趙士博 張藝馨 盧丹妮 何長歡 沈燁東 孫悅 林世科 譚冰 黃鎖義

(右江民族醫(yī)學(xué)院 1臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2全科醫(yī)學(xué)院；3國際交流與合作處；4科學(xué)實驗中心；5廣西高校右江流域特色民族藥研究重點實驗室)

高脂血癥是指體內(nèi)脂類物質(zhì)代謝紊亂或轉(zhuǎn)運(yùn)異常導(dǎo)致血脂濃度異常的一種疾病，是引發(fā)心血管疾病如高血壓、糖尿病、肥胖癥、脂肪肝等重大疾病的危險因素〔1〕。連翹為木犀科連翹屬植物，性微寒、味苦，具有清熱解毒、排膿散結(jié)、疏散風(fēng)熱等功效，主要用于治療溫?zé)?、斑疹、熱淋澀痛及風(fēng)熱感冒等癥〔2〕。連翹中含有揮發(fā)油類、苯乙醇苷類、木脂素類、有機(jī)酸類和萜類等化合物，揮發(fā)性成分是連翹發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。連翹揮發(fā)油包含有烯類、烷類、醇類、醛類、酯類等化合物〔3〕。連翹苷是木犀科植物連翹的干燥果實提取物〔4〕。趙詠梅等〔5〕對連翹苷的降血脂作用進(jìn)行了研究，證實連翹苷具有降低血脂的作用。野菊花為多年生草本植物野菊的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、清肝明目的功效，用于緩解破血疏肝、解療散毒、頭痛眩暈等癥狀〔6〕。化學(xué)成分研究表明野菊花富含萜類、烯炔類和黃酮類化學(xué)成分〔7〕。野菊花提取物具有降低血脂、抑制葡萄糖吸收降低血糖的功效。野菊花總黃酮能夠使小鼠血清中總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平明顯降低，降脂效果顯著〔8～10〕。本實驗探究連翹和野菊花配伍對高脂血癥小鼠降脂等指標(biāo)的影響及二者配伍是否具有協(xié)同作用，為臨床治療高脂血癥開拓思路并進(jìn)一步研究連翹和野菊花及其配伍的藥理作用提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器 全自動生化分析儀，日立7600-series；OLYMPUS BX51透反兩用研究系統(tǒng)顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司；Thermo ScientificTMHistoStarTM組織包埋機(jī)，賽默飛世爾科技中國有限公司；JMF-320G多級閃蒸器，河南智晶生物科技股份有限公司；5424R小型臺式高速冷凍離心機(jī)Eppendorf冷凍離心機(jī)；SHB-B88循環(huán)水式真空多用泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海上登實驗設(shè)備有限公司；JSC電子天平秤CN-BH；JY0127-91條形盒測力計，規(guī)格:10N。

1.2藥品與耗材 大、小鼠高脂飼料(長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(湘)2014-0011；連翹，云南鴻翔中藥科技有限公司，批號 20170601；野菊花(廣西貴港市綠之源種養(yǎng)發(fā)展有限公司中藥飲片廠，批號 170901)。

1.3實驗動物與分組 SPF級昆明種小鼠，雌雄比例1∶1，體重30～45 g。由廣西百色市右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK桂2012-0003。60只小鼠按雌雄比例1∶1隨機(jī)分配，每組12只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法用5%苦味酸標(biāo)記分為連翹組、野菊花組、配伍1∶1組、配伍1∶2組、配伍2∶1組。

1.4藥材鑒定 藥材連翹和野菊花經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心主任黃鎖義教授鑒定為木犀科連翹屬干燥果實和菊科植物野菊花Chrysanthemum indicum的干燥頭狀花序。

1.5藥液制備 將連翹稱重后均勻磨粉制備藥液。向連翹粉末中加入10倍體積乙醇，80℃水浴冷凝回流蒸發(fā)提取1 h，經(jīng)濾紙抽濾后收集濾出液，再加入10倍體積乙醇繼續(xù)提取，共提取3次，終末合并所有濾液，再次過濾后使用多級閃蒸儀蒸發(fā)濃縮，冷卻后加蒸餾水配制為終質(zhì)量濃度為1 g/kg。野菊花制備方法、最終濃度同連翹。配伍1∶1組是將配制好的連翹提取液和野菊花提取液按照體積比1∶1充分混合而成，配伍1∶2組與配伍2∶1組同配伍1∶1組。所有提取液配置完成后于4℃冰箱冷藏備用。

1.6造模及給藥 各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，進(jìn)行稱重。開始給予高脂飼料和清水進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)。為保證灌胃藥量的準(zhǔn)確性，實驗期間每3 d稱重1次。實驗中各組均按體重10 ml/kg給予中藥提取液，即劑量為10 g/kg(藥液質(zhì)量濃度為1 g/ml，相當(dāng)于1 ml藥液中含中藥量1 g，灌胃體積為10 ml/kg，劑量則為10 g/kg)，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d。所有動物實驗遵守動物實驗倫理要求。

1.7一般體征檢測 ①每天定時稱量每籠小鼠食物總質(zhì)量，除以每籠小鼠個數(shù)，得到24 h內(nèi)每只小鼠食量。②每3 d測定各組小鼠體重，記錄并統(tǒng)計每只小鼠體重變化情況。③采用彈簧測力計測定小鼠抓力，將小鼠置于鐵網(wǎng)上，待小鼠用力抓住鐵網(wǎng)時及時加力后拉，測到最大抓力，測定3次，取平均值。④血脂、血糖及腎功能生化指標(biāo)測定。于造模結(jié)束時對小鼠用斷尾法取血離心收集血清，并送至右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科進(jìn)行血清總膽固醇和血糖的測定。給藥結(jié)束時行眼球取血法取血，經(jīng)離心機(jī)4℃離心10 min，收集血清送至右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科進(jìn)行檢測，測定血清TC、TG、血糖(GLU)、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)含量。

1.8肝臟、腎臟組織病理切片觀察 造模結(jié)束后經(jīng)血脂血糖檢驗回報后，為進(jìn)一步確定肝臟與腎臟細(xì)胞損傷情況，隨機(jī)挑選10只造模成功的小鼠頸椎脫臼，開腹取小鼠肝臟及雙腎組織置于標(biāo)本固定液中固定24 h后送至右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科進(jìn)行切片制作并請病理科醫(yī)生進(jìn)行查看并給予病理診斷。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組食量 由圖1可知，各組食量在給藥后均有上升趨勢。與給藥前相比，配伍2∶1組食量變化幅度最大，配伍1∶2組較穩(wěn)定。與連翹組和野菊花組相比，自給藥起配伍2∶1組食量上升幅度最大。給藥第1周內(nèi)可見各組小鼠食量均有一定幅度的升高，說明連翹和野菊花及其配伍對高脂血癥小鼠食欲具有一定的改善功效。給藥1 w后各組食量均降低，經(jīng)分析可能是小鼠集體對藥物敏感度暫時性降低，后期各組食量均出現(xiàn)回升表明藥物起效改善小鼠食欲。

圖2、3同圖1 各組不同時間食量

2.2各組體重 給藥前各組體重均呈上升趨勢，給藥后均呈下降趨勢，證明各組藥物對小鼠體重增長均有抑制作用。與連翹組和野菊花相比，配伍1∶1組和配伍1∶2組給藥后體重繼續(xù)增長一段時間以后開始出現(xiàn)下降，配伍組小鼠體重下降幅度較大。配伍2∶1組對高血脂小鼠體重影響明顯。見圖2。

圖2 各組不同時間體重

2.3各組抓力 由圖3可知，隨造模時間的增長，各組小鼠抓力整體均呈上升趨勢。給藥后各組之間并未因給予藥物的不同而在抓力上產(chǎn)生明顯差異。

圖3 各組不同時間抓力

2.4對血生化及腎功能指標(biāo)的影響 給藥后各組血清TC和GLU均比給藥前均顯著下降(P<0.05)，配伍2∶1組降TC效果最好(P<0.05)，配伍1∶2組降GLU效果最好(P<0.05)。與連翹組和野菊花組相比，配伍組TG、LDL-C、UREA、BUN與CREA均顯著降低(P<0.05)，配伍2∶1組TG、HDL-C、LDL-C及VLDL-C與配伍1∶1組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。配伍1∶2組UREA、BUN與配伍1∶1組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組血生化及腎功能指標(biāo)比較

2.5肝臟和腎臟組織病理切片觀察結(jié)果 如圖4A所示，小鼠肝臟切片病理學(xué)形態(tài)顯示肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，存在大面積脂肪變性且不規(guī)則分布，多灶性肝細(xì)胞脂肪變性，肝小葉脂肪變性。肝細(xì)胞組織以彌漫性肝細(xì)胞水腫為主，散在性脂肪變分布，如圖4B 。高脂血癥小鼠腎臟以腎小管脂肪變性和腎小球損傷為主。圖4C中腎小球肥大，增生，系膜基質(zhì)增加且球囊有填充物，血管層偏肥大。圖4D腎小球球囊腔有纖維素性壞死。圖4E腎小管嚴(yán)重大量蛋白管型。原因可能為腎小球濾過過程中，原尿蛋白含量過高。圖4F小鼠出現(xiàn)血尿，球囊腔填充物有紅細(xì)胞。圖4G近曲小管上皮細(xì)胞有脂肪變性。圖4H上皮細(xì)胞高度水腫，脫落形成裸基底膜。圖4I腎小球質(zhì)地出現(xiàn)在球囊腔。除血漿蛋白外還有其他組織集聚。

圖4 小鼠肝臟和腎臟組織病理切片(HE染色)

3 討 論

高脂血癥是指患者血脂水平過高所引起的一系列嚴(yán)重危害人體健康的疾病〔11〕，已經(jīng)成為慢性疾病(糖尿病、心腦血管疾病和動脈粥樣硬化等)的常見并發(fā)癥〔12〕。臨床治療高脂血癥患者主要包括控制理想體重、進(jìn)行運(yùn)動鍛煉、戒煙、藥物和飲食治療及血漿凈化治療、外科治療等〔13〕。雖然高脂血癥在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究十分深入，但仍有低比例的患者接受強(qiáng)化降脂治療〔14〕，而中藥應(yīng)用于高脂血癥，不僅可以降低血脂，還可以起到預(yù)防高脂血癥的作用。連翹味苦，微寒，有清熱解毒的作用〔15〕。連翹屬植物在中國、日本和韓國作為中草藥已有數(shù)百年的歷史〔16〕，其用途十分廣泛。菊花是一種在中國使用了2 000多年的中草藥〔17〕。李波等〔18〕研究表明:野菊花中所含有的木犀草素和槲皮素具有改善高脂飲食致肥胖小鼠的糖脂代謝和脂肪肝病變、改善血管胰島素抵抗導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能紊亂的作用，故野菊花常用于降血脂和降血糖。

本研究結(jié)果提示兩種中藥在降低血清TC和葡萄糖方面具有協(xié)同作用。而連翹野菊花2∶1搭配降脂效果最佳，配伍1∶2組降糖效果優(yōu)于其他組。根據(jù)生化結(jié)果表明按照連翹野菊花2∶1給藥血清中TG和LDL含量最低。對于腎功能的影響，連翹野菊花配伍能夠降低血清尿素含量，但對肌酐無明顯作用。

綜上，連翹和野菊花及其配伍對于營養(yǎng)型高脂血癥小鼠的血脂、血糖代謝及尿素具有較好的調(diào)節(jié)作用，同時二者配伍還具由對腎功能損害較低、毒副作用小、經(jīng)濟(jì)適用等特點，在預(yù)防、治療高脂血癥所造成的血脂血糖異常性升高能夠起到良好的調(diào)節(jié)改善與治療效果。連翹和野菊花及其配伍的其他藥理作用與應(yīng)用價值尚需進(jìn)一步的探索與開發(fā)。