鐘振華，陳雨萍，程奇珍，夏紅英

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029

藥物中甲磺酸酯類雜質(zhì)主要是在原料藥（API）合成過程由甲磺酸或甲磺酰氯與殘留的甲醇、乙醇等醇類試劑反應(yīng)而產(chǎn)生［1］。目前甲磺酸甲酯已被世界衛(wèi)生組織明確為2A 類致癌物，甲磺酸乙酯已被明確為2B 類致癌物［2-3］，其余的甲磺酸酯類化合物因存在疑似基因毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，在藥物分析中也被重點關(guān)注。按照歐洲藥物評審機構(gòu)（EMEA）及國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）所發(fā)布的關(guān)于基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則的規(guī)定，甲磺酸酯類物質(zhì)毒理性方面的閾值（TTC）為1.5 μg/d［4-6］。

注射用鹽酸吉西他濱主要用于治療胰腺癌及非小細胞肺癌，具有抗腫瘤譜廣、藥物毒性低、無交叉耐藥等優(yōu)點，為人工合成的新型二氟核苷類抗腫瘤藥［7-9］。從國內(nèi)鹽酸吉西他濱原料藥制備工藝流程分析，鹽酸吉西他濱合成過程中所用到活化劑甲磺酰氯以及醇類溶劑容易反應(yīng)產(chǎn)生甲磺酸酯類雜質(zhì)，易造成注射用鹽酸吉西他濱含有甲磺酸酯類雜質(zhì)的可能［10-11］。因此，在微量水平上建立注射用吉西他濱中甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的定性定量方法用于日常檢驗或藥品質(zhì)量控制是非常有必要的。

本研究通過氣相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（GC-MS/MS）建立了注射用吉西他濱中甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯、甲磺酸丙酯及甲磺酸丁酯等五種甲磺酸酯類雜質(zhì)的定性定量測定方法。本方法采用具備靈敏度高、準確性和特異性強等優(yōu)勢的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式監(jiān)測，能夠降低藥物基體效應(yīng)對待測成分的干擾，從而保證檢測方法靈敏度高、專屬性強，達到了在微量水平上準確檢測甲磺酸酯類雜質(zhì)的要求，為保障用藥安全提供技術(shù)參考［12-17］。

1 實驗部分

1.1 儀器、對照品及試劑

氣相色譜-質(zhì)譜儀（7890B-7000C，安捷倫）。二氯乙烷（1,2-二氯乙烷）（TCI Shanghai，批號：P1529190，色譜純），乙酸乙酯（LiChrosolv，批號：10942649812，色譜純）。甲磺酸甲酯對照品（SIGMAALORICH，批號：MKCG1346，含量：>99%），甲磺酸乙酯對照品（SIGMA-ALORICH，批號：BCBW8635，含量：>99%），甲磺酸異丙酯對照品（Thermo Fisher，批號：A031422，含量：>98.0%），甲磺酸丙酯對照品（TCI Shanghai，批號：G6G6L-OM，含量：>99%），甲磺酸丁酯對照品（J&K Scientific，批號：LS20S35，含量：>98.5%）。

1.2 樣品信息

注射用吉西他濱樣品涉及6 家生產(chǎn)企業(yè)16 批次樣品，規(guī)格均為0.2 g。分別為A 企業(yè)5 批次樣品，樣品批號分別為181021、181123、181116、181122、181211；B 企業(yè)2 批次樣品，樣品批號分別為E1811012、E1 810012；C 企業(yè)3 批次樣品，樣品批號分別為181214、190107、181210；D 企業(yè)2 批次樣品，樣品批號分別為181026、181025；E 企業(yè)2 批次樣品，樣品批號分別為20180706、20 180705；F 企業(yè)2 批次樣品，樣品批號分別為AA1D8020B、AA1D8024B。

1.3 儀器條件

色譜柱：VF-624 ms 石英毛細管柱（60 m×0.25 mm×1.4 μm）；測定條件：色譜柱柱溫：起始溫度為120 ℃，以10 ℃/min 的升溫速率將柱溫升溫至250 ℃，保持5 min；進樣口溫度：250 ℃；載氣柱流速：1.0 mL/min；進樣模式：分流進樣；分流比：10∶1；進樣量：1 μL；EI 源溫度：230 ℃；EI 源能量：70 eV；延遲時間：6.5 min。

離子對選擇及碰撞能信息見表1。

表1 甲磺酸酯5種MRM模式參數(shù)及碰撞能

1.4 實驗方法

系列質(zhì)量濃度對照品溶液的配制：取甲磺酸甲酯對照品、甲磺酸乙酯對照品、甲磺酸異丙酯對照品、甲磺酸丙酯對照品及甲磺酸丁酯對照品各10 mg，精密稱定，置同一10 mL 量瓶中，加入二氯乙烷5 mL 振搖使溶解，并用二氯乙烷稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置200 mL 量瓶中，用二氯乙烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品混合貯備液（約5 μg/mL）；精密量取對照品混合貯備液0.5、1、2、3、4、5、6 mL，分別置100 mL 量瓶中，用二氯乙烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液①～⑦；即得各待測成分濃度約為25、50、100、150、200、250、300 ng/mL 系列對照品溶液。

樣品溶液的配制：取待測樣品（F 企業(yè)，批號：AA1D8024B）6 瓶（約相當于鹽酸吉西他濱1.2 g），用25 mL 二氯乙烷將樣品內(nèi)容物洗至同一50 mL 量瓶中，再加二氯乙烷15 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，用二氯乙烷稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

測定法：量取系列質(zhì)量濃度對照品溶液及樣品溶液，分別注入氣相色譜-質(zhì)譜儀分析測定，記錄色譜圖，按標準曲線法計算得各待測成分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 溶劑優(yōu)化通過比較乙酸乙酯、二氯乙烷兩種溶劑，進行溶劑優(yōu)化。結(jié)果顯示：在乙酸乙酯、二氯乙烷兩種溶劑中鹽酸吉西他濱均較難溶解，但各待測成分在上述2種溶劑中溶解性均較好。檢測中發(fā)現(xiàn)：乙酸乙酯作為溶劑，甲磺酸甲酯峰容易受溶劑峰的干擾，色譜峰前后噪聲較大，導(dǎo)致甲磺酸甲酯靈敏度較低。而用二氯乙烷作為溶劑時，甲磺酸甲酯無溶劑峰干擾，基線噪聲較低，各待測成分靈敏度較高。詳見圖1、圖2。

圖1 二氯乙烷為提取溶劑時對照品溶液色譜圖

圖2 乙酸乙酯為提取溶劑時對照品溶液色譜圖

2.1.2 色譜柱優(yōu)化通過比較DB-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、VF-624ms（60 m×0.25 mm×1.40 μm）、VF-WAXms（60 m×0.25 mm×0.25 μm）三種不同填料的毛細管色譜柱，進行色譜柱優(yōu)化。結(jié)果顯示：采用DB-5ms 毛細管色譜柱時，溶劑峰會干擾甲磺酸甲酯的測定，導(dǎo)致其靈敏度較低；采用VF-WAXms 及VF-624ms 毛細管色譜柱均能實現(xiàn)5 個待測成分的較好分離，且溶劑峰不會干擾待測成分的測定。從分離度評價，采用VF-624ms 毛細管色譜柱，各待測成分峰分離度更好。

2.2 線性關(guān)系、檢出限、定量限

取系列質(zhì)量濃度的對照溶液，按“1.4”項下測定法測定，記錄離子譜圖，以各對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，以各對照品溶液定量離子豐度為縱坐標繪制相應(yīng)的標準曲線。線性關(guān)系結(jié)果詳見表2。取“1.4”項下質(zhì)量濃度約為25 ng/mL 的混合對照品溶液①，作為定量限溶液，注入氣相色譜-質(zhì)譜儀分析測定，各待測成分峰信噪比約為10∶1；精密量取“1.4”項下質(zhì)量濃度約為25 ng/mL 的混合對照品溶液①適量，用二氯乙烷定量稀釋至各待測成分濃度約為12.5 ng/mL 的溶液作為檢出限溶液，注入氣相色譜-質(zhì)譜儀分析測定，各待測成分峰信噪比約為3∶1；結(jié)果詳見表2。

表2 待測成分線性關(guān)系結(jié)果

2.3 回收率實驗

回收率實驗供試品溶液：取待測樣品6 瓶（約相當于鹽酸吉西他濱1.2 g），用25 mL 二氯乙烷將樣品內(nèi)容物洗至同一50 mL 量瓶中，同法制備9 份，分別精密加入“1.4”項下各待測成分質(zhì)量濃度約為5 μg/mL 的對照品混合貯備液1、1、1、1.5、1.5、1.5、2、2、2 mL，加二氯乙烷15 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，用二氯乙烷稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為回收率樣品溶液。按“1.4”項下測定法測定，結(jié)果見表3。

表3 回收率實驗結(jié)果 %

2.4 精密度試驗

取“1.4”項混合對照品溶液④，按“1.4”項下測定法重復(fù)進樣測定6 次，記錄測定結(jié)果。結(jié)果詳見表4，結(jié)果顯示：各待測成分精密度RSD 在0.30%～1.87%之間，表明儀器精密度良好。

表4 精密度試驗結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗

取待測樣品6 瓶（約相當于鹽酸吉西他濱1.2 g），用25 mL 二氯乙烷將樣品內(nèi)容物洗至同一50 mL 量瓶中，同法制備6 份，精密加入“1.4”項下各待測成分質(zhì)量濃度約為5 μg/mL 的對照品混合貯備液1.5 mL，加二氯乙烷15 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，用二氯乙烷稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液測定。結(jié)果顯示：6 份樣品溶液中各待測成分重復(fù)性RSD（n=6）在0.87%～2.32%之間，表明樣品測定重復(fù)性良好。結(jié)果詳見表5。

表5 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗

取待測樣品6瓶（約相當于鹽酸吉西他濱1.2 g），用25 mL 二氯乙烷將樣品內(nèi)容物洗至同一50 mL 量瓶中，精密加入“1.4”項下各待測成分質(zhì)量濃度約為5 μg/ mL 的對照品混合貯備液1.5 mL，加二氯乙烷15 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，用二氯乙烷稀釋至刻度，搖勻，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h 時取樣濾過，取續(xù)濾液測定，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，24 h 內(nèi)，重復(fù)性樣品溶液中各待測成分穩(wěn)定性RSD 在0.76%～1.77%之間，表明在24 h 內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性較好。結(jié)果詳見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.7 樣品測定結(jié)果

16 批次注射用吉西他濱樣品中五種甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)均未檢出（或低于檢出限）。

3 結(jié)論

根據(jù)EMEA 和ICH 發(fā)行的關(guān)于基因毒性雜質(zhì)控制的相關(guān)指導(dǎo)原則要求，按藥物每日最大攝入量（MDD）計算，甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的TTC 為1.5 μg/d。注射用鹽酸吉西他濱的最大注射用量為成人一周1 000 mg/m2，按照成年人平均人體表皮面積以1.6 m2計，單個甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)在注射用鹽酸吉西他濱中的限度應(yīng)不得過6.6 ppm。注射用鹽酸吉西他濱中加入大量甘露醇等賦性劑，為保證提取充分，鹽酸吉西他濱與提取溶劑的質(zhì)量體積比為0.024 g/mL，以此計算五種待測成分的限度濃度為158 ng/mL，為“2.2”線性關(guān)系實驗的中間濃度點。從樣品測定結(jié)果得知，本次16 批次注射用鹽酸吉西他濱樣本中五種甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)均未檢出。

通過方法學(xué)驗證可知，五種待測成分的線性濃度均設(shè)置在25～300 ng/ mL，線性范圍較寬，且線性相關(guān)性好；定量限約為1.0 μg/kg，檢出限約為0.5 μg/kg，方法靈敏度較高；回收試驗結(jié)果表明各待測成分平均回收率為93.04%～100.41%，RSD（n=9）均小于3.0%，方法準確度較高；各待測成分重復(fù)性RSD 為0.87%～2.32%，精密度RSD 為0.30%～1.87%，均表現(xiàn)良好。綜上所述，本方法具有專屬性強，線性相關(guān)性好，準確度及靈敏度高的優(yōu)點，適用于注射用鹽酸吉西他濱中五種甲磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的檢測分析。