張燕珍 梁超 鮑春齡 陳少萍

(1?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，海南 海口 570216；2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種退行性疾病，是由于膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡平衡失調(diào)所致，近年來KOA的發(fā)病率有上升趨勢〔1〕。在細(xì)胞凋亡的過程中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(P13K/Akt/mTOR)信號通路起著關(guān)鍵的作用〔2〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)能夠使得軟骨細(xì)胞外基質(zhì)被降解，使得軟骨細(xì)胞暴露在炎性物質(zhì)中，在KOA中MMPs存在高表達(dá)，軟骨細(xì)胞因此加速凋亡，軟骨進(jìn)而被破壞〔3〕。壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸療法是壯醫(yī)的特色醫(yī)技療法，已經(jīng)在多種疾病中有長期的實(shí)踐應(yīng)用〔4〕。本實(shí)驗(yàn)探討PI3K/Akt/mTOR信號通路對MMP-13的調(diào)節(jié)及其進(jìn)一步影響KOA模型大鼠壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸的治療作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 SD大鼠60只，雌雄各一半，體重140～160 g。按5只/籠進(jìn)行群養(yǎng)，屏障環(huán)境動物室，空氣流通，相對濕度60%，光照條件恒定，以基礎(chǔ)飼料常規(guī)喂養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)數(shù)字表法分為：對照組、模型組、藥線組，每組20只。整個實(shí)驗(yàn)過程遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》中的相關(guān)條款。

1.2主要試劑和儀器 木瓜蛋白酶、二喹啉甲酸均購自阿拉丁上海阿拉丁生化科技股份有限公司，壯醫(yī)藥線由廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥研究中心提供，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自美國云克隆公司武漢云克隆科技股份有限公司，MMP-13(貨號：MA5-14238)、PI3K(貨號：PA5-83748)、Akt(貨號：44-621G)、p-Akt(貨號：PA5-36780)和mTOR(貨號：PA5-34663)單克隆抗體及相應(yīng)二抗均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司、PI3K/Akt抑制劑(LY294002，貨號：L9908-1MG)購自美國Sigma公司。

1.3建立大鼠KOA模型 參照段文秀等〔5〕的方法制備KOA大鼠模型：選擇剃須刀剔除大鼠雙膝關(guān)節(jié)及其周邊鼠毛，消毒皮膚表面后，僅對模型組和藥線組注射0.2 ml木瓜蛋白酶至雙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)(第1,4,7天各1次)，對照組注射等量生理鹽水，利用KOA疲勞易發(fā)生的特點(diǎn)，迫使實(shí)驗(yàn)大鼠在動物試驗(yàn)跑臺每天至少跑動30 min，2 w后可得KOA大鼠模型。

1.4干預(yù)治療方法〔6〕(1)取穴方法：整體取穴：根據(jù)壯醫(yī)整體治療原則，每次取腎俞、脾俞、下關(guān)元、足三里(雙)、食背(雙)、趾背(雙)、勞宮、涌泉。局部取穴：根據(jù)壯醫(yī)“寒手熱背腫在梅，各疾施灸不離鄉(xiāng)”的原則，受累關(guān)節(jié)取梅花穴。(2)操作手法：采用2號藥線，點(diǎn)燃后甩動手腕，火焰熄滅，將呈珠狀炭火的線頭對準(zhǔn)應(yīng)灸部位或經(jīng)穴快速點(diǎn)灸，如雀啄食，一觸即起，此為一壯，一般一穴灸1～3壯。10 d為1個療程，休息3 d開始第2個療程，治療3個療程。

1.5取材 藥線組干預(yù)治療后，處死各組大鼠，手術(shù)切開膝關(guān)節(jié)腔，切取右側(cè)股骨內(nèi)側(cè)髁處厚度約2 mm關(guān)節(jié)軟骨，將取出的膝關(guān)節(jié)軟骨組織立即進(jìn)行4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片在-20℃冰箱保存；取炎癥關(guān)節(jié)軟骨組織，用于免疫蛋白印跡法檢測；剝?nèi)∮液笙リP(guān)節(jié)軟骨后分離軟骨細(xì)胞，在高糖DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清)中培養(yǎng)和細(xì)胞傳代，待細(xì)胞傳至第2代后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取關(guān)節(jié)腔內(nèi)提取關(guān)節(jié)液,并以2 000 r/min 離心10 min用于炎癥因子水平測定。

1.6大鼠膝骨關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)觀察 將組織切片室溫靜置15 min，分別經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色后，并在光學(xué)顯微鏡下對染色結(jié)果進(jìn)行拍照，觀察各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)變化情況。

1.7ELISA檢測軟骨中炎癥因子含量 所取炎癥關(guān)節(jié)軟骨組織加入磷酸鹽緩沖液(PBS)置于勻漿器中充分研磨，于4℃，2 000 r/min，離心30 min，收集上清液。依照ELISA試劑盒說明書對軟骨中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6進(jìn)行檢測。

1.8免疫蛋白印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 用液氮研磨所取炎癥關(guān)節(jié)軟骨組織，加入裂解液以提取組織的總蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白進(jìn)行定量。取30 μg待測樣本蛋白在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后把凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗后于4℃冰箱孵育過夜或于搖床上振搖2 h。其中一抗分別加入MMP-13、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和MMP-13(工作濃度1∶1 000)抗體。再用PBS漂洗3次后，加入相應(yīng)的二抗孵育2 h。洗膜后在暗室中X線曝光、顯影，利用Quality One對蛋白條帶灰度進(jìn)度分析，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算樣本蛋白相對表達(dá)量。

1.9細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.9.1軟骨細(xì)胞制備及干預(yù)分組 將僅注射生理鹽水大鼠的第二代軟骨細(xì)胞分為正常組，未進(jìn)行干預(yù)治療的KOA大鼠第二代軟骨細(xì)胞分為兩組：(1)實(shí)驗(yàn)組：僅予以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2)實(shí)驗(yàn)+LY組：培養(yǎng)基中加入50 μmol/L PI3K通路抑制劑LY294002溶液干預(yù)(配制方法：5 μmol LY294002溶于100 ml無菌生理鹽水中)。

1.9.2免疫蛋白印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 分別收集各組細(xì)胞用PBS洗3遍，棄上清。加3倍體積細(xì)胞裂解液于冰上裂解后再用超聲破碎細(xì)胞，離心后取上清，加入等體積上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行如1.8同樣操作。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料多組均值比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)變化 對照組軟骨細(xì)胞分布均勻，軟骨層平整，滑膜結(jié)構(gòu)完整；模型組軟骨細(xì)胞減少且排列雜亂，軟骨層不平整；藥線組關(guān)節(jié)軟骨邊緣不平整，軟骨細(xì)胞排列雜亂；藥線組軟骨細(xì)胞增生且分布不均，關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)則欠光滑。見圖1。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)變化(HE染色，×200)

2.2壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對膝骨關(guān)節(jié)炎癥因子的影響 3組關(guān)節(jié)軟骨組織中的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，對照組和藥線組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著降低(均P<0.05)，且與對照組比較，藥線組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響 3組關(guān)節(jié)軟骨組織的PI3K、p-Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，對照組和藥線組PI3K蛋白、p-Akt蛋白和mTOR蛋白相對表達(dá)量均顯著升高(均P<0.05)，且與對照組比較，藥線組PI3K、p-Akt和mTOR蛋白相對表達(dá)量均顯著降低(均P<0.05)。各組間AKT蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

2.4壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸對MMP的影響 3組關(guān)節(jié)軟骨組織的MMP-13蛋白表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，對照組和藥線組MMP-13蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低(均P<0.05)，且與對照組比較，藥線組MMP-13蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組MMP、PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá)

表1 各組關(guān)節(jié)軟骨組織中炎癥因子含量、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR蛋白及MMP-13蛋白表達(dá)水平的比較

2.5抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路對MMP蛋白的影響 3組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的PI3K、p-Akt、mTOR和MMP-13蛋白表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與正常組比較，實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)+LY組的PI3K、p-Akt和mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)，MMP-13蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)；且與實(shí)驗(yàn)組比較，實(shí)驗(yàn)+LY組PI3K、p-Akt和mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)，MMP-13蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和mmp-13蛋白表達(dá)水平的比較

圖3 PI3K/Akt/mTOR信號通路對MMP的調(diào)節(jié)

3 討 論

KOA是世界上較為常見的關(guān)節(jié)疾病，是指關(guān)節(jié)面軟骨發(fā)生病變及結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)活動功能障礙，臨床上有膝部酸痛、膝關(guān)節(jié)腫脹等癥狀〔7〕，同時有修復(fù)能力逐年降低、不可逆等特點(diǎn)〔8〕，且發(fā)病群體主要為中老年人，嚴(yán)重?fù)p害了中老年人的生活質(zhì)量。而目前KOA患者除接受耗費(fèi)人力財(cái)力的手術(shù)治療外，暫時沒有特別有效的治療方法，有關(guān)壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸針對KOA療法的研究報(bào)告還鮮有報(bào)告，暫時缺乏實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究和機(jī)制研究。

壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸法是傳統(tǒng)壯醫(yī)的療法之一，是壯族人民在長期臨床實(shí)踐中總結(jié)出來的獨(dú)具民族風(fēng)格的智慧結(jié)晶。陳攀〔9〕的研究稱，壯醫(yī)理論認(rèn)為：人的大病小病都不是憑空而來，是因?yàn)闅庋钠胶怅P(guān)系被打破而導(dǎo)致的，因此氣血是壯醫(yī)尤其關(guān)注的因素，在臨床上也是通過各種療法來調(diào)節(jié)氣血的平衡。壯醫(yī)認(rèn)為〔10〕，穴位是人體氣血進(jìn)出之處，也是邪毒出入之處，通過藥線點(diǎn)灸可以祛毒，進(jìn)而使氣血趨向平衡，從而使人身體健康。以往研究表明，壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸法對KOA有一定的療效〔11〕，KOA與PI3K/Akt/mTOR信號通路有一定聯(lián)系〔12〕。

此前有多項(xiàng)研究表明〔13～15〕，TNF-α、IL-1β、IL-6能夠作為KOA發(fā)展過程中的觀測指標(biāo)，判斷KOA的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸法在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)，對KOA模型大鼠有一定的治療作用。PI3K/Akt/mTOR信號通路被認(rèn)為在細(xì)胞發(fā)展過程中具有重要的作用，能夠調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡。mTOR作為PI3K和Akt的下游信號分子，當(dāng)PI3K被激活后，首先募集和激活A(yù)kt信號分子，Akt再使得mTOR活化。當(dāng)PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活后，會促進(jìn)細(xì)胞的增殖，這在KOA中表現(xiàn)為能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，抑制軟骨細(xì)胞的丟失和軟骨層的脫落，進(jìn)而起到治療KOA的效果。MMPs作為依賴Ca2+、Zn2+等金屬離子的一類蛋白家族，可降解除多糖外細(xì)胞外的所有基質(zhì)，這在關(guān)節(jié)軟骨中表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)被降解，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨層脫落。研究結(jié)果顯示〔16〕，在KOA中MMP-13可能是主要影響因子之一。本研究結(jié)果提示，PI3K/Akt/mTOR信號通路能夠通過下調(diào)上游信號分子PI3K最終抑制MMP-13蛋白的表達(dá)，這與此前高瑞林等〔17〕研究結(jié)果類似。本研究結(jié)果顯示在KOA中，PI3K/Akt/mTOR信號通路被抑制，MMP-13高表達(dá)會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡加速，進(jìn)而使得軟骨層脫落，炎癥加重。

綜上，壯醫(yī)藥線點(diǎn)灸法對于治療KOA有一定的效果，同時提示其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制MMP-13的表達(dá)有關(guān)，在一定程度上為KOA的臨床治療提供了理論參考。