代金彩，李 麗,2，李學(xué)濤，魏 杰，聶竹蘭

( 1.塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，塔里木珍稀魚類研究中心，新疆 阿拉爾 843300； 2.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300 )

寬口裂腹魚(Schizothoraxeurystomus)屬裂腹魚屬，又名寬口臀鱗魚[1-2]，與其他裂腹魚比較其顯著特征為下顎有角質(zhì)，主要分布于新疆阿克蘇河、木扎提河、克孜爾河、渭干河、葉爾羌河[3]。因人為活動(dòng)干擾、環(huán)境變化、其自身繁殖力低下等影響，寬口裂腹魚的數(shù)量急劇減少。新疆維吾爾自治區(qū)擬將其列為保護(hù)魚類[4]。目前，寬口裂腹魚的研究主要集中在其種群生態(tài)學(xué)[5]、形態(tài)學(xué)[6]、生物學(xué)[7]等方面，還有少量關(guān)于其RNA及線粒體基因的研究[8]，但關(guān)于其細(xì)胞培養(yǎng)系建立的研究尚未見報(bào)道。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是體外人工模擬體內(nèi)環(huán)境，細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞的技術(shù)。1962年建立了世界上第一株魚類細(xì)胞系——虹鱒(Oncorhynchusmykiss)性腺細(xì)胞系RTG-2[9]。1981年建立了我國第一個(gè)魚類細(xì)胞系——草魚(Ctenopharyngodonidellus)吻端組織細(xì)胞系[10]。目前，我國建立的魚類細(xì)胞系已超過70種，以淡水魚類細(xì)胞系為主[11]。魚類細(xì)胞系建立后可應(yīng)用于病毒學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)等領(lǐng)域[12-13]。鰭條組織本身具有很強(qiáng)的再生能力，細(xì)胞遷出成功率高，同時(shí)取鰭條組織時(shí)無需將魚處死，因此有很多魚類細(xì)胞系建立都是來源于鰭條組織，如紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)鰭細(xì)胞系[14]、石鰈(Kareiusbicoloratus)鰭細(xì)胞系[15]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)鰭條細(xì)胞系[16]、綠腹麗魚(Etroplussuratensis)尾鰭細(xì)胞系[17]。

水體中鹽堿度水平對(duì)魚類的存活有顯著的影響，鹽堿度過高或過低均會(huì)使魚類的存活率顯著降低[18-19]。在鹽度為20時(shí)，尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)僅少數(shù)個(gè)體能存活至96 h，堿度為12 g/L(以NaHCO3計(jì))時(shí)，96 h全部死亡[20]；鹽度為5.0～22.1時(shí)，小黃魚(Larimichthyspolyactis)10 d內(nèi)存活率極高，隨著鹽度降低或者升高，小黃魚的存活率持續(xù)下降[21]。

筆者擬建立塔里木裂腹魚尾鰭組織細(xì)胞系，測(cè)定以NaCl模擬的鹽度和NaHCO3模擬的堿度對(duì)其相對(duì)增殖率的影響，以期為保護(hù)其種質(zhì)資源及探究其耐鹽堿機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

2019年9月在克孜勒河采捕野生寬口裂腹魚，飼養(yǎng)于新疆建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，取健康寬口裂腹魚，體質(zhì)量92.88 g、全長(zhǎng)18.54 cm。

1.2 試驗(yàn)試劑

DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640、M199培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司；磷酸鹽緩沖液、青霉素-鏈霉素雙抗、二甲基亞砜購自Solarbio公司；臺(tái)盼藍(lán)和0.25%胰酶購自Biotopped公司；麻醉劑(MS-222)購自漁夫?qū)毠?；基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

取寬口裂腹魚，注入0.1 μL/g的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽進(jìn)行麻醉。剪取上尾鰭，用75%乙醇清洗。取4個(gè)培養(yǎng)皿，其中1個(gè)培養(yǎng)皿中加75%乙醇，另3個(gè)培養(yǎng)皿均加入含有500 IU/mL的青霉素和500 μg/mL的鏈霉素的磷酸鹽緩沖液。剪取尾鰭鰭末端組織，放入75%的乙醇浸泡30 s后，依次放入另外3個(gè)培養(yǎng)皿中浸泡1 min。經(jīng)處理的尾鰭組織放入2 mL無菌離心管中，用無菌眼科剪刀剪至1～2 mm3的組織碎塊。在已剪好的組織碎塊中加入0.25%胰酶溶液消化組織2 h，收集消化的組織離心，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次。將消化的組織移入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入25 ℃的CO2培養(yǎng)箱中，觀察貼壁情況，過4 h后反相放置。6 h后，加入1 mL含20%胎牛血清、500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素的DME/F12培養(yǎng)液，正相放入25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每日觀察組織生長(zhǎng)的情況。2～3 d更換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)106個(gè)/mL時(shí)按照1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。第5代后，將培養(yǎng)液中的鏈霉素質(zhì)量濃度、青霉素含量和胎牛血清體積分?jǐn)?shù)分別調(diào)整為200 μg/mL、200 IU/mL和15%，第8代后，培養(yǎng)液換為含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DME/F12培養(yǎng)液。

1.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

將一定密度的第10代細(xì)胞接種在24孔板上，分成8組，每組6孔，接種一定密度的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)7 d的常規(guī)培養(yǎng)，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每日記為1組，分析數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的縱坐標(biāo)為每日計(jì)數(shù)的細(xì)胞平均數(shù)量，橫坐標(biāo)為時(shí)間。根據(jù)下式計(jì)算出細(xì)胞的群體倍增時(shí)間[22]：

T=t×lg 2/lg (nt/n0)

式中，T為群體倍增時(shí)間，nt為細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間t后的細(xì)胞數(shù)，n0為接種細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 細(xì)胞最佳生長(zhǎng)條件的選擇

用傳至第6代的細(xì)胞。使用4種培養(yǎng)基DME/F12、L-15、MEM和RPMI-1640。設(shè)置20、25、30、37 ℃ 4個(gè)溫度梯度。設(shè)置0、10%、20%、25% 4個(gè)胎牛血清體積分?jǐn)?shù)。分別在不同條件下培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并繪制不同條件下細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

凍存：配制含20%磷酸鹽緩沖液、70% DME/F12和10%二甲基亞砜的細(xì)胞凍存液，置于4 ℃冰箱中進(jìn)行預(yù)冷以備用。取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞，經(jīng)離心去掉上清液，加入磷酸鹽緩沖液再次重懸，再次離心去掉上清液，重復(fù)操作3次。取沉淀并加入細(xì)胞凍存液，重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至2.0×106個(gè)/mL，并轉(zhuǎn)至凍存管中。

復(fù)蘇：取凍存40、90和180 d的第6代細(xì)胞，于25 ℃水浴鍋快速解凍，操作臺(tái)內(nèi)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，逐滴加入5倍體積的預(yù)冷培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞，離心棄上清液，加入磷酸鹽緩沖液重懸，再次離心棄上清液，重復(fù)3次。取適量細(xì)胞采用臺(tái)盼藍(lán)染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率；加入10 mL培養(yǎng)液，置于25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞復(fù)蘇36 h后需首次換液。

1.3.5 細(xì)胞污染與檢測(cè)鑒定

選用觀察法與PCR法檢測(cè)細(xì)胞是否被細(xì)菌、真菌、支原體污染。所用引物見表1。細(xì)菌、真菌的DNA模板為環(huán)境中細(xì)菌、真菌培養(yǎng)樣品提取所得，作為陽性對(duì)照組，支原體DNA模板為新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。PCR擴(kuò)增細(xì)菌DNA，25.0 μL反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各1.0 μL，5.0 μL模板DNA，5.5 μL的滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次。PCR擴(kuò)增真菌DNA，25.0 μL反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各1.0 μL，5.0 μL模板DNA，5.5 μL的滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次。PCR擴(kuò)增支原體DNA，25.0 μL反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各1.0 μL，2.0 μL模板DNA，8.5 μL的滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取8.0 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1 通用引物序列

1.3.6 細(xì)胞來源鑒定

用基因組DNA試劑盒提取寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞DNA。根據(jù)寬口裂腹魚線粒體16S rRNA設(shè)計(jì)引物(表2)。通過PCR擴(kuò)增，50.0 μL反應(yīng)體系：25.0 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各2.5 μL，5.0 μL模板DNA，15.0 μL的滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，48.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物測(cè)序，比較并獲得與GenBank中已發(fā)表序列的一致率。

表2 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列引物

1.3.7 鹽堿度對(duì)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率的影響

以NaCl模擬鹽度環(huán)境，設(shè)置NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)1‰、2‰、4‰、6‰、8‰和10‰ 6個(gè)梯度。稱取NaCl溶質(zhì)加入DME/F12培養(yǎng)液溶解，溶解后溶液再用0.22 μm過濾篩過濾。

以NaHCO3模擬堿度環(huán)境，設(shè)置NaHCO3質(zhì)量濃度2、3、4、5、6、7、8、10 g/L 8個(gè)梯度。稱取NaHCO3溶質(zhì)加入DME/F12培養(yǎng)液溶解，溶解后溶液再用0.22 μm過濾篩過濾。

細(xì)胞鋪板：取第6代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清DME/F12培養(yǎng)液調(diào)整密度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，鋪置于96孔培養(yǎng)板上，每種材料鋪6孔。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后。按分組分別加入不同含量鹽堿試劑，每孔20 μL，空白對(duì)照組不加試驗(yàn)試劑為0，其他條件同試驗(yàn)組。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。之后將每個(gè)含液體孔加入噻唑藍(lán)20 μL后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸出各孔內(nèi)液體后每孔加入150 μL二甲基亞砜。搖床搖培養(yǎng)板20 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定各孔光密度值[D(490 nm)]。細(xì)胞相對(duì)增殖率(R，%)的計(jì)算公式如下：

R=D(490 nm)試驗(yàn)組/D(490 nm)對(duì)照組×100%

1.4 數(shù)據(jù)分析

SPSS 20軟件包對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

每天觀察細(xì)胞瓶，第3天后，寬口裂腹魚的尾鰭組織塊周圍開始遷出細(xì)胞，由組織塊向周圍溢出；第6、12天細(xì)胞繼續(xù)遷出；第16天，細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度約為106個(gè)/mL時(shí)按照1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，生長(zhǎng)速度較快(圖1)。

圖1 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞原代培養(yǎng)

2.2 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

繪制寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖2)。接種一定數(shù)量的細(xì)胞，在最適條件下生長(zhǎng)，在1～4 d時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)的速度較快，5～6 d時(shí)生長(zhǎng)速度放緩趨于平穩(wěn)，之后細(xì)胞數(shù)量下降。經(jīng)計(jì)算，細(xì)胞群體倍增的時(shí)間為24.94 h。

圖2 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞最佳生長(zhǎng)條件

寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞在L-15、MEM、RPMI-1640和DME/F12培養(yǎng)基中同條件培養(yǎng)96 h。當(dāng)培養(yǎng)基是MEM、RPMI-1640時(shí)，寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞基本不生長(zhǎng)；在L-15培養(yǎng)基中，細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)期延遲；DME/F12培養(yǎng)基生長(zhǎng)趨勢(shì)最好，最佳培養(yǎng)基為DME/F12。在溫度20、25、30 ℃下，細(xì)胞生長(zhǎng)均比較好，25 ℃生長(zhǎng)最好；當(dāng)溫度升至37 ℃時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯的低于20、25、30 ℃下的生長(zhǎng)狀態(tài)。 在體積分?jǐn)?shù)0%、10%、20%、25%胎牛血清中同條件培養(yǎng)，除在0%的血清中生長(zhǎng)較緩，在10%、20%和25%的血清中均生長(zhǎng)較好，20%中生長(zhǎng)最好(圖3)。

圖3 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞生長(zhǎng)的胎牛血清條件

2.4 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞凍存復(fù)蘇后，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率，重復(fù)10組取平均值。對(duì)第6代細(xì)胞液氮冷凍保存后，復(fù)蘇經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，180 d后復(fù)蘇存活率達(dá)(88.72±0.99)%(表3)，90 d和180 d存活率差異不顯著(P>0.05)。180 d后細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞具有活性，且復(fù)蘇后增殖速度快(圖4)，可正常傳代(圖5)。

表3 凍存后復(fù)蘇的存活率

圖4 噻唑藍(lán)法測(cè)定復(fù)蘇細(xì)胞增殖

圖5 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)

2.5 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞污染與檢測(cè)鑒定

寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞中提取細(xì)菌、真菌、支原體DNA，經(jīng)過PCR法鑒定細(xì)菌、真菌、支原體污染。1、3、6泳道分別為細(xì)菌、真菌、支原體PCR產(chǎn)物陽性對(duì)照，2、4、5泳道分別為尾鰭細(xì)胞中提取細(xì)菌、真菌、支原體的DNA進(jìn)行PCR的產(chǎn)物，樣品均無與陽性對(duì)照組一致的條帶，表明樣品中無細(xì)菌、真菌、支原體，寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞未被污染(圖6)。

圖6 細(xì)菌、真菌、支原體PCR鑒定結(jié)果

2.6 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞來源鑒定

基因組DNA試劑盒提取寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物目的條帶大小符合16S rRNA的大小(圖7)。經(jīng)測(cè)序后的序列片段與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。尾鰭細(xì)胞同源性與GenBank中發(fā)布的寬口裂腹魚線粒體基因(NC036933.1)的序列達(dá)到99.91%的一致率，在第1522位點(diǎn)有1個(gè)位置發(fā)生突變(圖8)。

圖7 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖8 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系測(cè)序序列和寬口裂腹魚16S rRNA序列(NC036933.1)比對(duì)分析

2.7 噻唑藍(lán)法檢測(cè)不同鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的細(xì)胞增殖情況

2.7.1 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞增殖的影響

在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)一致情況下，寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系的相對(duì)增殖率隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，由此可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系增殖的抑制可隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在同一時(shí)間點(diǎn)上，1‰、2‰、4‰、6‰、8‰ NaCl依次使寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率上升，8‰、10‰ NaCl依次使寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率下降，8‰ NaCl時(shí)相對(duì)增殖率最高，寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈先升后降的趨勢(shì)(表4)。

表4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系增殖的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.7.2 NaHCO3質(zhì)量濃度對(duì)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞增殖的影響

在NaHCO3質(zhì)量濃度一致情況下，寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系的相對(duì)增殖率隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，由此可知，NaHCO3質(zhì)量濃度對(duì)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系增殖的抑制可隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在同一時(shí)間點(diǎn)上， 2、3、4、5、6、7 g/L NaHCO3依次使寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系細(xì)胞相對(duì)增殖率上升，7、8、10 g/L NaHCO3依次使寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率下降，7 g/L NaHCO3時(shí)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率最高，寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系增殖隨NaHCO3質(zhì)量濃度增加呈先升后降趨勢(shì)(表5)。

表5 NaHCO3質(zhì)量濃度對(duì)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系增殖的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

3 討 論

3.1 寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系的建立

筆者以寬口裂腹魚尾鰭組織為材料，用組織塊移植法進(jìn)行了寬口裂腹魚尾鰭組織細(xì)胞原代培養(yǎng)，命名寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系。寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系在20%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好。細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)液有L-15、MEM、RPMI-1640和M199，但不同的魚類對(duì)環(huán)境要求不盡相同，因此，不同魚類的最適培養(yǎng)基亦不同。褐點(diǎn)石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)鰭細(xì)胞系[26]、真鯛(Pagrusmajor)細(xì)胞系[27]的最佳培養(yǎng)液為DMEM/F12。筆者選用DEM/F12、L-15、MEM和RPMI-1640培養(yǎng)液作為試驗(yàn)培養(yǎng)液，結(jié)果表明，DME/F12為最佳培養(yǎng)液。魚類組織細(xì)胞生長(zhǎng)溫度范圍與哺乳類組織細(xì)胞比較，適宜溫度范圍較廣。寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系在20～30 ℃細(xì)胞均能正常生長(zhǎng)，其中25 ℃為最適生長(zhǎng)溫度，與已報(bào)道真鯛和圓斑星鰈(Veraspervariegates)的細(xì)胞溫度適應(yīng)范圍一致[27-28]，這與魚類是變溫動(dòng)物有很大關(guān)系。在0%、10%、20%和25%的體積分?jǐn)?shù)胎牛血清培養(yǎng)基中同條件培養(yǎng)，在未加血清的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度顯著低于添加血清的培養(yǎng)基，在20%胎牛血清時(shí)生長(zhǎng)最快，胎牛血清體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的影響，與已報(bào)道的研究相似[29]。

寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系呈懸浮生長(zhǎng)。貼壁培養(yǎng)型的細(xì)胞，細(xì)胞膜表面含有大量黏附因子。這些黏附因子可激活不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)貼壁細(xì)胞的活性和增殖，如整合素活化黏著斑激酶激活信號(hào)通路抑制細(xì)胞內(nèi)源性的凋亡[30-31]。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般為淋巴細(xì)胞等血液系統(tǒng)來源的細(xì)胞，這種細(xì)胞體積小，缺乏黏附分子的表達(dá)[32-33]。用物理方法進(jìn)行貼壁型細(xì)胞的懸浮馴化時(shí)使細(xì)胞產(chǎn)生失巢凋亡[34]，無血清與生物反應(yīng)器馴化使貼壁細(xì)胞產(chǎn)生失巢凋亡的拮抗[34]。Ana等[35]用舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)腸細(xì)胞研究其失巢凋亡。猜測(cè)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)的狀態(tài)，可能與其體積和細(xì)胞膜表面黏附分子的表達(dá)及存在與類似于失巢凋亡的調(diào)節(jié)有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

細(xì)胞來源的鑒定通常采用16S rRNA、12S rRNA和Cyt b等基因片段，其中16S rRNA基因?qū)儆谶M(jìn)化緩慢的保守序列，因此筆者選擇16S rRNA基因進(jìn)行鑒定，序列分析結(jié)果與寬口裂腹魚基因序列一致性達(dá)99.91%，證明該細(xì)胞系來自于寬口裂腹魚。

3.2 鹽堿度對(duì)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞增殖的影響

水體中鹽堿度水平對(duì)魚類的存活有顯著的影響，鹽堿度過高或過低都會(huì)使魚類的存活率顯著的降低[18-19]。在尼羅羅非魚鹽堿度的耐受性研究中，鹽度為20時(shí)僅少數(shù)個(gè)體能存活到96 h，堿度為12 g/L(以NaHCO3計(jì))時(shí)，96 h全部死亡[20]；對(duì)小黃魚進(jìn)行鹽度脅迫試驗(yàn)時(shí)，鹽度為5.0～22.1時(shí)，小黃魚10 d內(nèi)存活率極高，隨著鹽度降低或者升高，小黃魚的存活率持續(xù)下降[21]。寬口裂腹魚是塔里木河水系的土著魚類，1958年博斯騰湖測(cè)定的pH為 8.1～8.4，礦化度為0.39 g/L，1981年博斯騰湖測(cè)定的pH為8.5～8.7，礦化度為180 g/L[36]，2013年塔里木河流域Cl-和Na+濃度明顯增大[37]，2021年塔里木河流域pH為7.58～8.32，Cl-/(Cl-+HCO3-)的平均比率為0.23，Na+/(Na++Ca2+)的平均比率為0.39[38]。鹽堿度無規(guī)律的變化是導(dǎo)致物種資源衰竭的原因之一，鹽堿度對(duì)塔里木河葉爾羌高原鰍(Triplophysayarkandensis)影響的結(jié)果顯示，其從原來的趨淡水性轉(zhuǎn)變?yōu)橼呄趟訹39]。本試驗(yàn)中，1‰、2‰、4‰、6‰、8‰ NaCl依次使寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率上升，8‰、10‰ NaCl依次使寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率下降，8‰ NaCl時(shí)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率最高； 2、3、4、5、6、7 g/L NaHCO3依次使寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率上升，7、8、10 g/L NaHCO3依次使寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率下降，7 g/L NaHCO3時(shí)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率最高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽堿度過高或過低均會(huì)導(dǎo)致寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞的存活率降低。

4 結(jié) 論

筆者初步建立寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系，尾鰭細(xì)胞傳至45代。呈懸浮生長(zhǎng)，最適培養(yǎng)液為DME/F12，最適胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為20%，最適溫度為25 ℃。在最適條件下，第10代寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系細(xì)胞系細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為24.94 h，細(xì)胞分裂旺盛，呈“S”型。第6代細(xì)胞液氮冷凍保存180 d后復(fù)蘇，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系有(88.72±0.99)%的細(xì)胞具有活性；復(fù)蘇后增殖速度快，可正常傳代。寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系第10代細(xì)胞線粒體16S rRNA序列分析結(jié)果與寬口裂腹魚基因序列一致性為99.91%，從分子水平證明該尾鰭細(xì)胞系來自寬口裂腹魚。寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率隨NaCl質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，8‰NaCl時(shí)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系細(xì)胞相對(duì)增殖率最高；寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率隨NaHCO3質(zhì)量濃度增加呈先升后降趨勢(shì)，7 g/L相對(duì)增殖率時(shí)寬口裂腹魚尾鰭細(xì)胞系相對(duì)增殖率最高。