劉敏，趙雯，萬林春

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

丁香為桃金娘科植物丁香Eugenia caryophllataThunb.的干燥花蕾，當(dāng)花蕾由綠色轉(zhuǎn)紅時采摘，曬干［1］。丁香始載于《名醫(yī)別錄》［2］，別名“雞舌香”“丁子香”“公丁香”［3］。丁香中含大量揮發(fā)油，為酚類、酯類、烯類等成分；具有良好的抗菌、抗氧化、麻醉止痛作用［4-5］。丁香是藥食同源的藥材，在臨床、藥品、食品、香精香料等方面多有研究與運用［6-8］。

目前，丁香質(zhì)量控制項為丁香酚，采用外標(biāo)法（ESM）進(jìn)行含量測定。然而，丁香中有效成分較多，僅控制丁香酚一項指標(biāo)難以反映丁香的整體質(zhì)量。一測多評（QAMS）法通過測定內(nèi)標(biāo)物的含量，以內(nèi)標(biāo)物與其他待測物間的檢測響應(yīng)值的比例關(guān)系（相對校正因子），來計算其他待測物的含量［9-10］。因此，QAMS 能夠解決對照品缺失和昂貴的問題，還能夠提高方法的實用性，可以有效地、全面地控制中藥的質(zhì)量［11-12］。目前，一測多評法已成功應(yīng)用于連翹、廣藿香、蒼術(shù)、砂仁等揮發(fā)性藥材的質(zhì)量評價中［13-16］。而有關(guān)于丁香的一測多評方法的構(gòu)建未見報道。本課題擬建立丁香一測多評法，為丁香的質(zhì)量控制方法進(jìn)行補充，并為中藥的品質(zhì)評價方法研究提供參考。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

Agilent 6890N 氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；GC-2010 氣相色譜儀（日本島津公司）；Agilent DBWAX 毛細(xì)管柱（30 m ×0.32 mm，0.25 μm；美國安捷倫公司）；SH Rtx-WAX毛細(xì)管柱（30 m ×0.32 mm，0.25 μm；日本島津公司）；BT25S 型電子天平、BSA124SCW 型電子天平［賽多利斯（北京）有限公司］。

1.2 試劑

均為分析純試劑。

1.3 試藥

丁香酚對照品（110725-201615，含量99.3%）購于中國食品藥品檢定研究院，β-石竹烯對照品（0001321406，含量98.5%）購于美國SIGMA 公司，α-石竹烯對照品（Z25M8H36799，含量93.0%）、乙酸丁香酚酯對照品（Z25M8H36798，含量98.0%）均購于上海源葉生物科技有限公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。本試驗收集的21 批次丁香樣品為國家藥品評價性抽驗（2017 年）樣品，樣品信息見表1。

圖1 丁香四個成分化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件采用FID 檢測器，DB-WAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），載氣為N2，流速25 mL/min，H2 流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，柱溫170 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃；檢測器溫度300 ℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1。在上述色譜條件下，混合對照品和丁香樣品色譜圖見圖2。

圖2 色譜圖：A.混合對照品；B.丁香樣品

2.1.2 混合對照品溶液制備取丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯適量，精密稱定，加正己烷溶解，配制成含丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯分別為2.125 0、0.402 6、0.046 1、0.434 7 mg/mL 的混合對照品溶液，置于8℃冰箱保存，備用。

2.1.3 供試品溶液制備取丁香樣品，粉碎，過24目篩，取過篩的丁香粉末約0.3 g，精密稱定，精密加入正己烷20 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）15 min，放置至室溫，再稱定重量，用正己烷補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察精密吸取混合對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL 注入氣相色譜儀，檢測各色譜峰。以對照品進(jìn)樣質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積（X）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。保留時間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表2。

表2 線性關(guān)系試驗結(jié)果（n=3）

2.1.5 精密度試驗精密稱取同一丁香樣品（批號：316040085），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定四種化合物峰面積。結(jié)果測得丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯峰面積的RSD 分別為1.3%、1.3%、1.3%、1.3%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24h測定各時間點下4 種化合物色譜峰面積，計算4 種化合物色譜峰面積的RSD。結(jié)果丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯峰面積的RSD 分別為1.5%、1.4%、1.9%、1.7%。表明供試品中4 種化合物在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗精密稱取同一丁香樣品（批號：316040085）6 份，按“2.1.3”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定。測得丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯平均含量分別為147.208 4 mg/g、12.408 1 mg/g、1.642 5 mg/g、23.464 7 mg/g，RSD 分別為2.0%、1.4%、1.7%、2.0%。結(jié)果表明試驗方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率考察精密稱取同一丁香樣品（批號：316040085）6 份，每份0.15 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入每1 mL 含有丁香酚1.146 62 mg、β-石竹烯0.095 69 mg、α-石竹烯0.012 98 mg、乙酸丁香酚酯0.183 46 mg 的混合對照品正己烷溶液20 mL。按“2.1.3”項下方法制備回收率樣品，按“2.1.1”項下色譜條件，測定4 種化合物色譜峰，分別計算丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯的加樣回收率以及RSD。結(jié)果見表3，表明方法回收率良好。

表3 丁香中四種活性成分的加樣回收率（n=6）

2.2 相對校正因子計算

2.2.1 丁香待測指標(biāo)相對校正因子計算依次精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL 分別進(jìn)樣，測定各成分色譜峰峰面積。以丁香酚為內(nèi)參物，計算β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯相對于丁香酚的f 值，結(jié)果見表4。

表4 相對校正因子

2.2.2 一測多評法的耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評價精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液，采用DB-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）、Rtx-WAX（30 m×0.32 mm×0.25 μm）兩種色譜柱，分別在Agilent 7890N、島津GC-2010 氣相色譜儀上進(jìn)樣分析，記錄4 種化合物色譜峰面積，計算以丁香酚為內(nèi)參物的β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚的相對校正因子，結(jié)果見表5。結(jié)果表明β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚的相對校正因子重現(xiàn)性良好。

表5 不同儀器及色譜柱測得的相對校正因子

2.3 一測多評法待測色譜峰的定位

為準(zhǔn)確定位待測色譜峰,試驗分別用混合對照品溶液考察相對保留值和保留時間差在兩根不同的毛細(xì)管柱及兩臺不同的氣相色譜儀中的重現(xiàn)性。結(jié)果見表6，相對保留值的RSD 均小于2.0%，保留時間差的RSD 均小于8.0%；表明用相對保留值來定位色譜峰較為合理。

表6 不同儀器和色譜柱測得的相對保留值

2.4 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較

分別精密吸取21 批次按“2.1.3”項下制備的丁香供試品溶液1 μL，用“2.1.1”項下色譜條件測定4 種化合物的峰面積。采用外標(biāo)法和“一測多評”法分別計算丁香中丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯的含量，結(jié)果見表7。結(jié)果21 批丁香樣品中4 種化學(xué)成分（丁香酚、β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯）的一測多評法計算值與外標(biāo)法實測值之間相對誤差不超過3.0%。表明一測多評法用于丁香的多成分質(zhì)量評價研究是可行的。

表7 丁香中4種成分外標(biāo)法和一測多評法含量測定比較（n=3） %

3 結(jié)論與討論

丁香中含有多種揮發(fā)性成分，其中丁香酚的含量高、穩(wěn)定性高，價格低廉易得，故選定丁香酚作為內(nèi)標(biāo)物。試驗研究建立了以丁香酚為內(nèi)標(biāo)物，一測多評法同時測定丁香中β-石竹烯、α-石竹烯、乙酸丁香酚酯的含量，結(jié)果表明，建立的方法便捷、高效、專屬性強。采用一測多評法和外標(biāo)法分別測定21 批丁香中四種揮發(fā)性成分的含量，結(jié)果顯示兩種方法測定結(jié)果的絕對誤差不超過3.0%，表明一測多評法在缺少部分對照品的情況下，能夠?qū)崿F(xiàn)對丁香藥材的多指標(biāo)成分含量測定，并對丁香的質(zhì)量進(jìn)行更加全面的評價，為全面提升丁香藥材的質(zhì)量提供了新方法。