某養(yǎng)殖場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d后未見任何疾病表現(xiàn)；在回歸感染前，隨機(jī)選取其中5只蛙進(jìn)行寄生蟲與細(xì)菌的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有感染。健康棘胸蛙暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的玻璃缸中，缸內(nèi)水深約1 cm，并鋪設(shè)干養(yǎng)區(qū)。每日換水1次，控制環(huán)境溫度為(25±2) ℃。每日8:00、18:00投喂黃粉蟲，自由采食。腦心浸出液肉湯(BHI)，購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；2×Taq PCR Mastermix (KT201)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)，購于天根生化科技(北京)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、藥敏紙片，購于杭州微生物試劑有限公司；血平板(成品培養(yǎng)基024070)，購自于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；嗜水氣單胞菌CW(基因登錄號(hào)：MN475912)，由“長(zhǎng)江上游魚類資源保護(hù)與利用”四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 病原菌的分離純化

取發(fā)病棘胸蛙的體表潰瘍處組織、體表黏液以及腸道內(nèi)容物制作壓片，采集心血制作血涂片以檢測(cè)寄生蟲的感染。在無菌條件下，用接種環(huán)挑取發(fā)病棘胸蛙的肝臟與腹水，劃線接種于BHI平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取單一的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得純化菌株。

1.3 回歸感染試驗(yàn)

將健康棘胸蛙隨機(jī)分為5組(10尾/組)，其中4組為感染組，1組為對(duì)照組。感染組中，每組分別腹腔注射密度為1×105、1×106、1×107、1×108cfu/g的病原菌生理鹽水重懸液，每尾注射量為0.2 mL；對(duì)照組腹腔注射等量的無菌生理鹽水。接種后連續(xù)觀察14 d，記錄棘胸蛙死亡的時(shí)間與數(shù)量，并進(jìn)行細(xì)菌的再次分離鑒定。

1.4 表型特征鑒定和16S rDNA、gyrB基因鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

參照文獻(xiàn)[6]對(duì)分離菌進(jìn)行表型特征鑒定，并將其接種于血平板上，觀察溶血特性，并將嗜水氣單胞菌CW作為參照菌株共同進(jìn)行試驗(yàn)。抽提分離菌的DNA作為模板，采用16S rDNA與gyrB基因的相關(guān)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后提交至北京擎科生物科技有限公司成都分公司進(jìn)行測(cè)序分析。序列結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并采用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。PCR反應(yīng)體系為：25 μL的2×Taq PCR Mastermix，2 μL模版DNA，2 μL上游引物，2 μL下游引物，加水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。16S rDNA、gyrB基因的擴(kuò)增引物分別為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，3′-TACGGC TACCTTGTTACGAC-5′；5′-GAAGTCATCATG ACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，3′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNA CRTCNGCRTCNGTCAT-5′。

1.5 藥敏試驗(yàn)

無菌條件下將密度為1.0×107cfu/g的病原菌液涂布于BHI平板上，用滅菌后的鑷子將藥敏紙片粘貼于平板表面，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(重復(fù)3次)，根據(jù)杭州微生物試劑有限公司抑菌圈標(biāo)準(zhǔn)判定該細(xì)菌的藥物敏感性。

1.6 組織病理學(xué)觀察

取自然發(fā)病和健康棘胸蛙的肝臟、腎臟、脾臟、心臟及腦等組織，固定于10%中性甲醛溶液中，制作石蠟切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，置于顯微鏡(LC30，Olympus CX33)下觀察并采集病理圖片。

1.7 超微病理學(xué)觀察

將自然發(fā)病和健康棘胸蛙的脾臟(組織大小為1 mm×1 mm×2 mm)，固定于4 ℃預(yù)冷的電鏡專用固定液(2.5%的戊二醛溶液)中。透射電鏡樣品經(jīng)洗滌后放入1%的鋨酸中固定2～4 h；梯度丙酮脫水后，放入1∶1(體積比)的環(huán)氧樹脂和丙酮中置換2 h，再放于純環(huán)氧樹脂中40 ℃置換2 h；包埋固化后經(jīng)醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色，放于透射電子顯微鏡(日立H-600IV)下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)病棘胸蛙的臨床癥狀

自然發(fā)病蛙均出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、精神沉郁、食欲減退的癥狀，半數(shù)以上的病蛙腳掌處可見潰爛，個(gè)別病蛙出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)眼渾濁(圖1a)。約75%的病蛙在發(fā)病后的3 d內(nèi)死亡，病蛙腿部、腹部發(fā)紅腫脹(圖1b、圖1c)，蹼間出血明顯(圖1d)，口腔中可見出血點(diǎn)或出血斑(圖1e)；病蛙死亡前全身顫抖、站立不穩(wěn)或出現(xiàn)不規(guī)則的轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)，死亡時(shí)四肢僵直。解剖后可見肝臟出血(圖1f)，脾臟顏色暗黑、極度腫脹(圖1g)，腸系膜嚴(yán)重充血(圖1h)，并伴有大量腹水。約5%的病蛙在發(fā)病后5～10 d死亡，病蛙體表及內(nèi)臟器官的出血情況相對(duì)較輕，但可見心包積液，個(gè)別可見典型的絨毛心癥狀(圖1i)。

圖1 自然發(fā)病棘胸蛙的臨床癥狀與解剖學(xué)變化

2.2 病原菌的分離與回歸感染

發(fā)病棘胸蛙經(jīng)采集心血制作血涂片，采集腸道內(nèi)容物、體表黏液及潰瘍處組織制作壓片后，顯微鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)寄生蟲感染。從病蛙的肝臟與腹水中分離出1株優(yōu)勢(shì)菌SZW-003，該菌在BHI平板上長(zhǎng)勢(shì)良好，28 ℃培養(yǎng)24 h后可長(zhǎng)出淡黃色菌落，菌落邊緣整齊，表面圓潤(rùn)。

腹腔注射SZW-003菌株的生理鹽水重懸液后12 h，棘胸蛙反應(yīng)遲鈍，對(duì)換水、投喂等刺激因素不敏感，執(zhí)握時(shí)掙脫能力下降。最高密度組在接種后18 h即出現(xiàn)死亡，其他各組在第2、3天均陸續(xù)出現(xiàn)死亡。感染蛙的臨床癥狀及病理表現(xiàn)和自然發(fā)病棘胸蛙相似，呈出血性敗血癥表現(xiàn)(圖2)。7 d后，感染試驗(yàn)組再無死亡現(xiàn)象，試驗(yàn)過程中對(duì)照組無任何變化(表1)。通過寇氏法計(jì)算得出菌株SZW-003對(duì)棘胸蛙的半致死密度為1.59×106cfu/g；從回歸感染組發(fā)病棘胸蛙的肝臟中再次分離細(xì)菌，獲得的菌株16S rDNA和gyrB測(cè)序結(jié)果與菌株SZW-003一致。

圖2 回歸感染棘胸蛙的臨床癥狀與解剖學(xué)變化

表1 菌株SZW-003的人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病原菌的表型特征鑒定

生理生化反應(yīng)顯示：菌株SZW-003山梨醇、山梨糖、鼠李糖、尿素、肌醇為陰性；枸櫞酸鹽、硝酸鹽還原、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、半乳糖、膽汁七葉苷、硫化氫、吲哚、硫化氫、V-P試驗(yàn)、木糖、乳糖、賴氨酸、精氨酸為陽性(表2)。將菌株接種于血平板上呈典型的β溶血。

表2 菌株SZW-003分離株與參照菌株的生理生化特性

2.4 病原菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)菌株SZW-003的16S rDNA與gyrB基因進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到1400 bp及約1100 bp的PCR產(chǎn)物，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。16S rDNA的結(jié)果顯示，菌株SZW-003與嗜水氣單胞菌(MF079290、MF716694)的同源關(guān)系最近(圖3)。gyrB的結(jié)果顯示，菌株SZW-003與編號(hào)為JX025785、JQ085472的嗜水氣單胞菌在發(fā)育樹中聚在一簇，親緣關(guān)系最近(圖4)。上傳菌株SZW-003序列至GenBank，獲得16S rDNA登錄號(hào)為MW767835，gyrB基因登錄號(hào)為MZ223373。

圖3 菌株SZW-003的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 菌株SZW-003的gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 嗜水氣單胞菌SZW-003的藥物敏感性

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，嗜水氣單胞菌SZW-003對(duì)恩諾沙星、四環(huán)素、阿奇霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、氟苯尼考、頭孢噻肟、慶大霉素等多種藥物敏感，對(duì)頭孢氨芐、阿莫西林、青霉素、氨芐西林等藥物耐藥(表3)。

表3 嗜水氣單胞菌SZW-003藥物敏感性試驗(yàn)

2.6 組織病理學(xué)觀察

組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明：病蛙肝臟中部分肝細(xì)胞腫脹，呈局灶性的裂解壞死，但未出現(xiàn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖5a)；腦組織中大量神經(jīng)細(xì)胞腫脹變性，細(xì)胞核消失，胞內(nèi)精細(xì)成分不清晰，并可見空泡狀結(jié)構(gòu)(圖5b)；腎小管上皮細(xì)胞透明變性，呈均質(zhì)的紅染結(jié)構(gòu)，局部腎小管裂解脫落僅見輪廓；腎間質(zhì)的結(jié)締組織松散，纖維斷裂，大量單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5c、圖5d)；心肌纖維未出現(xiàn)明顯損傷，但心包膜極度腫脹，其外可見大量的炎性滲出物，包含中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及單核細(xì)胞，部分炎性細(xì)胞壞死裂解后僅剩細(xì)胞核殘片(圖5e)；脾紅髓細(xì)胞排列疏松散亂，大量紅細(xì)胞瘀滯其中，纖維架構(gòu)大面積斷裂，脾索消失，完整性嚴(yán)重受損，網(wǎng)狀細(xì)胞壞死脫落(圖5f)；白髓中淋巴細(xì)胞排列疏松，出現(xiàn)核固縮樣壞死，白髓面積顯著縮小，周圍的黑色素巨噬細(xì)胞中心崩解消失(圖5g)；肺與腸道未出現(xiàn)明顯的病理變化。

健康棘胸蛙肝臟染色清晰，細(xì)胞界限明顯(圖5h)；腦組織中神經(jīng)細(xì)胞正常，細(xì)胞核與核仁可辨(圖5i)；腎臟中腎小球與腎小管著色適中，未見透明變性與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5j)；心臟中心肌纖維正常，心外膜與心包膜典型，心包腔中無炎性滲出物(圖5k)；脾臟紅白髓結(jié)構(gòu)清晰，未見充血、出血及纖維斷裂(圖5l)。

圖5 自然發(fā)病棘胸蛙與健康棘胸蛙的組織學(xué)觀察

2.7 超微病理學(xué)觀察

超微病理學(xué)研究顯示，發(fā)病棘胸蛙脾臟內(nèi)細(xì)胞離散，嗜酸性粒細(xì)胞壞死，纖維腫脹斷裂，細(xì)胞碎片散亂分布于細(xì)胞間(圖6a、b)；血管壁膠原纖維腫脹斷裂，管內(nèi)外均可見裂解的纖維殘痕；較正常的網(wǎng)狀細(xì)胞表面可見大量胞質(zhì)突起，但含有較多腫脹溶酶體的網(wǎng)狀細(xì)胞胞質(zhì)突起減少，正在向典型與非典型兩類黑色素巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變(圖6c、d)；受損的網(wǎng)狀細(xì)胞內(nèi)線粒體腫大，淋巴細(xì)胞空泡化明顯(圖6e)；游離的巨噬細(xì)胞中可見吞噬的細(xì)菌顆粒(圖6f)。健康棘胸蛙超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，細(xì)胞間距正常，纖維結(jié)構(gòu)清晰未斷裂，脾索內(nèi)皮細(xì)胞完整，脾竇內(nèi)分布有適量的紅細(xì)胞(圖6g、h)。

圖6 發(fā)病棘胸蛙與健康棘胸蛙脾臟的透射電鏡觀察

3 討 論

3.1 棘胸蛙感染嗜水氣單胞菌后的臨床癥狀

20世紀(jì)70—90年代，人們發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌的感染給無尾類的生存造成了巨大隱患，甚至認(rèn)為該菌是無尾類自然種群規(guī)模下降的重要原因[7-8]。本試驗(yàn)中，棘胸蛙多在發(fā)病后3 d內(nèi)死亡，表現(xiàn)出多組織器官的廣泛性出血，這與已有的報(bào)道[9-10]一致。但值得注意的是，本試驗(yàn)中少數(shù)病蛙的出血癥狀輕微，但可見心包積液及絨毛心；該類病蛙約在發(fā)病后5～10 d死亡，推測(cè)是因循環(huán)系統(tǒng)功能的嚴(yán)重受損所致；搜索文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)是無尾類感染嗜水氣單胞菌后出現(xiàn)心包積液與絨毛心的首次報(bào)道。盡管本試驗(yàn)中，嗜水氣單胞菌感染棘胸蛙后發(fā)生了敗血癥，但有研究顯示，敗血癥只是細(xì)菌感染后所引發(fā)的一種臨床癥狀，不同細(xì)菌的感染均可引發(fā)[11]，因此不能成為疾病確診的依據(jù)，有關(guān)病原的診斷還需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行鑒定。

3.2 棘胸蛙出血性敗血癥的病因分析

Forbes等[12]研究表明，無尾類自身免疫功能受到抑制是導(dǎo)致嗜水氣單胞菌感染的重要原因。他們發(fā)現(xiàn)，無尾類在冬眠期間因免疫功能降低可引發(fā)感染，尤其在冬眠后的回暖期，病菌繁殖加快，但機(jī)體免疫能力未能隨之激活，此時(shí)易出現(xiàn)發(fā)病的高峰期，且體表損傷可顯著提高疾病的發(fā)生率。本病例發(fā)病時(shí)的環(huán)境溫度為13.0～18.5 ℃，而棘胸蛙的最適生存溫度為20～27 ℃；此外，當(dāng)環(huán)境溫度回升至15.7 ℃時(shí)棘胸蛙便出現(xiàn)繁殖行為[13-14]。因此，筆者認(rèn)為低溫限制了棘胸蛙的免疫功能是本次疾病發(fā)生的根本原因，而求偶打斗與攝食競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致的體表損傷更促進(jìn)了病菌的感染，這與已有的研究結(jié)果相一致。

3.3 棘胸蛙出血性敗血癥的病理分析

3.4 棘胸蛙出血性敗血癥的防控建議

藥敏試驗(yàn)顯示，嗜水氣單胞菌SZW-003菌株對(duì)阿莫西林、青霉素及頭孢氨芐等β內(nèi)酰胺類藥物耐藥，而對(duì)喹諾酮類、氯霉素類及四環(huán)素類等藥物敏感，這與已報(bào)道的棘胸蛙源及其他蛙源的嗜水氣單胞菌藥敏結(jié)果相似[22-24]。與此不同的是，近年來源于大鯢與魚類的嗜水氣單胞菌大多表現(xiàn)出耐藥譜廣、耐藥率高等特點(diǎn)，尤其對(duì)恩諾沙星、氟苯尼考等水產(chǎn)常用抗生素表現(xiàn)出嚴(yán)重的耐藥性[15,19]，有學(xué)者研究認(rèn)為，這與大鯢和魚類養(yǎng)殖過程中濫用抗生素，造成水環(huán)境中嗜水氣單胞菌的獲得性耐藥不斷加重有關(guān)[19]。雖然無尾類對(duì)水環(huán)境的依賴程度較低，且目前蛙源的嗜水氣單胞菌對(duì)許多水產(chǎn)用抗生素依然敏感，但生產(chǎn)上也一定要克服未明確病原就盲目使用抗生素的情況，避免在將來出現(xiàn)無藥可用的局面。此外，有報(bào)道顯示，無花果根、銀合歡種子及葫蘆巴等植物性藥物在控制嗜水氣單胞菌感染時(shí)有良好的效果[25-26]，因此，加強(qiáng)植物性藥物的研發(fā)與使用可能是將來有效防治嗜水氣單胞菌病的重要途徑。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)確定了嗜水氣單胞菌是導(dǎo)致此次棘胸蛙出血性敗血癥的病原菌，該菌感染后可造成棘胸蛙脾臟、心外膜等多個(gè)組織器官的病理損傷，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙而死亡。該病原對(duì)許多抗生素呈現(xiàn)出耐藥性，尤其對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素廣泛耐藥，此次疫病可結(jié)合氟苯尼考、恩諾沙星等藥物進(jìn)行治療。