翟永琪 賈 利 馬紹鋆 江海坤 孫學(xué)良 張 濤 宋江華 嚴(yán)從生* 丁強(qiáng)強(qiáng) 張其安

（1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽合肥 230036；2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，安徽合肥 230031；3 園藝作物種質(zhì)創(chuàng)制及生理生態(tài)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031）

西瓜（Citrullus lanatusL.）營(yíng)養(yǎng)豐富、口感酥脆、味道香甜，深受消費(fèi)者喜愛，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)是西瓜生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，年產(chǎn)量一直位于世界首位（王曉君 等，2021）；截至2019 年我國(guó)西瓜種植面積增至147 萬hm2，占世界總種植面積的47%（劉文革，2021）。為適應(yīng)國(guó)內(nèi)和全球市場(chǎng)的生產(chǎn)和消費(fèi)需求，目前我國(guó)西瓜育種的主要目標(biāo)是抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、耐貯運(yùn)等（劉文革等，2016；Huang et al.，2019）。種質(zhì)材料是育種工作的重要基石，由于長(zhǎng)期自然選擇和人工選擇育種，使我國(guó)西瓜種質(zhì)資源收集范圍越來越狹窄，缺乏創(chuàng)新性的優(yōu)異種質(zhì)資源，因此創(chuàng)制西瓜新種質(zhì)迫在眉睫（劉文革，2021）。

誘變育種技術(shù)是解決當(dāng)前育種工作中遺傳背景狹窄、遺傳資源稀缺等問題的有效方法之一。其中，化學(xué)誘變具有成本低、操作簡(jiǎn)單、突變性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是創(chuàng)制新種質(zhì)的有效手段（Gao et al.，2022）。甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonste，EMS）是最常用的化學(xué)誘變劑之一，具有穩(wěn)定性好、突變類型豐富、染色體損傷小、誘變頻率高等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)在葫蘆科、茄科、十字花科等蔬菜作物的突變體庫(kù)構(gòu)建及種質(zhì)資源創(chuàng)制中取得一定進(jìn)展（楊建勝 等，2018；Chen et al.，2018；李世升 等，2019；Li et al.，2019；Xiao et al.，2019；王藝 程等，2022；Gao et al.，2022；Huang et al.，2022）。研究表明，EMS 誘導(dǎo)獲得的突變體在非生物脅迫、表型性狀和代謝物含量等性狀上均有所改善。張慧等（2022）以多油辣木（Moringa oleiferaLam.）品種PKM-1 為材料，經(jīng)EMS 誘變處理后發(fā)現(xiàn)M2出現(xiàn)芽多分支的株型性狀突變，葉腋分化能力強(qiáng)，有望作為高產(chǎn)辣木育種研究材料。葉衛(wèi)軍等（2020）以綠豆品種皖科綠3 號(hào)為材料，經(jīng)EMS 處理后發(fā)現(xiàn)1 株扁平莖的突變體，其結(jié)莢位置主要集中在植株頂部，便于機(jī)械化收割。Xiao 等（2017）對(duì)茄子M2的表型性狀進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其突變基因可通過調(diào)控MYB1和大部分花青素生物合成基因來調(diào)控花青素的積累。大量研究結(jié)果均表明，通過EMS誘變可以獲得豐富的表型變異及性狀優(yōu)良的突變體材料，是培育作物新品種的重要方法之一。然而，EMS 誘變也存在一定的局限性，如突變方向不確定，對(duì)誘變材料有毒害性，M1不穩(wěn)定等，從而導(dǎo)致后代誘變?nèi)后w數(shù)量較大，加大了后期篩選與鑒定的工作量。因此，篩選出EMS 濃度與處理時(shí)間適宜組合，對(duì)于獲得最大突變?nèi)后w和提高突變效率至關(guān)重要（王藝程 等，2022）。

為加快西瓜種質(zhì)資源的創(chuàng)新和推動(dòng)EMS 誘變技術(shù)在西瓜上的利用，本試驗(yàn)以西瓜高代自交系W-17-FGFB 為材料，采用不同濃度EMS 溶液進(jìn)行誘變處理，通過對(duì)誘變處理后種子的發(fā)芽率和出苗率進(jìn)行分析，獲得EMS 誘變西瓜種子的最佳誘變劑量；通過田間農(nóng)藝性狀的調(diào)查，篩選出有特異性狀的突變體，以期構(gòu)建西瓜的優(yōu)異突變體庫(kù)，進(jìn)而為西瓜功能基因組學(xué)研究和拓寬西瓜的遺傳背景奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022 年3—7 月在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所試驗(yàn)田和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試西瓜材料為高代自交系W-17-FGFB（自交6 代，性狀穩(wěn)定），由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所蔬菜種質(zhì)資源與遺傳育種研究室提供。EMS 誘變劑（水劑）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘變處理 選取完整、飽滿的W-17-FGFB種子，用55 ℃溫水浸種20 min 后，再用清水浸種5 h，使用無菌濾紙吸干水分，將種子用小刀磕口后備用。使用磷酸緩沖液（pH＝7.0）配制濃度分別為0（CK）、0.5%、1.0%、1.5%、2.0% 的EMS誘變液；在通風(fēng)櫥中，分別將磕口的種子浸入20 mL 不同濃度的EMS 溶液中，然后在恒溫?fù)u床上以28 ℃、100 r·min-1分別振蕩處理12、16、24 h；EMS 處理結(jié)束后，在通風(fēng)櫥中先將EMS 誘變液倒入廢液桶中，然后每個(gè)處理分別加入1 mol·L-1硫代硫酸鈉10 mL（終止反應(yīng)），混勻后倒掉溶液；再加入100 mmol·L-1硫代硫酸鈉20 mL，輕搖5 min，倒掉溶液，之后用100 mmol·L-1硫代硫酸鈉清洗3 遍；最后加入20 mL 去離子水，輕搖5 min，倒掉溶液，清洗3 遍。每處理100 粒種子，3次重復(fù)。

1.2.2 田間種植 在直徑6 cm 的培養(yǎng)皿中鋪一層濕紗布，將洗好的種子均勻擺好，再蓋一層濕紗布，放置在28 ℃的暗培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。每隔24 h 清洗1 次種子，觀察并記錄種子發(fā)芽數(shù)。發(fā)芽以種子露白2 mm 為標(biāo)準(zhǔn)，催芽7 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

隨后將出芽的種子播于50 孔穴盤中，在連棟大棚內(nèi)進(jìn)行基質(zhì)育苗。播種后每天觀察出苗情況，種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為子葉頂出土層1.5 cm，播種10 d 后統(tǒng)計(jì)出苗率。

待幼苗長(zhǎng)至2～3 片真葉時(shí)，定植于安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所試驗(yàn)地，采用吊蔓栽培，每畦3 行，株距40 cm，田間常規(guī)管理。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

發(fā)芽率＝（發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

出苗率＝（出苗種子數(shù)/發(fā)芽種子數(shù)）×100%

參照《西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》（http：//www.cgris.net）的方法和標(biāo)準(zhǔn)，每處理隨機(jī)選取3 株，在植株生長(zhǎng)期調(diào)查各項(xiàng)農(nóng)藝性狀，包括始花節(jié)位、節(jié)間長(zhǎng)、莖粗、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬；在果實(shí)成熟期測(cè)定中心糖含量、邊糖含量、果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、瓜柄長(zhǎng)、瓜柄寬、單果質(zhì)量等果實(shí)性狀。

篩選出最適宜誘變劑量與處理時(shí)間后，再對(duì)1 000 粒種子進(jìn)行誘變處理，在苗期對(duì)子葉，盛花期對(duì)莖、葉片和花器官及采收期對(duì)果實(shí)觀察變異情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同EMS 處理對(duì)W-17-FGFB 種子發(fā)芽率和出苗率的影響

EMS 誘變效果受處理時(shí)間、濃度條件等的影響。由表1 可知，EMS 濃度為0.5%、1.0%、1.5%時(shí)，3 個(gè)處理時(shí)間的W-17-FGFB 種子發(fā)芽率都在68%以上，表明低濃度EMS 處理對(duì)西瓜種子的傷害較?。辉贓MS 濃度為2.0%時(shí)，所有處理時(shí)間的發(fā)芽率均為最低值，且顯著低于其他濃度處理及對(duì)照。除0.5% EMS 處理16 h 外，其他誘變處理的出苗率均低于對(duì)照；經(jīng)2.0% EMS 處理12、16、24 h 的出苗率分別為58.00%、46.00%、45.00%，均較接近半致死率。結(jié)合發(fā)芽率與出苗率來看，2.0% EMS 處理24 h 的致死率最接近半致死量。

表1 不同EMS 處理對(duì)W-17-FGFB 種子發(fā)芽率和出苗率的影響

2.2 不同EMS 處理對(duì)W-17-FGFB 植株農(nóng)藝性狀和果實(shí)性狀的影響

不同EMS 處理對(duì)W-17-FGFB 始花節(jié)位、節(jié)間長(zhǎng)、最大葉長(zhǎng)和最大葉寬等農(nóng)藝性狀都有明顯的影響（表2）。在始花節(jié)位方面，除0.5% EMS 處理12 h 外，其他誘變處理均出現(xiàn)升高或降低的變化。其中始花節(jié)位最大值處理是經(jīng)0.5% EMS 處理16 h，為9.67 節(jié)；最小值處理是經(jīng)2.0% EMS 處理24 h，為5.67 節(jié)。在節(jié)間長(zhǎng)方面，EMS 處理時(shí)間為12 h 對(duì)節(jié)間長(zhǎng)的影響最大，其最大值與最小值分別為1.0%與2.0%濃度處理，對(duì)應(yīng)的節(jié)間長(zhǎng)分別為30.50 cm 和22.70 cm。在最大葉長(zhǎng)和最大葉寬方面，最大葉長(zhǎng)與寬的最大值分別為1.0% EMS 處理16 h 的28.87 cm 和0.5% EMS 處理16 h 的21.93 cm，最小值均為1.5% EMS 處理24 h，對(duì)應(yīng)值分別為19.60 cm 和16.10 cm。各誘變處理對(duì)莖粗的影響均不顯著。

表2 不同EMS 處理對(duì)W-17-FGFB 植株農(nóng)藝性狀的影響

從表3可以看出，EMS誘變處理對(duì)W-17-FGFB單果質(zhì)量的影響最大，1.5% EMS 處理16 h 的單果質(zhì)量最大，為2 402.50 g，而2.0% EMS 處理16 h的單果質(zhì)量最小，為268.33 g，前者是后者的8.95倍。在瓜柄長(zhǎng)方面，最大值和最小值處理分別為1.0% EMS 處理16 h（14.25 cm）和2.0% EMS 處理16 h（5.33 cm）。在糖含量方面，除1.5% EMS 處理12、16 h 外，其他誘變處理的中心糖均低于對(duì)照；邊糖含量也僅0.5% EMS 處理12 h 和1.5% EMS 處理12、16 h 高于對(duì)照。在果實(shí)縱橫徑方面，1.0%、1.5% EMS 處理16 h 的縱徑和橫徑均顯著高于對(duì)照，EMS 各濃度處理12 h 的縱徑和橫徑均低于對(duì)照，2.0% EMS 處理12、16、24 h 的縱徑和橫徑亦低于對(duì)照。綜合來看，2.0% EMS 處理的西瓜果實(shí)各性狀受抑制的程度較重，說明EMS 誘變劑濃度越高對(duì)西瓜果實(shí)發(fā)育抑制程度就越高。

表3 不同EMS 處理對(duì)W-17-FGFB 果實(shí)性狀的影響

從W-17-FGFB 誘變處理后植株農(nóng)藝性狀和果實(shí)性狀的調(diào)查結(jié)果可以看出，2.0% EMS 處理24 h對(duì)植株和果實(shí)的影響較大，適宜作為西瓜種質(zhì)創(chuàng)新的誘變劑。

2.3 2.0% EMS 處理24 h 后W-17-FGFB 的表型變異

2.3.1 子葉 表現(xiàn)出完全黃化且長(zhǎng)勢(shì)慢，邊緣及葉脈黃化，單片子葉分裂，子葉真葉化，子葉斑點(diǎn)，皺縮畸形等變異性狀（圖1）。

圖1 2.0% EMS 處理24 h 后W-17-FGFB 的子葉變異情況

2.3.2 成株 莖突變主要表現(xiàn)在莖粗（圖2-B）上，隨機(jī)選取植株的第16～19 節(jié)間進(jìn)行測(cè)量，莖粗均值為1.03 cm，比對(duì)照（0.61 cm）增加了68.85%。產(chǎn)生變異的植株側(cè)枝明顯減少，如圖2-D 僅有1 個(gè)側(cè)枝，而對(duì)照基本上每個(gè)節(jié)位都有側(cè)枝（圖2-C）。葉片的變異主要表現(xiàn)在葉色、葉形上，如一半葉片呈白化（圖3-B），部分葉片發(fā)黃（圖3-C），葉片頂端微凹（圖3-D），葉片顏色加深（圖3-E），葉片顏色淺綠且葉形改變（圖3-F）。

圖2 2.0% EMS 處理24 h 后W-17-FGFB 的莖和植株變異情況

圖3 2.0% EMS 處理24 h 后W-17-FGFB 的葉片變異情況

2.3.3 花器官 W-17-FGFB 正?；ǖ幕ò陻?shù)為5瓣，花瓣平展，顏色為黃色（圖4-A）。EMS 誘變后，有的花冠變大（圖4-B）；有的雄花與兩性花同株（圖4-C、D）；在花瓣數(shù)目上也發(fā)生了變異，3～8 瓣不等（圖4-E～H）；花瓣也產(chǎn)生畸形（圖4-I～K）；花瓣顏色變成白色（圖4-L）；此外，還發(fā)現(xiàn)多柱頭的畸形變異花（圖4-M～O）。

圖4 2.0% EMS 處理24 h 后W-17-FGFB 的花器官變異情況

2.3.4 果實(shí) EMS 誘變對(duì)果實(shí)的影響主要反映在果實(shí)大小及果皮顏色上（圖5）。W-17-FGFB 正常果實(shí)果皮為綠色，條紋數(shù)13～14 條，單果質(zhì)量均值為988.67 g，果實(shí)縱徑和橫徑分別為12.40 cm 和12.43 cm。誘變處理后單果質(zhì)量可達(dá)到3 486.5 g，比對(duì)照增加了252.65%，縱徑和橫徑分別為18.4 cm 和19.5 cm，條紋數(shù)增加至17 條（圖5-B）；果皮顏色還出現(xiàn)了綠色條紋之間出現(xiàn)淺綠色均勻細(xì)紋的變異（圖5-C）。

圖5 2.0% EMS 處理24 h 后W-17-FGFB 的果實(shí)變異情況

3 討論與結(jié)論

EMS 作為目前最有效的化學(xué)誘變方法之一，具有突變頻率高、點(diǎn)突變多等優(yōu)點(diǎn)，可以誘導(dǎo)試驗(yàn)材料發(fā)生植物學(xué)性狀的突變（臧輝和任衛(wèi)波，2018；張霞 等，2022），廣泛應(yīng)用于作物遺傳育種及種質(zhì)資源創(chuàng)新研究（楊建勝 等，2018）。研究表明，不同作物的EMS 最適宜誘變濃度、處理時(shí)間不同，齊曉花等（2019）利用1.5% EMS 處理黃瓜種子15 h，獲得的表型突變頻率為15.22%。楊建勝等（2018）對(duì)北方白菜型冬油菜進(jìn)行EMS 誘變處理，最適宜的半致死劑量處理為0.6% EMS/6 h，EMS 濃度為0.3%～0.6%時(shí)會(huì)使植株產(chǎn)生有利變異。沙國(guó)飛等（2022）研究表明，刺梨種子EMS誘變的最適條件為濃度0.3%、浸種12 h。趙塔等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，EMS 誘變處理黨參種子的適宜條件為4.0%濃度處理4 h。程蛟文等（2019）最終確定苦瓜種子EMS 誘變處理的最佳條件為1.5%EMS/2 h 或1.2% EMS/2 h。同一物種的不同品種間EMS誘變處理的最適宜條件亦不同，侯艷等（2016）以西瓜品系W1-17 為試驗(yàn)材料，得到最適宜半致死劑量為1.0% EMS/9 h。王春霞等（2021）以西瓜種質(zhì)M08 為試驗(yàn)材料進(jìn)行EMS 誘變處理，篩選出1.5%濃度處理12 h 或1.0%濃度處理24 h 為最適宜誘變條件。本試驗(yàn)中，西瓜高代自交系W-17-FGFB的最適宜半致死劑量為2.0% EMS處理24 h。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同處理時(shí)間在2.0% EMS濃度條件下，對(duì)西瓜種子萌發(fā)以及植株生長(zhǎng)均有明顯的影響。另外，W-17-FGFB 經(jīng)2.0% EMS 誘變處理后，3個(gè)處理時(shí)間的單果質(zhì)量均顯著低于對(duì)照，說明EMS 誘變可影響西瓜果實(shí)產(chǎn)量，濃度越高其產(chǎn)量受到影響程度越大，這與黎詩(shī)艷等（2021）的研究結(jié)果是一致的。根據(jù)調(diào)查的田間性狀可以看出，2.0% EMS 分別處理12、16、24 h 后，發(fā)芽率、始花節(jié)位、果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、單果質(zhì)量等性狀與1.5% EMS 處理12、16、24 h 后的植株存在明顯差異，而EMS濃度低于1.5%的各處理間差異較小，因此本試驗(yàn)認(rèn)為2.0% EMS 濃度條件對(duì)于誘導(dǎo)西瓜突變體較有益。

豐富的種質(zhì)資源是西瓜遺傳育種和生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，EMS 誘變處理后W-17-FGFB 的花器官、葉形、葉色等突變類型豐富，出現(xiàn)了葉片白化、缺刻、卷曲、畸形、黃化、葉色加深或變淺、葉形改變，花器官畸形、3～8 瓣花瓣、花瓣皺縮卷曲、花變大、花連座、花瓣顏色變白、雌花多柱頭等突變，這與前人在黃瓜上的研究結(jié)果相似（何書強(qiáng)，2019；薛紅霞 等，2019）；還獲得了果皮出現(xiàn)淺綠色均勻細(xì)紋、果實(shí)變大、節(jié)間變粗、側(cè)枝減少等優(yōu)異突變。其中西瓜植株側(cè)枝減少有利于節(jié)省人力，提高生產(chǎn)效率，適宜輕簡(jiǎn)化栽培。但要確定這些變異是否為可遺傳的穩(wěn)定變異，還需要進(jìn)一步對(duì)M2群體進(jìn)行研究。