張 凱，王偉瑜，趙麗悅，熊洛梅，梅葉涵，黃可欣，劉芳玲，于 瑾，鄭善堅(jiān)

( 1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004； 2.浙江省野生動物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004； 3.龍游縣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，浙江 衢州 324000 )

魚類作為一種水生生物，其正常生命活動均需要水的參與，溫度與氧氣作為水體的重要監(jiān)測指標(biāo)，直接影響魚類生存、生長和繁殖，因此具有重要的研究意義。溫度的高低決定著魚體內(nèi)各種酶的活性，對魚類的新陳代謝起著決定性的作用，在適宜的溫度范圍內(nèi)，魚類的代謝水平與溫度正相關(guān)；當(dāng)溫度超出適宜范圍，會影響其體內(nèi)代謝水平和抗氧化水平，進(jìn)而減弱魚體清除自由基的能力，造成魚類機(jī)體損傷[1-2]。同時(shí)，大量研究表明，低氧環(huán)境也嚴(yán)重抑制魚類基礎(chǔ)生理代謝，導(dǎo)致魚類生長緩慢，機(jī)體免疫力下降，造成魚類死亡[3-4]。

馬口魚(Opsariichthysbidens)屬鯉形目鯉科馬口魚屬[5-6]，是亞洲分布較廣的小型鯉科魚類之一[7]，該魚在中國長江、黃河等各流域中均廣泛分布，在越南、朝鮮半島的河流中也有發(fā)現(xiàn)。馬口魚喜歡棲息于山間溪流中，尤其是水流較急的淺灘。由于馬口魚生性兇猛，以小魚、昆蟲為食，曾威脅淡水漁業(yè)資源，但隨著水環(huán)境的污染，加之人為的過度捕撈，其自然資源數(shù)量也急劇減少。迄今為止，為保護(hù)這一魚類資源，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了馬口魚生物學(xué)特征[5]、遺傳特征[6]、人工馴化和培育[8-15]等相關(guān)研究，為馬口魚人工繁育技術(shù)的發(fā)展和完善提供了大量理論基礎(chǔ)。目前，很多研究集中在馬口魚遺傳育種、胚胎發(fā)育和組織結(jié)構(gòu)等方面，而對幼魚期的基礎(chǔ)生理研究較少。為此，筆者探討不同溫度和溶解氧水平對不同規(guī)格馬口魚幼魚耗氧率、窒息點(diǎn)和抗氧化指標(biāo)的影響，以期為馬口魚的幼魚期養(yǎng)殖生產(chǎn)管理提供更完善的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用馬口魚幼魚(1000尾)由浙江漁老大農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，試驗(yàn)前暫養(yǎng)于100 L的養(yǎng)殖桶中，水溫(24±1) ℃，每日8：00、18：00各投喂1次飼料(粗蛋白40%)，暫養(yǎng)期間，每日換水1次，日換水量為50%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耗氧率、窒息點(diǎn)的測定

本試驗(yàn)采用靜水呼吸室法，在5 L呼吸瓶(圖1)中進(jìn)行，試驗(yàn)用水為經(jīng)曝氣12 h[溶解氧質(zhì)量濃度(8.61±0.50) mg/L]的自來水。試驗(yàn)前1 d停止投喂，使幼魚腸胃完全排空。將馬口魚幼魚根據(jù)體質(zhì)量分為(4.91±0.55) g和(1.22±0.31) g 2種規(guī)格，每個(gè)呼吸瓶放入10尾馬口魚幼魚，設(shè)20、24、28 ℃ 3個(gè)溫度梯度，每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)平行組和1個(gè)空白對照組。馬口魚幼魚放入呼吸瓶后，置于控溫水槽中逐步調(diào)溫至試驗(yàn)溫度后適應(yīng)2 h，隨后用液體石蠟密封。

圖1 試驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)

分別在試驗(yàn)前和試驗(yàn)開始后2 h采用虹吸法取各呼吸室上、中、下層水樣于溶解氧瓶中，固定后測定其溶解氧質(zhì)量濃度，并求平均值。以計(jì)算不同溫度下2種規(guī)格馬口魚幼魚的耗氧率。測量馬口魚幼魚窒息點(diǎn)(試驗(yàn)魚半數(shù)死亡)時(shí)的溶解氧質(zhì)量濃度[16-17]，認(rèn)定死亡的標(biāo)準(zhǔn)為幼魚靜臥瓶底，鰓蓋停止運(yùn)動[18]。溶解氧質(zhì)量濃度測定采用碘量法(GB 17378.4—2007)。耗氧率的計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[22,28]的方法：

ρ=c×V1×8×1000÷V2

式中，c為Na2SO4標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(mol/L)，8為1/2氧的摩爾質(zhì)量(g/mol)，V1為消耗的Na2SO4標(biāo)準(zhǔn)液的量(mL)，V2為滴定時(shí)吸取的水樣體積(mL)，ROC為耗氧率[mg/(g·h)]，ρ1、ρ2分別為初、末溶解氧質(zhì)量濃度(mg/L)，m為試驗(yàn)時(shí)魚的質(zhì)量(g)，t為試驗(yàn)進(jìn)行的時(shí)間(h)。

1.2.2 抗氧化指標(biāo)的測定

分別于試驗(yàn)開始前[溶解氧質(zhì)量濃度(8.61±0.50) mg/L]和低氧狀態(tài)[溶解氧質(zhì)量濃度(2.31±0.41) mg/L]時(shí)，在各呼吸瓶中隨機(jī)選取3尾幼魚進(jìn)行麻醉和解剖，取其肝臟用于抗氧化指標(biāo)的測定。本試驗(yàn)所測抗氧化指標(biāo)包括總抗氧化能力、超氧化物歧化酶和丙二醛。所用試劑盒為南京建成生物工程研究所的試劑盒。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 26和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過單因素方差分析檢驗(yàn)不同溫度和規(guī)格對馬口魚幼魚耗氧率、窒息點(diǎn)及抗氧化指標(biāo)影響的顯著性，組間差異的顯著性采用LSD多重比較檢驗(yàn)，顯著水平為0.05，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 馬口魚幼魚的耗氧率

試驗(yàn)結(jié)果表明：在20、24、28 ℃ 3個(gè)溫度梯度下(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的耗氧率隨溫度的升高而升高，20 ℃時(shí)低至(0.185±0.057) mg/(g·h)，顯著低于24 ℃和28 ℃時(shí)的耗氧率(P<0.05)，但24 ℃和28 ℃時(shí)的耗氧率差異不顯著(P<0.05)；而(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的耗氧率隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢，24 ℃時(shí)的耗氧率(0.550±0.022) mg/(g·h)顯著高于20、28 ℃溫度下的耗氧率(P<0.05)，且20、28 ℃時(shí)的耗氧率也存在顯著差異(P<0.05)；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，除28 ℃下，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚耗氧率顯著高于(1.22±0.31) g幼魚(P>0.05)(表1)。將2種規(guī)格馬口魚幼魚與本試驗(yàn)室測定馬口魚成魚耗氧率(未發(fā)表)相比發(fā)現(xiàn)(圖2)，成魚耗氧率顯著低于幼魚耗氧率(P<0.05)。

表1 不同溫度下2種規(guī)格馬口魚幼魚的耗氧率及窒息點(diǎn)

圖2 不同溫度下3種規(guī)格馬口魚的耗氧率

2.2 馬口魚幼魚窒息點(diǎn)及行為狀態(tài)

隨著溶解氧質(zhì)量濃度的降低，幼魚呼吸頻率明顯有加快的趨勢，運(yùn)動頻率逐漸降低，聚集在呼吸瓶底。隨著溶解氧質(zhì)量濃度的進(jìn)一步下降，幼魚開始出現(xiàn)浮頭狀態(tài)，呼吸頻率進(jìn)一步加快，部分幼魚失去平衡，沉入瓶底，隨后又快速游至水面。當(dāng)呼吸瓶中溶解氧質(zhì)量濃度達(dá)到窒息點(diǎn)時(shí)，幼魚靜臥瓶底，無呼吸，鰓和嘴張開，且部分鰓發(fā)紫，胸鰭向外伸展。測定其窒息點(diǎn)時(shí)的溶解氧質(zhì)量濃度發(fā)現(xiàn)：(4.91±0.55) g馬口魚幼魚在24和28 ℃時(shí)的窒息點(diǎn)差異不顯著(P>0.05)，20 ℃的窒息點(diǎn)[(1.125±0.009) mg/L]顯著低于24和28 ℃的(P<0.05)；(1.22±0.31) g馬口魚幼魚在20、24、28 ℃水溫條件下的窒息點(diǎn)存在顯著差異(P<0.05)，表現(xiàn)為24 ℃>28 ℃>20 ℃；2種規(guī)格馬口魚幼魚的窒息點(diǎn)在20 ℃和24 ℃下差異不顯著(P>0.05)，28 ℃時(shí)(4.91±0.55) g幼魚窒息點(diǎn)顯著高于(1.22±0.31) g幼魚(P<0.05)(表1)。在24 ℃下，將(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的耗氧率與北方須鰍(Barbatulabarbatulanuda)、赤眼鱒(Squaliobarbuscurriculus)、刀鱭(Coilianasus)和中華胭脂魚(Chinesesucker)進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)馬口魚耗氧率高于相近體質(zhì)量的北方須鰍、赤眼鱒和中華胭脂魚，但窒息點(diǎn)顯著低于刀鱭這類對低氧耐受能力差的經(jīng)濟(jì)魚類(表2)。

表2 幾種魚類幼魚窒息點(diǎn)的比較

2.3 低氧對馬口魚幼魚的抗氧化影響

通過測定不同溫度下馬口魚幼魚在正常溶解氧[(8.61±0.50) mg/L]和低溶解氧[(2.31±0.41) mg/L]狀態(tài)下肝臟的抗氧化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，無論在正常溶解氧狀態(tài)還是低溶解氧狀態(tài)，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚在20、24、28 ℃時(shí)的超氧化物歧化酶活性隨著溫度的升高而升高，20 ℃時(shí)的超氧化物歧化酶活性均顯著低于24、28 ℃時(shí)(P<0.05)，24、28 ℃時(shí)(4.91±0.55) g幼魚的超氧化物歧化酶活性雖有上升趨勢，但差異不顯著(P>0.05)(表3、表4)。20 ℃時(shí)(1.22±0.31) g幼魚的超氧化物歧化酶活性同樣顯著低于24、28 ℃時(shí)(P<0.05)，24、28 ℃時(shí)(1.22±0.31) g幼魚的超氧化物歧化酶活性無顯著差異(P>0.05)。

正常溶解氧下，馬口魚幼魚20 ℃和24 ℃時(shí)丙二醛含量無顯著差異，但28 ℃時(shí)(1.22±0.31) g幼魚丙二醛含量顯著高于(4.91±0.55) g幼魚；低氧狀態(tài)下，除28 ℃下的(1.22±0.31) g幼魚，其他幼魚丙二醛含量高于正常溶解氧下的含量。

低氧狀態(tài)下，2種規(guī)格馬口魚幼魚在20 ℃時(shí)的總抗氧化能力無顯著性差異(P>0.05)，在24、28 ℃時(shí)，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的總抗氧化能力約為(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的2倍(表3、表4)。將低氧和正常溶解氧狀態(tài)下的總抗氧化能力對比發(fā)現(xiàn)，低氧狀態(tài)下總抗氧化能力顯著高于正常溶解氧(P<0.05)；比較2種規(guī)格幼魚的總抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，(4.91±0.55) g幼魚顯著高于(1.22±0.31) g幼魚(P<0.05)。

表3 正常溶解氧[(8.61±0.50) mg/L]環(huán)境下2種規(guī)格馬口魚幼魚的抗氧化指標(biāo)

表4 低氧[(2.31±0.41) mg/L]環(huán)境下2種規(guī)格馬口魚幼魚的抗氧化指標(biāo)

3 討 論

3.1 水溫對不同規(guī)格馬口魚耗氧率的影響

溫度是影響魚類呼吸代謝的主要因素之一[18-24]。在20 ℃和24 ℃溫度下，馬口魚幼魚的耗氧率隨溫度升高而顯著升高，當(dāng)溫度達(dá)到28 ℃時(shí)，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚耗氧率顯著降低，而(1.22±0.31) g馬口魚耗氧率有升高的趨勢，但差異不顯著。這說明高溫對馬口魚的呼吸代謝有一定的抑制效果，與段嬌陽等[25-27]的研究結(jié)果基本一致。魚類是一種變溫動物，體溫隨水溫的變化而變化，水溫的升高提高了魚體內(nèi)的酶活性，使其代謝旺盛，耗氧率也隨之增加；但當(dāng)水溫超出適宜范圍時(shí)，其新陳代謝被抑制，耗氧率也隨之降低[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，相同溫度下不同規(guī)格的馬口魚幼魚耗氧率也存在顯著差異，在20 ℃和24 ℃溫度下，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚耗氧率顯著高于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚，與何亞等[28-30]的研究結(jié)果存在一定差異。在已有的研究中，普遍認(rèn)為魚的耗氧率隨體質(zhì)量的增加而降低，主要是因?yàn)橛佐~生長迅速，基礎(chǔ)代謝高，需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)來維持自身的能量消耗，相比于成魚，幼魚臟體比例更高，耗氧率高，隨著幼魚生長，其基礎(chǔ)代謝降低，臟體比例逐漸減小，耗氧率也隨之降低，因此，幼魚的耗氧率相對較高[31]。經(jīng)與本實(shí)驗(yàn)室測定的馬口魚成魚耗氧率相比發(fā)現(xiàn)，成魚耗氧率顯著小于幼魚耗氧率，但本試驗(yàn)中(4.91±0.55) g幼魚耗氧率高于(1.22±0.31) g幼魚，這可能與其生長代謝水平有關(guān)。本試驗(yàn)所用2種規(guī)格的馬口魚為同一批次人工繁育的幼魚，是在人工飼養(yǎng)期間出現(xiàn)的大小分化，其表現(xiàn)出的對耗氧率的差異可能與其性別差異有關(guān)。唐英[32]在對馬口魚的研究中發(fā)現(xiàn)，同規(guī)格馬口魚雄性的生長速度高于雌性。馬口魚是典型的雌、雄異形魚類，其成魚階段雄魚與雌魚體型存在顯著差異[13,33]，但幼魚期雌、雄個(gè)體在外部形態(tài)上差異小，性染色體分化程度較低，且性別分化也易受環(huán)境影響，導(dǎo)致性表型與遺傳基礎(chǔ)不一致的現(xiàn)象[34]，因此對馬口魚幼魚期雌雄性別分化和生長性能之間的關(guān)系的研究造成了一定的阻力。同一批幼魚在相同的養(yǎng)殖環(huán)境下出現(xiàn)不同的規(guī)格，表明其生長性能有一定的差異，進(jìn)而表現(xiàn)出幼魚耗氧率的差異。

3.2 水溫對不同規(guī)格馬口魚窒息點(diǎn)的影響

魚類窒息點(diǎn)是反映其代謝水平的重要依據(jù)[35]。窒息點(diǎn)反映了魚類對低氧環(huán)境的耐受能力，尤其是在水產(chǎn)養(yǎng)殖、運(yùn)輸操作過程中具有重要的指導(dǎo)意義[36]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的窒息點(diǎn)隨溫度的升高而升高，這與徐林通等[27,29,37-38]在其他經(jīng)濟(jì)魚類的研究中的結(jié)果相似，而(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的窒息點(diǎn)有隨溫度升高而升高的趨勢，但28 ℃時(shí)出現(xiàn)了下降。在20 ℃時(shí)，2種規(guī)格的馬口魚幼魚的窒息點(diǎn)較低，表明馬口魚幼魚在低溫的情況下對低氧的耐受能力強(qiáng)。(4.91±0.55) g馬口魚幼魚在24 ℃和28 ℃條件下，其窒息點(diǎn)無顯著差異，而(1.22±0.31) g馬口魚幼魚在28 ℃下窒息點(diǎn)顯著降低，說明28 ℃對于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的呼吸代謝有顯著抑制效果，由此可見，(4.91±0.55) g馬口魚幼魚對于高溫的耐受能力高于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚。由于本試驗(yàn)溫度梯度設(shè)置范圍較大且只有3個(gè)梯度，因此具體低溫耐受范圍還需進(jìn)一步探究。馬口魚是一種溪流型經(jīng)濟(jì)魚類，棲息在流動性較大和清澈的水域中，對水質(zhì)的要求較其他魚類幼魚要高，因此在養(yǎng)殖過程中應(yīng)充分做好溶解氧管理，以避免幼魚期因缺氧導(dǎo)致死亡率劇增。

3.3 低氧脅迫下不同水溫對馬口魚抗氧化指標(biāo)的影響

魚類抗氧化指標(biāo)與溫度之間具有相關(guān)性，因此被廣泛用于評價(jià)魚類新陳代謝的能力和生理健康程度[43-44]。活性氧是調(diào)控魚類正常生命活動的重要因素，在正常的情況下會保持動態(tài)平衡，但在環(huán)境因子(溫度、溶解氧質(zhì)量濃度等)的脅迫下，魚體內(nèi)的活性氧平衡被打破，對魚體造成氧化壓力[45]。在低氧環(huán)境下，魚體內(nèi)的黃嘌呤脫氫酶可轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，線粒體電子傳遞鏈載體失活，導(dǎo)致活性氧含量增加[46-47]。為應(yīng)對活性氧的失調(diào)，魚類形成了抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等一系列抗氧化酶。丙二醛是脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物，其含量可間接反映機(jī)體的活性氧自由基和脂質(zhì)的過氧化水平，從而間接反映出細(xì)胞受損傷的程度，該指標(biāo)多用于水生態(tài)毒理學(xué)的研究[48-49]。總抗氧化能力是近年研究發(fā)現(xiàn)的用于衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，代表和反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)對外來刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)[45]。在低氧環(huán)境下[溶解氧質(zhì)量濃度(2.31±0.41) mg/L]，馬口魚幼魚的超氧化物歧化酶活性隨溫度的升高而升高，但在28 ℃時(shí)，(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的超氧化物歧化酶活性有降低的趨勢，表明高溫對(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的抗氧化能力有一定的抑制效果，且(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的超氧化物歧化酶活性顯著高于(1.22±0.31) g的馬口魚幼魚，表明(4.91±0.55) g馬口魚幼魚的抗氧化能力強(qiáng)于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚；與正常溶解氧[(8.61±0.50) mg/L]相比，低氧環(huán)境下馬口魚的超氧化物歧化酶活性明顯較高，表現(xiàn)出了馬口魚機(jī)體對于低氧環(huán)境的適應(yīng)。在低氧狀態(tài)20 ℃下，(1.22±0.31) g馬口魚幼魚的丙二醛含量顯著高于(4.91±0.55) g馬口魚幼魚，表明其在低氧脅迫下，(1.22±0.31) g馬口魚幼魚更容易受到低氧環(huán)境的損傷；低氧情況下幼魚的丙二醛含量顯著高于正常溶解氧水平下的含量，表現(xiàn)出在低氧環(huán)境下，幼魚更易受到損傷。在20 ℃和28 ℃低氧環(huán)境下(4.91±0.55) g馬口魚幼魚總抗氧化能力和正常溶解氧環(huán)境的總抗氧化能力無顯著差異；而24 ℃時(shí)，低氧環(huán)境下的(4.91±0.55) g馬口魚幼魚總抗氧化能力顯著高于正常溶解氧，此時(shí)，低氧下的(4.91±0.55) g馬口魚幼魚抗氧化能力更強(qiáng)，對環(huán)境的耐受能力也更強(qiáng)。將2種規(guī)格幼魚的總抗氧化能力進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)(4.91±0.55) g馬口魚幼魚總抗氧化能力高于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚，說明(4.91±0.55) g馬口魚幼魚抗氧化系統(tǒng)強(qiáng)于(1.22±0.31) g馬口魚幼魚。

4 結(jié) 論

與其他魚類相似，馬口魚幼魚的耗氧率和窒息點(diǎn)隨溫度升高呈先升后降趨勢，不同的是馬口魚窒息點(diǎn)較高，且在低氧和溫度脅迫下易受到損傷。因此，養(yǎng)殖過程中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注養(yǎng)殖環(huán)境的適宜性，以期在較高的存活率下，創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。