劉綠洲，張 妍，張 林，蔡洪梅，于 敏，魏鳳珍，陳 翔**，李金才

藥隔期低溫脅迫對(duì)小麥功能葉超微結(jié)構(gòu)及光合特性的影響*

劉綠洲1，張 妍1，張 林1，蔡洪梅1，于 敏1，魏鳳珍1，陳 翔1**，李金才1，2**

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)作物栽培科學(xué)觀測(cè)站，合肥 230036；2. 江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095）

以抗倒春寒能力不同的兩個(gè)小麥品種煙農(nóng)19 (YN19)和新麥26 (XM26)為供試材料，于小麥幼穗分化的藥隔期利用超低溫人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行4℃和?4℃兩個(gè)溫度處理，以低溫處理期間大田環(huán)境平均溫度10℃為對(duì)照（CK），觀測(cè)不同程度低溫處理下小麥功能葉超微結(jié)構(gòu)及光合特性的變化。結(jié)果表明：（1）藥隔期低溫脅迫顯著增加供試兩品種小麥功能葉SOD、POD、CAT酶活性和MDA含量，其中CAT酶活性增幅最大，XM26在4℃、?4℃處理下功能葉CAT活性較CK分別增加了48.68%和87.55%，YN19則分別增加了76.59%和110.39%，總體來(lái)看YN19的抗氧化酶活性增幅均大于XM26，具有較強(qiáng)的活性氧清除能力。（2）低溫脅迫破壞小麥功能葉葉綠體結(jié)構(gòu)。XM26在4℃、?4℃處理功能葉葉綠體數(shù)和葉綠體面積較CK分別下降12.43%、24.97%和57.68%、5.88%，YN19分別下降14.56%、16.69%和25.88%、61.90%。隨著溫度的降低（4℃→ ?4℃），供試兩品種小麥葉片的基粒片層數(shù)量和厚度大幅下降，細(xì)胞膜受到不同程度的損傷，基粒片層開始解體。（3）隨著低溫脅迫程度加深，供試兩品種小麥葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和Chla+Chlb含量下降，XM26在?4℃低溫脅迫下較CK分別降低26.97%、27.39%、31.78%，YN19則分別降低34.36%、23.81%、26.91%，表明低溫脅迫使葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致葉綠素含量下降。（4）與CK相比，低溫脅迫下小麥功能葉片凈光合速率（Pn）隨著低溫脅迫程度加深呈降低趨勢(shì)，胞間CO2濃度(Ci)呈逐升趨勢(shì)，XM26在4℃和?4℃低溫脅迫當(dāng)天其Pn分別下降31.84%、92.04%，YN19則分別下降17.42%、89.62%，表明小麥葉片Pn下降主要是由非氣孔限制因素導(dǎo)致。因此，藥隔期低溫脅迫會(huì)使小麥葉片功能受損，導(dǎo)致其光合能力下降，大田生產(chǎn)中可選用抗倒春寒能力強(qiáng)的品種，加強(qiáng)栽培技術(shù)管理，提高小麥抗寒性，減輕倒春寒對(duì)小麥造成的危害。

小麥；低溫脅迫；超微結(jié)構(gòu)；光合特性

小麥（L.）是世界三大糧食作物之一，因其適應(yīng)力強(qiáng)而廣泛種植于全球各地[1]。隨著人口不斷增長(zhǎng)，未來(lái)預(yù)計(jì)中國(guó)小麥年均產(chǎn)量要保持在1.2×108t以上才能滿足口糧需求[2]。然而，由于工業(yè)發(fā)展和人類破壞性活動(dòng)，全球氣候變暖已成為不爭(zhēng)的事實(shí)[3]，1951?2020年，中國(guó)地表年均溫度呈顯著上升趨勢(shì)，截至2020年，中國(guó)大陸地表平均溫度以0.26℃·10a?1的速度升高[4]。氣候變暖使小麥生育進(jìn)程加快，若在低溫敏感期遭遇春季驟然降溫（即倒春寒）會(huì)使小麥幼穗受傷，結(jié)實(shí)率降低，從而造成減產(chǎn)[5?6]。近年來(lái)，黃淮麥區(qū)小麥倒春寒災(zāi)害發(fā)生頻率高且強(qiáng)度大，幾乎每年都有不同程度的發(fā)生，該區(qū)域倒春寒災(zāi)害年際發(fā)生頻率在30%～70%[7?9]。因此，倒春寒已成為限制小麥生產(chǎn)高質(zhì)量發(fā)展的重要因素。

小麥的倒春寒抗性與小麥幼穗分化進(jìn)程密切相關(guān)，應(yīng)在幼穗對(duì)低溫較為敏感的時(shí)期對(duì)小麥抗寒性進(jìn)行研究。藥隔期是決定小麥穗粒數(shù)多少的關(guān)鍵時(shí)期，李春燕等[10]研究發(fā)現(xiàn)，藥隔期?2℃低溫脅迫會(huì)使小麥主莖和大分蘗受凍死亡，影響有效穗數(shù)和穗粒數(shù)的形成，減產(chǎn)率達(dá)20%左右。劉大同等[11]采用人工模擬低溫脅迫研究6個(gè)不同冬春性小麥品種在護(hù)穎原基分化期、雌雄蕊原基分化期、藥隔分化形成期和四分體形成期對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)時(shí)指出，藥隔期對(duì)低溫脅迫最為敏感。李曉林等[12]發(fā)現(xiàn)小麥抗霜凍力隨幼穗發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)逐漸減弱，藥隔前期開始進(jìn)入低溫敏感期。可見倒春寒對(duì)小麥的危害不僅與低溫脅迫強(qiáng)度有關(guān)，還與小麥幼穗分化時(shí)期有關(guān)，藥隔期是小麥生育期中對(duì)低溫脅迫極為敏感的時(shí)期。

光合作用為作物的生長(zhǎng)提供物質(zhì)和能量，是作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的基礎(chǔ)[13?14]。但其對(duì)溫度脅迫十分敏感，因此光合作用常被用來(lái)反映植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)程度[15]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于低溫脅迫對(duì)作物光合作用影響的研究已廣泛開展，張瑤等[16]研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理下黃瓜葉片的葉綠體色素含量、最大光合速率、氣孔導(dǎo)度以及蒸騰速率均有所下降，且處理持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)、溫度越低，黃瓜葉片的光合作用所受抑制越顯著。Li等[17]研究春季低溫對(duì)小麥光合生理的影響，結(jié)果顯示春季低溫顯著降低了兩個(gè)品種小麥葉片的氣體交換速率和光系統(tǒng)II的最大量子效率，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。因此，低溫脅迫主要通過(guò)影響葉片氣孔的開閉[18]、降低光合酶活性和光合色素的生物合成[19]，進(jìn)而引起光合速率的降低，最終導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)的降低[20]。

前人對(duì)小麥葉片光合特性方面的研究多集中在光合氣體參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、光合關(guān)鍵酶活性等方面，而將小麥葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與光合相關(guān)生理指標(biāo)相結(jié)合的研究報(bào)道還較少。因此，本研究選擇兩個(gè)抗倒春寒能力不同的小麥品種，于1：00? 5：00進(jìn)行低溫脅迫處理，模擬大田倒春寒災(zāi)害的溫度變化，探究藥隔期不同程度低溫脅迫對(duì)小麥葉片超微結(jié)構(gòu)及光合特性的影響，以期為小麥生產(chǎn)的防災(zāi)減災(zāi)和提質(zhì)增效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

實(shí)驗(yàn)于2020年10月-2021年6月在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)萃園基地（31°52′N，117°16′E，海拔21.3m）進(jìn)行。土壤類型為黃棕壤，pH為6.5，有機(jī)質(zhì)含量為16.3g·kg?1，速效氮 112.2mg·kg?1，速效磷23.0mg·kg?1，速效鉀161.6mg·kg?1。

在前人研究的基礎(chǔ)上[21]，選用抗倒春寒性強(qiáng)的小麥品種煙農(nóng)19（YN19）和抗倒春寒性弱的小麥品種新麥26（XM26）為供試材料。

1.2 低溫處理

采用大田盆栽方法種植，將大田0-20cm耕作層土壤裝入實(shí)驗(yàn)盆（聚乙烯塑料桶，高35cm、直徑26cm，5個(gè)排水孔），每盆裝土8kg，播種后覆土2kg。播種前每盆施入復(fù)合肥5.76g，拔節(jié)期追施氮肥1.5g；每盆播種16粒，于三葉期間苗，最終留8株苗。利用超低溫人工氣候培養(yǎng)箱（DGXM-1008型，寧波產(chǎn)，長(zhǎng)×寬×高=1300mm×630mm×1305mm）進(jìn)行低溫模擬實(shí)驗(yàn)，空氣濕度設(shè)置為70%，夜間光照為0Lx。

根據(jù)歷年氣象資料，倒春寒一般發(fā)生在3月下旬?4月上旬，此時(shí)正處于小麥幼穗分化的藥隔期，藥隔期是低溫敏感時(shí)期，此時(shí)遭遇低溫很容易發(fā)生凍害，引起光合速率的降低，最終導(dǎo)致作物產(chǎn)量的降低。于2021年3月21日選取植株長(zhǎng)勢(shì)基本一致的盆栽80盆小麥，于當(dāng)日21：00移至超低溫人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫脅迫處理，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度從自然大田常溫（14℃）歷時(shí)4h逐漸下降至4℃和?4℃兩個(gè)低溫處理溫度，處理時(shí)間為1：00-5：00，連續(xù)低溫處理4h，以低溫處理期間大田環(huán)境平均溫度10℃為對(duì)照(CK)；處理結(jié)束后，于5：00立即將盆栽移回大田原位置繼續(xù)生長(zhǎng)直至成熟。實(shí)驗(yàn)期間田間溫度和處理溫度變化如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間大田氣溫（CK）和培養(yǎng)箱內(nèi)溫度變化過(guò)程（數(shù)據(jù)獲取于2021年3月21-22日）

注：21：00?1：00從自然大田常溫（14℃）逐漸下降至4℃、?4℃和大田環(huán)境平均溫度10℃（CK）；1：00?5：00維持低溫處理4℃、?4℃和大田環(huán)境平均溫度10℃（CK）。

Note: 21:00?1:00: from ambient temperature (14℃) to 4℃, ?4℃ and ambient environment average temperature 10℃(CK)；1：00?5：00: maintain low temperature treatment at 4℃, ?4℃ and ambient environment average temperature 10℃(CK).

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1 葉片超微結(jié)構(gòu)觀察

低溫處理完當(dāng)天（2021年3月22日），選取一片主莖倒二葉葉片中部，避開主葉脈，切成1mm2的樣塊，迅速裝入含有2.5%戊二醛固定液（pH7.2）的醫(yī)用瓶中，用注射器抽氣，直到樣品懸浮于固定液為止，置4℃冰箱固定4h。固定的樣品經(jīng)0.1mol·L?1磷酸鈉緩沖液清洗3次后，用1%四氧化鋨(緩沖液同前)室溫固定1.5h。材料經(jīng)緩沖液清洗3次，梯度乙醇脫水，最后滲透包埋于Epon812中性樹脂中，獲得樣品包埋塊。包埋塊用LKB-V超薄切片機(jī)切片，切片厚度60nm，超薄切片經(jīng)醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色后，用透射電鏡（JEOL-1200EX，Japan）觀察，每個(gè)處理隨機(jī)測(cè)定3片[22]。

1.3.2 抗氧化酶活性、MDA和葉綠素含量測(cè)定

低溫處理完當(dāng)天（2021年3月22日）選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的小麥植株（每處理8盆），取小麥倒二葉用液氮冷凍后帶回實(shí)驗(yàn)室置于?80℃冰箱中保存，用于測(cè)定抗氧化酶活性、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和葉綠素含量。過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性采用氮藍(lán)四唑比色法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性采用過(guò)氧化氫法測(cè)定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，小麥葉片葉綠素含量采用浸提法測(cè)定[23]。

1.3.3 光合參數(shù)

低溫處理完當(dāng)天（2021年3月22日）9：00- 11：00采用CIRAS-3便攜式光合作用測(cè)定儀測(cè)定主莖倒二葉的凈光合速率（Pn）和胞間CO2濃度（Ci），每個(gè)處理選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的3株測(cè)定光合參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并作圖，用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥隔期低溫脅迫對(duì)功能葉抗氧化酶活性和MDA含量的影響

低溫脅迫增加了小麥功能葉抗氧化酶活性和MDA含量（圖2），各處理與CK差異達(dá)顯著水平。XM26低溫處理（4°C和?4°C）功能葉SOD、POD、CAT酶活性和MDA含量較CK分別上升了25.64%、49.63%；23.29%、43.40%；48.68%、87.55%和10.00%、61.54%；YN19則分別上升了29.17%、52.23%；45.92%、55.88%；76.59%、110.39%和36.61%、39.93%。低溫處理下YN19抗氧化酶活性的增幅大于XM26，MDA含量的增幅則相反，表明在低溫脅迫下YN19具有較強(qiáng)的活性氧清除能力，其抗倒春寒性優(yōu)于XM26。

圖2 兩品種小麥功能葉在不同溫度處理下抗氧化酶和MDA含量的比較

注：小寫字母表示同一品種不同處理間在0.05水平上的差異顯著性。短線表示標(biāo)準(zhǔn)誤。下同。

Note：Lowercase letters indicate the difference significance among different treatments at the level of 0.05. The bar is standard error. The same as below.

2.2 藥隔期低溫脅迫對(duì)小麥功能葉超微結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 對(duì)葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其超微結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響

供試兩品種小麥葉片葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)（圖3）在正常溫度處理（CK，約10℃）下功能葉葉綠體結(jié)構(gòu)清晰，呈橢圓狀，大多整齊排列在細(xì)胞壁附近，數(shù)量較多，細(xì)胞中央均有一個(gè)大液泡。經(jīng)過(guò)4h的4℃低溫脅迫后，兩品種小麥葉綠體略微膨脹，不再整齊地緊靠細(xì)胞壁排列。?4℃低溫脅迫后，XM26小麥葉片薄壁細(xì)胞變形，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，大部分葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)消失，內(nèi)含物外泄；YN19小麥葉片細(xì)胞開始變形，葉綠體排列位置混亂，部分葉綠體開始解體?？梢?，4h低溫脅迫對(duì)小麥葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞，而且對(duì)抗倒春寒性弱品種XM26葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度大于抗倒春寒強(qiáng)品種YN19。

供試兩品種小麥功能葉葉綠體數(shù)和葉綠體面積隨著低溫脅迫加重呈下降趨勢(shì)。由表1可知，XM26低溫處理（4℃和?4℃）的葉綠體數(shù)和葉綠體面積較CK分別下降12.43%、24.97%和61.03%、77.79%，YN19則分別下降14.56%、22.94%和25.88%、61.90%；其中，葉綠體面積各處理間差異顯著。此外，供試兩品種小麥葉綠體長(zhǎng)寬比隨著低溫脅迫的加重呈先下降后上升的趨勢(shì)，且各處理與CK差異顯著。

2.2.2 對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)及其超微結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響

供試兩品種小麥葉片葉綠體結(jié)構(gòu)（圖4）在正常溫度處理（CK）下小麥葉片葉綠體基粒排列規(guī)則，基粒片層緊密，結(jié)構(gòu)完整，跺疊整齊，沿葉綠體的長(zhǎng)軸方向平行排列；其中，XM26小麥葉片的葉綠體內(nèi)有少量嗜鋨顆粒。4℃低溫脅迫后，兩品種小麥葉綠體略微膨脹，類囊體排列方向變得混亂，葉綠體內(nèi)均出現(xiàn)嗜鋨顆粒。?4℃低溫脅迫后，XM26小麥葉片大部分葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)消失，葉綠體和基粒片層發(fā)生解體；YN19小麥葉片的葉綠體脹裂，內(nèi)部出現(xiàn)空腔，雙層膜結(jié)構(gòu)消失，基粒片層松散?？梢姡蜏孛{迫對(duì)抗倒春寒性弱品種XM26葉綠體結(jié)構(gòu)破壞程度大于抗倒春寒強(qiáng)品種YN19。

圖3 兩品種小麥功能葉在不同溫度處理下葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的比較

注：W為細(xì)胞壁，IS為細(xì)胞間隙，Ch為葉綠體，V為液泡，M為線粒體，N為細(xì)胞核，G為基粒，OG為嗜鋨顆粒。下同。

Note: W is the cell wall, IS is the intercellular space, Ch is the chloroplast, V is the vacuole, M is the mitochondria, N is the nucleus, G is the grana, OG is the osmiophilic granule. The same as below.

表1 兩品種小麥功能葉在不同溫度處理下葉綠體結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

注：表中數(shù)字為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。下同。

Note: The data is average ± standard error. The same as below.

圖4 兩品種小麥功能葉在不同溫度處理下葉綠體超微結(jié)構(gòu)的比較

由表2可知，供試兩品種小麥葉片類囊體中的基粒數(shù)、基粒片層數(shù)以及基粒厚度隨著低溫脅迫程度加劇呈下降趨勢(shì)，且低溫脅迫處理均與CK差異顯著。XM26低溫處理（4℃和?4℃）的基粒數(shù)、基粒片層數(shù)和基粒厚度較CK分別下降了39.73%、55.12%，47.21%、57.71%和45.83%、50.00%，YN19則分別下降了37.11%、54.86%，43.09%、51.73%和18.18%、36.36%；與XM26相比，YN19的類囊體垛疊程度和基粒數(shù)更高，在逆境下維持捕獲光能的能力更強(qiáng)，這與電鏡下觀察到的功能葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化一致。

表2 兩品種小麥功能葉在不同溫度處理下類囊體系統(tǒng)參數(shù)的比較

2.2.3 對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)的影響

由圖5可見，供試兩品種小麥功能葉線粒體在正常溫度處理（CK）下呈橢圓形，雙層膜結(jié)構(gòu)明顯，內(nèi)部均勻分布著大量的嵴，嵴線清晰規(guī)則，線粒體多分布于兩個(gè)葉綠體之間。4℃低溫脅迫后，XM26小麥葉片的線粒體與CK處理相比無(wú)明顯變化，YN19葉片的線粒體外膜開始變得模糊。?4℃低溫脅迫后，XM26小麥葉片的線粒體腫脹呈圓形，線粒體膜及嵴模糊不清，YN19小麥品種葉片的線粒體的嵴線完全消失。

2.3 藥隔期低溫脅迫對(duì)小麥功能葉葉綠素含量的影響

由圖5可見，隨著低溫脅迫程度加劇，供試兩品種小麥功能葉葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和Chla+Chlb含量均呈下降趨勢(shì)。?4℃低溫脅迫下，XM26較CK分別降低26.97%、27.39%、31.78%，YN19較CK分別降低34.36%、23.81%、26.91%，且均與CK差異達(dá)顯著水平。

葉綠素a/b（Chla/Chlb）隨著溫度降低呈先升高后降低的趨勢(shì)，供試兩品種功能葉Chla/Chlb在4℃處理升至最高點(diǎn)，之后急速下降。說(shuō)明Chlb對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)速度快于Chla，但它的穩(wěn)定性比Chla高；在低溫脅迫下Chlb首先降解，這不利于葉片對(duì)光能的有效吸收，隨著脅迫加重Chla也遭到破壞急速降解。

2.4 藥隔期低溫脅迫對(duì)小麥功能葉光合參數(shù)的影響

2.4.1 對(duì)凈光合速率的影響

圖7表明，藥隔期低溫脅迫顯著降低功能葉Pn，低溫脅迫后不同處理間差異均達(dá)顯著水平，隨著時(shí)間的推移各處理間差異逐漸減小。與CK相比，XM26在4℃和?4℃低溫脅迫后當(dāng)天的Pn值分別下降了31.84%、92.04%，YN19在4℃和?4℃則分別下降了17.42%、89.62%?？梢?，低溫脅迫對(duì)XM26功能葉Pn影響大于YN19，這可能是因?yàn)閄M26對(duì)低溫更敏感。

圖5 兩品種小麥功能葉在不同溫度處理下線粒體結(jié)構(gòu)的比較

圖6 兩品種小麥功能葉在不同溫度處理下葉綠素含量的比較

圖7 兩品種小麥功能葉在不同溫度處理下凈光合速率的比較

2.4.2 對(duì)胞間CO2濃度的影響

圖8表明，藥隔期低溫脅迫顯著增加小麥功能葉Ci。與CK相比，XM26在4℃和?4℃低溫脅迫后當(dāng)天的Ci值分別增加了116.30%、245.91%，YN19在4℃和?4℃則分別增加了130%、253.85%；低溫脅迫結(jié)束后15d，YN19各低溫脅迫的功能葉Ci恢復(fù)至接近對(duì)照水平，而XM26各低溫脅迫處理的Ci仍與CK差異顯著?？梢姡蜏孛{迫對(duì)XM26的Ci影響大于YN19，且后者用于恢復(fù)的時(shí)間要遠(yuǎn)少于前者。

圖8 兩品種小麥功能葉在不同溫度處理下的胞間CO2濃度的比較

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

低溫脅迫下植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)最先受到傷害，膜系統(tǒng)受損與低溫脅迫下植物體內(nèi)積累大量活性氧（ROS）有關(guān)，同時(shí)植物體內(nèi)合成SOD、POD、CAT等維持體內(nèi)活性氧平衡，進(jìn)而降低光合機(jī)構(gòu)受損程度，使植物在逆境下仍能保持較高的光合速率[24?25]。作為膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物，MDA含量的積累會(huì)對(duì)膜和細(xì)胞產(chǎn)生進(jìn)一步的傷害[26?27]。本研究表明隨著低溫脅迫加深，兩品種小麥開始積累大量MDA，同時(shí)抗氧化酶活性也在上升，表明此時(shí)小麥葉片細(xì)胞內(nèi)活性氧與抗氧化系統(tǒng)間的平衡被打破，活性氧產(chǎn)生速度超過(guò)了抗氧化酶清除能力，MDA大量積累導(dǎo)致細(xì)胞膜原有結(jié)構(gòu)和功能受到損害。

植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性是維持植物生長(zhǎng)發(fā)育和光合作用的前提，逆境脅迫下植物超微結(jié)構(gòu)的變化是植物抗逆性的重要指標(biāo)[28?30]。雷斌等[31]發(fā)現(xiàn)，在5℃低溫下未包衣處理的棉花幼苗葉片葉綠體膨脹成圓球形，基粒片層結(jié)構(gòu)松散，葉綠體在細(xì)胞內(nèi)分布散亂，而線粒體等其它細(xì)胞器表現(xiàn)較為穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，4℃低溫脅迫下兩小麥品種葉片葉綠體形狀和結(jié)構(gòu)與CK相比無(wú)明顯改變，但葉綠體內(nèi)出現(xiàn)標(biāo)志其衰老的嗜鋨顆粒；?4℃低溫脅迫下部分葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)消失，基粒片層結(jié)構(gòu)解體明顯，該溫度下葉綠體結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，影響其正常功能。付連雙等[32]研究表明，與葉綠體相比，低溫脅迫下線粒體更穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)與其研究結(jié)果一致，當(dāng)葉綠體發(fā)生解體時(shí)，線粒體僅內(nèi)嵴模糊仍能夠保持完整結(jié)構(gòu)。

葉肉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)決定光合能力強(qiáng)弱，其中葉綠體是高等植物光合作用的場(chǎng)所，葉綠體基粒片層緊密排列可提高葉片光合速率[33]。崔麗娜等[34]研究高溫脅迫對(duì)夏玉米葉片超微構(gòu)造的影響，結(jié)果表明高溫脅迫下葉綠體數(shù)、葉綠體基粒數(shù)及基粒片層數(shù)減少，葉綠體面積及葉綠體長(zhǎng)寬比變小，細(xì)胞內(nèi)嗜鋨顆粒增加，表明高溫脅迫破壞了葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響了葉綠體的捕光能力。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小麥功能葉葉綠體結(jié)構(gòu)和類囊體系統(tǒng)的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫導(dǎo)致小麥葉綠體面積、類囊體基粒數(shù)、基粒片層數(shù)及基粒厚度均較對(duì)照處理顯著降低，低溫脅迫破壞葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)，降低類囊體垛疊程度，影響光能捕獲能力，最終導(dǎo)致葉片光合能力顯著下降。兩品種間葉綠體數(shù)量和面積變化不一致，低溫脅迫下XM26葉綠體數(shù)量和面積下降比率均遠(yuǎn)高于YN19，說(shuō)明YN19葉綠體結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，在脅迫下仍能保持比較密集的捕光結(jié)構(gòu)。此外，在4℃低溫脅迫下葉綠體長(zhǎng)寬比呈下降趨勢(shì)，與透射電鏡下觀察到低溫脅迫后葉綠體由橢圓形膨脹成圓球狀的結(jié)果一致，但?4℃低溫脅迫下葉綠體長(zhǎng)寬比回升，這可能是?4℃脅迫下葉綠體發(fā)生解體所致。

低溫脅迫不僅改變植物形態(tài)結(jié)構(gòu)，還會(huì)影響植物生理特性。葉綠素在光合作用中起到捕獲、吸收和轉(zhuǎn)化光能的作用，其含量與植物的光合能力密切相關(guān)[35]；徐若涵等[36]研究發(fā)現(xiàn)，草莓葉片Chla、Chlb和Chla+Chlb等光合色素隨低溫脅迫程度加深而大幅下降，表明輕度低溫脅迫會(huì)抑制小麥功能葉葉綠素生物合成，隨著脅迫加重葉綠體結(jié)構(gòu)遭到不可逆的損傷，本研究結(jié)果與前人一致[37?38]。Chla/Chlb變化可以反映兩種不同功能葉綠素對(duì)低溫的敏感程度[39]，本研究中輕度低溫脅迫下Chlb含量下降幅度大于Chla，表明輕度低溫主要抑制葉片捕捉和傳遞光能的能力；隨著脅迫加重，Chla含量迅速下降且降幅超過(guò)Chlb，這可能是因?yàn)橹囟鹊蜏孛{迫破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，位于類囊體膜上葉綠素被分解破壞，無(wú)法再進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)；光合色素量的降低也是造成小麥光合速率降低的重要原因。Pn直接體現(xiàn)植物光合能力，低溫脅迫下葉片Pn下降主要由氣孔或非氣孔因素導(dǎo)致，若Pn和Ci同時(shí)下降說(shuō)明Pn下降是由氣孔限制因素引起；反之則是由非氣孔限制因素引起[40]。本研究表明，低溫脅迫下小麥葉片Pn下降主要是由非氣孔限制因素導(dǎo)致，低溫破壞葉片光合器官，降低葉片光合酶活性，致使大量CO2積累于細(xì)胞間而無(wú)法及時(shí)被同化。

3.2 結(jié)論

（1）隨著低溫脅迫程度的加強(qiáng)，兩品種小麥功能葉SOD、POD、CAT酶活性和MDA含量均呈上升趨勢(shì)，表明低溫脅迫打破了ROS代謝平衡，活性氧產(chǎn)生速度超過(guò)了抗氧化酶清除能力，MDA大量積累導(dǎo)致細(xì)胞膜原有結(jié)構(gòu)和功能受到損害。

（2）低溫脅迫下小麥葉肉細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)和面積減小、基粒片層數(shù)量和厚度大幅下降，隨著脅迫加重，細(xì)胞膜受到不同程度的損傷，基粒片層開始解體，導(dǎo)致小麥葉片光合作用減弱。

（3）兩品種小麥隨著低溫脅迫的加強(qiáng)，Pn和葉綠素含量都顯著下降，而Ci上升，表明葉片Pn下降主要是由非氣孔限制因素導(dǎo)致，可能是因?yàn)榈蜏叵氯~綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞，位于類囊體膜上葉綠素被分解，無(wú)法再進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，光合反應(yīng)中心受損嚴(yán)重，導(dǎo)致光合能力下降。

綜上所述，藥隔期低溫脅迫主要通過(guò)破壞小麥葉片的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其光合性能下降。

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Effects of Low Temperature Stress during the Anther Differentiation Period on Leaf Anatomical Structure and Photosynthetic Characteristics of Wheat

LIU Lv-zhou1, ZHANG Yan1, ZHANG Lin1, CAI Hong-mei1, YU Min1, WEI Feng-zhen1, CHEN Xiang1, LI Jin-cai1, 2

(1.College of Agronomy, Anhui Agricultural University/Crop cultivation Science Observatory in East China of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hefei 230036, China; 2.Collaborative Innovation Center of Modern Crop Production in Jiangsu, Nanjing 210095)

Two wheat varieties differing in spring cold-sensitivity Yannong 19 (YN19) and Xinmai 26(XM26) were used as experimental materials. During the anther differentiation period, two temperature treatments of 4℃ and?4℃were set up in the smart climate box. At the same time, the average temperature of the ambient temperature was 10℃ as the control (CK). After the treatment, effects of low temperature stress during the anther differentiation period on leaf anatomical structure and photosynthetic characteristics of wheat were observed. The results showed that: (1) low temperature stress during the anther differentiation period significantly increased the SOD, POD, CAT enzyme activities and MDA content of functional leaves of the two wheat varieties, and the CAT enzyme activity increased the most. Compared with CK, XM26 increased by 48.68% and 87.55% at 4℃ and ?4℃, while YN19 increased by 76.59% and 110.39%, respectively. Overall, the increase in antioxidant enzyme activity of YN19 was greater than that of XM26, and it had a strong ability to eliminate reactive oxygen species. (2) Low temperature stress destroys the chloroplast structure of wheat functional leaves. Compared with CK, the chloroplast number and chloroplast area of XM264℃ and ?4℃ decreased by 12.43%, 24.97% and 57.68%, 5.88%, respectively, and YN19 decreased by 14.56%, 16.69% and 25.88%, 61.90%, respectively. With the decrease of temperature (4℃→?4℃), the number and thickness of grana lamellae in the leaves of the two tested wheat varieties also decreased significantly, the cell membrane was damaged to different degrees, and the grana lamella began to disintegrate. (3) With the deepening of low temperature stress, the contents of chlorophyll a (Chla), chlorophyll b (Chlb) and Chla+Chlb of the two tested wheat varieties decreased, and XM26 decreased by 26.97%, 27.39%, 31.78% compared with CK under ?4℃ low temperature stress, while YN19 decreased by 34.36%, 23.81%, and 26.91%, respectively, indicating that low temperature stress destroyed the internal structure of leaves and reduces chlorophyll content. (4) Compared with CK, the net photosynthetic rate (Pn) of functional leaves of wheat under low temperature stress decreased gradually, and the intercellular CO2concentration (Ci) increased gradually. The Pn of XM26 decreased by 31.84% and 92.04%, while that of YN19 decreased by 17.42% and 89.62% on the day of low temperature stress at 4℃ and ?4℃, respectively, indicating that the decrease of Pn in wheat leaves was mainly caused by non-stomatal limiting factors. To sum up, the low temperature stress during the anther differentiation period will damage the wheat leaf function and reduce its photosynthetic capacity. Therefore, the cultivation and management measures should be strengthened in field production to improve the cold resistance of wheat and reduce the damage caused by late spring cold to wheat.

Wheat; Low temperature stress; Leaf anatomical structure; Photosynthetic characteristics

10.3969/j.issn.1000-6362.2023.01.006

劉綠洲,張妍,張林,等.藥隔期低溫脅迫對(duì)小麥功能葉超微結(jié)構(gòu)及光合特性的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象,2023,44(1):58-70

2022?03?08

安徽省自然科學(xué)基金（2008085QC122）；安徽省重大科技專項(xiàng)（202003b06020021）；“十四五”安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助；淮北市重大科技專項(xiàng)（HK2021013）

李金才，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事作物生理生態(tài)研究，E-mail:ljc5122423@126.com；陳翔，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事作物生理生態(tài)研究，E-mail:cxagricultural@163.com

劉綠洲，E-mail：liulvzhou1284@163.com