李雙鵬，劉陸濱，范采蕭

(佳木斯大學附屬口腔醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

中藥提取出一種苯乙醇類化合物，將其命名為紅景天苷，與藥物作用密切相關[1]。MMP-2 的表達與腫瘤轉移及侵襲程度密切相關，是腫瘤惡性進展的標志[2，3]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)紅景天苷在肺纖維化過程中使MMP-2及TIMP1mRNA的表達和蛋白的合成受到抑制，紅景天苷能夠抑制MMP-2、TIMP-2mRNA和蛋白的表達，恢復二者的平衡從而延緩甚至抑制纖維化的進程，保護中毒大鼠的肺組織[4]。在臨床實驗研究中已經(jīng)證實適宜濃度的紅景天苷能夠抑制MMP-1的表達[5]，因此，提出關于紅景天苷能通過調節(jié)牙源性MMPs活性的表達從而抑制牙本質膠原纖維降解和牙本質脫礦假設，來探究紅景天苷對脫礦牙本質的影響，這對防治牙齒齲壞有著重要的意義。同時也有學者發(fā)現(xiàn)紅景天苷對人重組的MMPs有抑制作用。但紅景天苷是否對牙本質中由于酸蝕活化的基質金屬蛋白酶有抑制作用尚無報道。本研究旨在探討紅景天苷對牙本質中活化MMPs的影響，擬為紅景天苷應用于臨床提高黏接效果提供理論依據(jù)。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

紅景天苷(98%)，0.2%氯己定，去離子水，新鮮無齲磨牙，MMP-2活性比色法定量檢測試劑盒，磷酸，耐水砂紙，36%乙酸，磷酸二氫鉀，慢速切割機，液氮罐，高速渦輪機，臺式離心機，酶標儀，恒溫箱，激光共聚焦顯微鏡，試管，濾紙，羅丹明。

1.2 實驗溶液及樣品的制備

1.2.1實驗溶液的配置

配置紅景天苷溶液：用去離子水配置10mmol/L紅景天苷母液，放于4℃冰箱中儲存，避光備用。在實驗中，使用去離子水稀釋母液，配置濃度分別為10、20、60、100、200、400μmmol/L的酸性脫礦液：使用去離子水，將36%乙酸和磷酸二氫鉀混合成液體，其中乙酸的所含濃度為50μmmol/L，磷酸二氫鉀的所含濃度為1.5μmmol/L，酸性脫礦液的pH值為4.5。配置中性緩沖液：將去離子水、4-羥乙基哌嗪乙磺酸和磷酸二氫鉀混合配置成液體，其中4-羥乙基哌嗪乙磺酸所含濃度為20μmmol/L，磷酸二氫鉀的所含濃度為1.5μmmol/L，中性緩沖液的pH值為7.0。

1.2.2 牙本質片的制備

選取離體牙10顆，皆來自2020-09～2020-10佳木斯大學第二附屬醫(yī)院就診患者。所有標本都是沒有齲壞的磨牙，患者因智齒周炎而需要拔除。獲取標本后仔細清理，將所附著的牙周軟組織去除，同時要清理色素及牙結石，完成后清洗干凈備用。準備冰箱，設置為-80℃，將制備好的標本置于其中保存。將新鮮離體牙的牙根部用面團期的自凝樹脂包埋，不包埋牙冠部分，造成與慢速切割機卡槽一樣的樣本，4℃生理鹽水事先準備，將處理好的離體牙立即置于其中，進行冷卻處理，然后放入慢速切割機的卡槽中，開啟慢速切割機，對牙齒進行切割。方向與牙體長軸垂直，整個過程必須要在流水持續(xù)冷卻下完成，最終形成30片(200±20)μm牙本質薄片。啟動高速旋輪機，磨除牙釉質及淺層牙本質，該過程要沿著釉牙本質界面進行。生理鹽水事先準備完成，將磨好的切片置于其中， -20℃冷凍備用。

1.2.3 實驗分組

實驗組：紅景天苷，濃度梯度分別為10、20、60、100、200、400μmmol/L；陽性對照組：0.2%氯己定；陰性對照組：去離子水。

1.3 實驗方法

1.3.1 基質金屬蛋白酶的提取

將制備的(200±20)μm厚的30個牙本質片放在凍存管中，冷凍在液氮罐里6h，將冷凍的牙本質片取出后用研缽快速研磨呈粉末狀。從粉末中用電子秤稱量出重量為1g的牙本質粉，并將其放入到試管中。將5mL的10%的磷酸溶液加入到試管中，并在4℃冰箱冷藏的環(huán)境中脫礦6h。4℃臺式離心機準備完成，將上述樣品置于其中進行離心，3000r/min,2min，分層后去上清。準備100mmol/L Tris-Hcl液體，將其加入到上述試管當中，共需要5mL，再次進行離心處理，時間與上述相同，去上清。該過程反復進行，共需要3次，完成后洗滌。準備十二烷基硫酸鈉，將其加入到試管當中，共需要5mL，進行離心處理，4℃12000r/min,20min，去上清，所余為脫礦牙本質中的MMPs。

1.3.2 基質金屬蛋白酶抑制率

對提取物進行測試，確定其中的酶活性。依體液MMP-2活性比色法定量檢測試劑盒指示，測定提取液中的酶活性大小。從96孔板中選取5個實驗待測孔，并標記好分組，移取84μL緩沖液，10μL反應液和1μL底物液到相對應的5個實驗孔中。恒溫箱準備完成，溫度設置為37℃，將孔板置于其中進行孵育，共用時3min，再分別加入30μL待測樣品，在405mm波長下，用酶標儀中進行實驗，同時計時，選取不同時間點的讀數(shù)，分別為第0、15min，記錄最終的結果。在此基礎上計算提取物酶活性，整個過程要按照試劑盒說明書完成。

各實驗分組酶活性檢測：準備緩沖液，將其移入到96孔板當中，共需要84μL，該過程嚴格按照檢測試劑盒說明書完成，同時還需要加入反應液，共10μL，另外再加1μL底物液，再取MMPs提取液，加入30μL，上述所有物質都加入到陰性對照組當中。另外在陽性對照組和實驗組中加入84μL緩沖液，其余物質也與之前相同，然后分別移取10μL去離子水，10μL的0.2%氯己定，以及不同濃度紅景天苷各10μL，將其加入到實驗組，陰性對照組，陽性對照組中，每組實驗反復重復5次，立即放入到酶標儀中讀數(shù)，酶標儀波長為405nm,然后將96孔板放進37℃恒溫箱里，15min后將96孔板放入酶標儀中測定吸光度讀數(shù)。記錄第0、15min結果，按照試劑盒公式[(完全活性讀數(shù)-空背景對照讀數(shù))-(抑制劑樣品活性讀數(shù)-樣本背景讀數(shù))]/(完全活性讀數(shù)-空背景對照讀數(shù))=實際抑制百分率，進行計算提取物酶活性抑制率。

1.3.3 牙本質試件脫礦程度

將已處理完成的15個牙本質塊備用，將其等分為3組。去離子水，紅景天苷，氯己定每組分別5個樣本。各組溶液準備完成，將分組后的試件放入其中，進行pH循環(huán)處理。不同組的處理液有所不同，可將相應的牙本質塊放置其中處置10min，(陰性對照組：去離子水組；陽性對照組:0.2%氯己定；實驗組：紅景天苷400μmol/L)中處置10min，取出后進行沖洗，需要使用去離子水，共用時1min，再用濾潮紙吸干牙本質試件上的水分，然后將其放入裝有5mL酸性脫礦液的試管中進行脫礦1h，然后用去離子水沖洗1min，再用濾潮紙吸干牙本質試件上的水分，將其放入裝有5mL中性緩沖液的試管中，緩沖液的pH為7.0，pH循環(huán)，一日二次，共10d。酸性脫礦液和中性緩沖液需要放至于恒溫搖床中，37℃條件下慢速進行，不做pH循環(huán)時，可準備中性緩沖液，將上述試件置于其中，于37℃恒溫箱中放置，中性緩沖液和處理液需要定時更換，一般間隔時間不超過24h，需要遵循現(xiàn)配現(xiàn)用的原則。使用激光共聚焦顯微鏡在529nm下觀察各個牙本質試件的形狀和染色深度，計算出每組牙本質試件的平均脫礦深度。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 紅景天苷對基質金屬蛋白酶活性的抑制率

見表1。

表1 各組樣品對基質金屬蛋白酶酶活性抑制率

2.2 紅景天苷對脫礦牙本質的影響

激光共聚焦顯微鏡3D圖像1.400μmol/L紅景天苷的染色寬度深度低于去離子水組，各組樣本脫礦深度見表2。紅景天苷脫礦深度與陰性對照組對比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但與陽性對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組樣本脫礦深度

3 討論

齲病是一種常見的牙齒疾病，多種因素可以導致其發(fā)生，細菌相對常見，它可以對底物進行分解，導致酸性物質生成，從而使局部pH值下降，使得牙本質齲壞部位病變進一步加重。由于局部呈現(xiàn)酸性，可以溶解羥基磷灰石，導致膠原纖維暴露。當齲壞部位的pH處于2.5～3時，MMPs前體發(fā)生變化，由失活狀態(tài)轉變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，唾液本身可以起到一定的稀釋作用，因此可以調節(jié)局部的酸堿度變化，使其由酸性變成中性，于是激活的基質金屬蛋白酶就水解了牙本質有機質。實驗中所用的pH循環(huán)模型已被眾多實驗[6～8]所證實。本研究需要確定不同濃度紅景天苷對MMP-2的抑制作用，整個過程需要使用酶標儀完成，結果顯示400μmol/L時結果與陽性對照組相當，因此將該濃度紅景天苷組作為實驗組，確定其耐脫礦能力， 0.2%氯己定為陽性對照組，陰性對照組是去離子水組。使用羅丹明B染料染色后，酸性脫礦液使牙本質脫礦，羅丹明B依靠其強大的滲透能力，滲入各個孔隙中。這也說明了脫礦程度越深，染色條帶越寬。從染色條帶對比情況來看，顏色較淺的是紅景天干和陽性對照組，并且整體相對較窄，顏色較深的為陰性對照組，寬度相對較寬一些。提示400μmol/L紅景天苷對于牙本質脫礦具有影響，可以有效抑制其過程。對各試件熒光強度進行觀察，該過程需要使用激光共聚焦顯微鏡[9]，根據(jù)結果確定牙本質脫礦程度，具有操作簡捷、反應快等特點，掃描后可以得到清楚的三維圖像，能夠更直觀的了解牙本質脫礦程度。從最終的脫礦程度對比情況來看，400μmol/L紅景天苷組相對較小，與陰性對照組有所差異，由此可見其能夠有效抑制牙本質脫礦，使最終的深度有所變淺，寬度變窄。