韋建明 黃 鑫 米 娜 張大龍 李云洲*

（1 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

番茄（Solanum lycopersicum）是現(xiàn)代蔬菜的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，也是鄉(xiāng)村振興的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)（聶大杭 等，2022）。隨著全球溫室氣體的不斷排放，全球溫度的不斷升高，干旱已經(jīng)成為威脅番茄安全生長的重要因素之一（Sunarti et al.，2022），因此提升栽培番茄抗旱能力對(duì)保障我國番茄安全生產(chǎn)具有重要意義。

干旱脅迫早期可以激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)途徑（Li et al.，2017；Mo et al.，2021），MAPK 級(jí)聯(lián)信號(hào)由三級(jí)組成：MAPKKK、MAPKK、MAPK，MAPK 處于整個(gè)級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)下游位置，在番茄基因組中有16 個(gè)SlMAPKs（Kong et al.，2012），其中SlMAPK1、SlMAPK2、SlMAPK3以及SlMAPK6參與番茄抗旱防御反應(yīng)（Li et al.，2013）。脫落酸（abscisic acid，ABA）在植物抗旱過程中發(fā)揮重要作用（Lucas et al.，2013），9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）和脫落酸8’-羥化酶（ABA 8’-hydroxylase，ABAH）是ABA 合成通路中的關(guān)鍵酶，而NCED1和CYP7070A1是番茄中ABA 合成與代謝的關(guān)鍵基因（Nitsch et al.，2009）。ABA 可以通過調(diào)控番茄葉片氣孔關(guān)閉影響葉片蒸騰速率和植株抗旱性（Li et al.，2021）。另外，番茄在干旱脅迫后會(huì)激發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，累積超氧陰離子和過氧化氫（H2O2）（Das &Roychoudhury，2014；Hu et al.，2017；Podgórska et al.，2017）。抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等在保護(hù)細(xì)胞膜免受H2O2、破壞等方面發(fā)揮重要作用（Gill &Tuteja，2010；Miller et al.，2010；Das &Roychoudhury，2014；Hernández et al.，2016）。

嫁接是解決番茄抗旱的方法之一，該方法簡單、高效、經(jīng)濟(jì)（Marsic et al.，2018），通過嫁接可以將兩種不同性狀的植株連接在一起，其中一種作為地下部分，稱為砧木，另一種作為地上部分，稱為接穗（潘可可 等，2022）。嫁接可以將砧木中的抗性基因轉(zhuǎn)移至接穗中，提高接穗的抗性（蔣夢(mèng)婷 等，2019）。Zhang 等（2019）報(bào)道，嫁接番茄可以緩解植株活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，提高植株光合能力和對(duì)干旱的耐受性。

本試驗(yàn)通過傳統(tǒng)嫁接技術(shù)分析貴州半野生番茄GZ-01 砧木在提高嫁接植株耐旱性方面的作用，通過比較嫁接植株及果實(shí)生長生理表型與ABA、MAPK 級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，挖掘GZ-01提高嫁接植株耐旱性機(jī)制，以期為貴州本土特色番茄砧木資源的開發(fā)利用提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅果番茄R（干旱敏感型）、粉果番茄P（耐旱型）和半野生番茄GZ-01 均來自貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室，其中GZ-01 被用作砧木，R和P 作為接穗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020 年6 月至2022 年6 月在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院進(jìn)行。種子經(jīng)過溫湯浸種后在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行催芽，催芽溫度為（28±2）℃，3 d 后露白，播種于育苗缽（5.0 cm×5.0 cm×10.0 cm）并放置在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行基質(zhì)培養(yǎng)生長，生長溫度為（25±2）℃，光/暗周期為16 h/8 h，待幼苗長至3～4片真葉時(shí)采用切接法進(jìn)行嫁接。試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)處理：嫁接植株RGZ-01（R 為接穗，GZ-01 為砧木）和PGX-01（P 為接穗，GZ-01 為砧木）。以R、P 和GZ-01 番茄植株作為實(shí)生苗對(duì)照，RR、PP 為自嫁接植株對(duì)照。嫁接后，用透明的塑料保鮮膜覆蓋保水，便于嫁接苗傷口愈合，在弱光處放置24 h。每天8：00 和17：00 輕輕打開塑料保鮮膜以降低相對(duì)濕度，并在嫁接7 d 后轉(zhuǎn)移至人工培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為（25±1）℃，光/暗周期為16 h/8 h，采用霍格蘭氏營養(yǎng)液進(jìn)行澆灌（Sanchez-Rodriguez et al.，2010），14 d 后轉(zhuǎn)移至溫室中進(jìn)行脅迫處理。干旱脅迫采用20% PEG-6000 溶液澆灌植株根部，每天8：00 和17：00 各澆1 次，每次澆灌100 mL，連續(xù)澆灌7 d，每處理30 株。

1.3 嫁接植株及果實(shí)生長生理指標(biāo)測定

干旱處理7 d 后，每處理隨機(jī)選取3～5 株，測定植株從上往下數(shù)第3～5 片真葉鮮質(zhì)量和根部鮮質(zhì)量，然后將葉片和根通過烘箱進(jìn)行干燥，測定葉片和根部干質(zhì)量；使用便攜式葉綠素測定儀（型號(hào)：CL-01）測定從上往下數(shù)第3～5 片真片的葉綠素含量；采用外滲電導(dǎo)法測定從上往下數(shù)第3～5片真葉的相對(duì)電解質(zhì)滲漏率（REL）（李福德 等，2019）；使用游標(biāo)卡尺測量葉長、葉寬、節(jié)長、莖粗。

綠熟期、成熟期每處理隨機(jī)選取10 個(gè)果實(shí)，使用游標(biāo)卡尺測量果實(shí)橫徑、縱徑。

1.4 葉片失水率測定和氣孔形態(tài)觀察

干旱處理7 d 后，每處理隨機(jī)選取3～5 株，將從上往下數(shù)第3 片真葉取下并立即稱重記作初始重量W0，之后分別在葉片離體0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 時(shí)測重記作Wt，計(jì)算葉片失水率。

干旱處理7 d 后，取從上往下數(shù)第3 片真葉，用鑷子剝離背面表皮放置在載玻片上，加蓋玻片后在高景深顯微鏡（型號(hào)：VHX-7000）下進(jìn)行氣孔開閉狀態(tài)的觀察與拍攝，并參照Xue 等（2021）的方法在葉片離體3.0 h 時(shí)統(tǒng)計(jì)氣孔開放狀態(tài)比例，每處理隨機(jī)觀察10 片葉片。

葉片失水率＝（W0-Wt）/W0×100%

1.5 防御酶活性測定

參照Shu 等（2021）的方法，分別取干旱處理1、3、5、7 d 時(shí)從上往下數(shù)第3～5 片真葉進(jìn)行液氮速凍，用于苯丙氨酸解氨酶幾丁質(zhì)酶（CHI）、β-1，3-葡聚糖酶（GLU）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的提取及活性測定。每處理隨機(jī)測定3～5 株。

1.6 抗氧化酶活性測定

參照Xu 等（2012）的方法，分別取干旱處理0、2、4 d 時(shí)從上往下數(shù)第3～5 片真葉，測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性。每處理隨機(jī)測定3～5 株。

1.7 過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（）含量測定

干旱處理0、1、2、3、4、5、6、7 d，分別取植株從上往下數(shù)第3～5 片真葉，參照Xu 等（2012）的方法測定H2O2含量，使用超氧陰離子含量檢測試劑盒〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕測定含量；干旱處理0、4 d 時(shí)葉片中H2O2和的積累量分別通過3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和硝基藍(lán)四唑（NBT）染色法進(jìn)行染色、拍照，具體方法參考Li 等（2017）的方法。每處理隨機(jī)測定3～5 株。

1.8 基因相對(duì)表達(dá)量測定

取干旱處理0、3 h 時(shí)植株生長點(diǎn)葉片0.5 g，液氮速凍備用。RNA 提取使用總RNA 提取試劑盒（南京諾維贊生物科技有限公司；型號(hào)：R401-01），反轉(zhuǎn)錄采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript1st Strand cDNA Synthesis Kit；型號(hào)：R211-01）。使用CFX96TMReal-time System 熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）進(jìn)行qRT-PCR。以Actin作為內(nèi)參基因，對(duì)不同處理番茄葉片的基因表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理。所有基因特異性引物序列如表1 所示。qRT-PCR 反應(yīng)體系：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析所用引物序列

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用GraphPad Prism 8 軟件作圖。采用SPSS v24.0 軟件進(jìn)行方差分析，運(yùn)用Duncan’s 新復(fù)極差法比較各處理的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下嫁接植株及果實(shí)生長生理指標(biāo)測定

由圖1 可知，干旱脅迫下，未嫁接（R、P、GZ-01）、嫁接（RGZ-01、PGZ-01）和自嫁接（RR、PP）番茄植株底部葉片均逐漸變黃，但RGZ-01 和PGZ-01 的株高明顯高于其他植株。RGZ-01 的葉綠素含量、葉長、葉寬、莖粗、坐果率、葉干鮮質(zhì)量、根干鮮質(zhì)量均顯著高于相應(yīng)對(duì)照R，但其節(jié)長和相對(duì)電解質(zhì)滲漏率顯著低于R；PGZ-01 除葉長、葉寬與相應(yīng)對(duì)照P 無顯著差異外，其他指標(biāo)測定結(jié)果與RGZ-01 一致，且節(jié)長和根鮮質(zhì)量顯著高于RGZ-01。RR、PP 的葉綠素含量和葉干質(zhì)量分別顯著高于相應(yīng)對(duì)照R 和P，但葉長、葉寬、葉鮮質(zhì)量、根干鮮質(zhì)量和相對(duì)電解質(zhì)滲漏率均與R、P 無顯著差異。

以GZ-01 為砧木的嫁接番茄植株RGZ-01 和PGZ-01 的坐果率均顯著高于未嫁接（R、P）和自嫁接植株（RR、PP）（圖1），且PGZ-01 綠熟期和成熟期果實(shí)的橫、縱徑均高于其他植株（圖2）。綜上表明，GZ-01 砧木能夠增強(qiáng)嫁接植株的耐旱性，且耐旱接穗P 與GZ-01 嫁接更加削弱了干旱誘導(dǎo)的生長抑制。

圖1 干旱脅迫下GZ-01 砧木對(duì)嫁接植株生長生理指標(biāo)的影響

圖2 干旱脅迫下GZ-01 砧木對(duì)嫁接植株果實(shí)生長的影響

2.2 干旱脅迫下嫁接植株葉片失水率測定和氣孔形態(tài)觀察

不同干旱處理番茄植株離體葉片失水率及氣孔形態(tài)變化如圖3 所示，離體葉片均隨時(shí)間變化持續(xù)失水，在干旱處理3.0 h 時(shí)，嫁接植株RGZ-01、PGZ-01 與自嫁接植株RR、PP 的水分散失率分別為12.57%、10.35%、16.59%和14.95%；且不同處理植株葉片氣孔均呈現(xiàn)3 種狀態(tài)，分別為關(guān)閉狀態(tài)、半開閉狀態(tài)和關(guān)閉狀態(tài)。葉片離體3.0 h 時(shí)，未嫁接番茄植株的氣孔開放狀態(tài)比例為75.94%（R）、75.59%（P）和61.83%（GZ-01），嫁接植株氣孔開放狀態(tài)比例為15.29%（RGZ-01）和7.64%（PGZ-01），自嫁接植株氣孔開放狀態(tài)比例為19.89%（RR）和14.08%（PP）；RGZ-01、PGZ-01 的氣孔關(guān)閉狀態(tài)比例均高于其他植株，其中嫁接番茄PGZ-01的氣孔關(guān)閉狀態(tài)比例最大。以上結(jié)果均表明，以GZ-01 為砧木的嫁接番茄植株在干旱脅迫下抗性更強(qiáng)，且耐旱接穗P 與GZ-01 嫁接耐旱性更強(qiáng)。

圖3 干旱脅迫下GZ-01 砧木對(duì)嫁接植株離體葉片失水率和氣孔形態(tài)的影響

2.3 干旱脅迫下嫁接植株防御酶活性測定

由表2 可知，除干旱處理1 d 后的PPO 活性外，嫁接植株P(guān)GZ-01、RGZ-01 的CHI、GLU、PAL和PPO 活性均高于未嫁接植株R、P、GZ-01 和自嫁接植株RR、PP。其中，干旱處理3 d 時(shí)，RGZ-01 和PGZ-01 的CHI 活性最大；干旱處理5 d 時(shí)，RGZ-01 和PGZ-01 的GLU 和PPO 活性最大；干旱處理1 d 時(shí)，RGZ-01 和PGZ-01 的PAL 活性最大，且PGZ-01 的防御酶活性均高于RGZ-01。

表2 干旱脅迫下GZ-01 砧木對(duì)嫁接植株防御酶活性的影響

2.4 干旱脅迫下嫁接植株抗氧化酶活性和H2O2、含量測定

由圖4 可知，干旱處理0 d 時(shí)，未嫁接、嫁接與自嫁接植株的抗氧化酶活性并無顯著性差異，而干旱處理2、4 d 時(shí)，嫁接植株（RGZ-01、PGZ-01）抗氧化酶活性均顯著高于未嫁接植株（R、P、GZ-01）和自嫁接植株（RR、PP），且PGZ-01 抗氧化酶活性均高于RGZ-01。其中，干旱脅迫2 d時(shí)，PGZ-01 的SOD、POD、CAT 和APX 活性分別比RGZ-01 高2.63%、7.67%、19.59%和6.27%。干旱脅迫4 d 時(shí)，PGZ-01 的SOD、POD、CAT 和APX活性分別比RGZ-01 高6.02%、10.24%、11.83%和15.62%；PP 抗氧化酶活性均顯著高于其對(duì)應(yīng)實(shí)生苗，RR 除CAT 外，其他抗氧化酶活性均顯著高于其對(duì)應(yīng)實(shí)生苗。

圖4 干旱脅迫下GZ-01 砧木對(duì)嫁接植株抗氧化酶活性和H2O2、積累的影響

干旱處理后各處理番茄植株H2O2和含量迅速激增，并均在干旱處理4 d 時(shí)達(dá)到最大，而后隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，H2O2和含量呈下降趨勢(shì)，直至7 d 時(shí)達(dá)到最低，且嫁接植株RGZ-01、PGZ-01 的H2O2和含量在7 d 的干旱處理過程中均低于自嫁接和未嫁接番茄植株；其中PGZ-01最低，RGZ-01 次之。通過DAB 與NBT 染色發(fā)現(xiàn)，在干旱處理0 d 時(shí)，未嫁接、自嫁接和嫁接番茄植株的H2O2、積累并無明顯差異；干旱處理4 d 時(shí)，未嫁接和自嫁接番茄植株的葉片有大面積黃褐色與深藍(lán)色斑塊產(chǎn)生，并有不斷向四周擴(kuò)散的趨勢(shì)，而嫁接植株P(guān)GZ-01 和RGZ-01 僅有少量淺黃色斑塊和藍(lán)色斑點(diǎn)產(chǎn)生。綜上表明，GZ-01砧木能夠通過嫁接調(diào)節(jié)接穗抗氧化酶活性和減少H2O2、的積累量，具有清除植株體內(nèi)活性氧，從而減輕植株的ROS 損傷。

2.5 干旱脅迫下嫁接植株ABA 和MAPKs 防御相關(guān)基因的表達(dá)量測定

為探究GZ-01 砧木增強(qiáng)嫁接植株抗旱的分子機(jī)制，測定了不同嫁接處理番茄葉片ABA、MAPKs 信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)（圖5）。與干旱脅迫0 h 相比，脅迫3 h 后不同嫁接處理番茄葉片中除SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK6外，SlNCED1、SlCYP301A1、SlMAPK3基因表達(dá)量均升高；此外，PGZ-01 和RGZ-01 葉片中其他防御相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他植株，其中PGZ-01 防御相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量均為最高。以上結(jié)果表明，在干旱脅迫誘導(dǎo)下，GZ-01 砧木能夠通過嫁接調(diào)控MAPK 級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑、ABA 信號(hào)途徑參與干旱脅迫的抗性反應(yīng)，在嫁接番茄植株抵御干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。

圖5 干旱脅迫下GZ-01 砧木對(duì)嫁接植株ABA 和MAPKs 防御相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

本試驗(yàn)通過20% PEG-6000 溶液模擬干旱脅迫發(fā)現(xiàn)，MAPKs 防御相關(guān)基因在參與調(diào)控植株耐旱性中發(fā)揮重要作用，這個(gè)結(jié)果在Wang 等（2017）的研究中被證實(shí)，該研究通過CRISPR-Cas9 技術(shù)敲除番茄SlMAPK3，發(fā)現(xiàn)敲除株系對(duì)干旱更敏感。另外，張龍等（2021）通過過表達(dá)SlMAPK3發(fā)現(xiàn)可以提高番茄植株的田間抗旱性。除SlMAPK3外，過表達(dá)SlMAPK1同樣可以提高番茄植株對(duì)干旱的抗性（Wang et al.，2018）。這與在擬南芥中報(bào)道的MAPK3/6 蛋白參與系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性一致（Beckers et al.，2009；岳寧波 等，2020）。此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)GZ-01 砧木能夠影響接穗葉片氣孔開閉比例，進(jìn)而影響葉片蒸騰速率，從而直接影響植株耐旱性。Xue 等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，MAPK 級(jí)聯(lián)信號(hào)關(guān)鍵蛋白MAPK3/6 底物MAPK Substrates in the Stomatal Lineage（MASS）蛋白可以影響氣孔發(fā)育。Lampard 等（2008）報(bào)道，MAPK 級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)中MKK4/MKK5 或MPK3/MPK6 關(guān)鍵蛋白功能喪失會(huì)破壞氣孔及葉片表皮細(xì)胞，導(dǎo)致氣孔簇的形成。而本試驗(yàn)中，GZ-01 砧木嫁接植株中MAPK 級(jí)聯(lián)信號(hào)關(guān)鍵基因SlMAPK1、SlMAPK2、SlMAPK3的表達(dá)量明顯增加，但并未發(fā)現(xiàn)氣孔簇的形成，推測GZ-01 砧木通過MAPK 級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控氣孔開閉，從而影響接穗的蒸騰量和耐旱性，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

除MAPKs 外，Danquah 等（2014）報(bào)道ABA信號(hào)在調(diào)控干旱脅迫方面也發(fā)揮著重要作用。Liu 等（2016）發(fā)現(xiàn)ABA 可以通過調(diào)節(jié)氣孔開閉影響植株抗旱性。本試驗(yàn)中，干旱脅迫下GZ-01砧木嫁接植株的ABA 合成相關(guān)基因SlNCED1和SlCYP701A1的表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)了ABA 的累積，從而促使氣孔關(guān)閉，減少水分蒸騰作用，增強(qiáng)植株的耐旱性。而MAPK 級(jí)聯(lián)信號(hào)通路參與調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞ABA 信號(hào)，從而影響植株的抗旱性（Liu et al.，2022）。因此，本試驗(yàn)中GZ-01 作為砧木嫁接可以提高嫁接植株的耐旱性，推斷可能是通過調(diào)節(jié)MAPK 級(jí)聯(lián)信號(hào)關(guān)鍵蛋白激酶SlMAPK3 的活性，影響ABA 信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)氣孔開閉，從而提高植株的耐旱性。

Luna 等（2005）報(bào)道干旱脅迫可以誘導(dǎo)植物ROS 的累積，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化和造成細(xì)胞膜損傷，進(jìn)而對(duì)整個(gè)植株造成損害。本試驗(yàn)條件下，RGZ-01與PGZ-01 番茄植株中H2O2和含量始終低于其他植株，而PGZ-01 的H2O2和含量又始終低于RGZ-01。表明GZ-01 砧木能夠清除嫁接植株ROS，增強(qiáng)嫁接植株耐旱性，且耐旱性強(qiáng)弱與接穗植株有關(guān)。由于接穗R 和P 的耐旱性不同，推測相同砧木嫁接植株的耐旱性取決于接穗耐旱性；也可能是不同接穗和砧木的親和性不同，導(dǎo)致同樣砧木不同接穗的嫁接植株耐旱性存在差異。

4 結(jié)論

以半野生番茄GZ-01 作砧木進(jìn)行嫁接可以通過降低嫁接植株葉片氣孔開放狀態(tài)比例，提高防御酶及抗氧化酶活性，降低植株葉片中ROS 的積累來緩解干旱脅迫對(duì)植株葉片細(xì)胞的損傷；通過誘導(dǎo)嫁接植株中MAPK 介導(dǎo)的信號(hào)通路和ABA 相關(guān)防御基因的表達(dá)，最終增強(qiáng)嫁接植株的耐旱性，且耐旱性強(qiáng)弱與接穗植株相關(guān)。