張昊 劉苗苗 劉曉娜 李宗諭 趙麗麗 楊清香

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河南省農(nóng)業(yè)微生物生態(tài)與技術(shù)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng) 453007）

藥用植物是指全部或部分可以直接用作藥物或提取藥物的植物［1］。尤其在以中醫(yī)、藏醫(yī)、印度佛教醫(yī)學(xué)為代表的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，藥用植物作為天然藥物的主要來源，為全世界大約80%的發(fā)展中國(guó)家人口提供了初級(jí)醫(yī)療保健服務(wù)［2］。調(diào)查1981-2014年間研發(fā)的新藥產(chǎn)品發(fā)現(xiàn)，即便在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)迅速發(fā)展的今天，仍有大約51%的臨床藥物來源于藥用植物中提取的天然產(chǎn)物［3］。一直以來，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為藥用植物藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量很大程度上受到植物遺傳背景、健康狀況、生長(zhǎng)環(huán)境、土壤養(yǎng)分等因素的影響。然而近年來，隨著植物微生物組學(xué)研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，內(nèi)生微生物可以通過特殊的微生物-植物相互作用，在影響藥材質(zhì)量和產(chǎn)量方面發(fā)揮重要作用。最令人感興趣的是，內(nèi)生菌提供了一個(gè)新興生物活性代謝產(chǎn)物的寶庫(kù)，尤其是生物堿、皂苷、醌類、類黃酮、萜類化合物等，至少60%的特征代謝物具有醫(yī)療和藥用潛力，可以成為抗菌、抗癌、抗病毒等多種人類疾病治療藥物的潛在候選物質(zhì)［4］。

據(jù)報(bào)道，在地球上近30萬種植物中，大約六分之一的植物具有產(chǎn)生藥用天然化合物的能力，然而，僅有少數(shù)植物的內(nèi)生生物學(xué)方面得到重視和研究［5］。中國(guó)是世界上利用和種植藥用植物歷史最為悠久的國(guó)家，天然的自然環(huán)境條件，使得我國(guó)的藥用植物資源不但蘊(yùn)藏量豐富而且還具有多樣性等優(yōu)勢(shì)。在已知的1.4萬種最常用的中藥材中，約92%來源于藥用植物。例如，重樓具有消炎抑菌、止血、抗腫瘤的作用，是云南白藥、熱毒清等中成藥的主要原料［6］；決明子能夠清除肝熱，臨床上可用于治療高脂血癥和高血壓［7］。尤其是來自特定產(chǎn)區(qū)的道地藥材，由于其藥用成分含量高、臨床效果好、毒副作用小等特點(diǎn)而廣受歡迎。因此，為了更好地促進(jìn)藥材生產(chǎn)，需要更多的了解內(nèi)生菌與藥用植物之間的特殊關(guān)系。本文綜述了內(nèi)生菌對(duì)藥用植物中藥用成分的影響，重點(diǎn)介紹了藥理活性化合物生物合成的機(jī)制問題，目的是強(qiáng)調(diào)藥用植物內(nèi)生微生物群落在天然藥物生產(chǎn)中的作用和潛力，其巨大的多樣性和生物活性，為提升藥用植物品質(zhì)以及研制新藥和新型類藥分子提供了良好研究領(lǐng)域，這些功能微生物和天然產(chǎn)物也代表了生物技術(shù)和醫(yī)療應(yīng)用的巨大資源。

1 藥用植物內(nèi)生菌多樣性

1866年，De Bary在顯微鏡下觀察植物組織時(shí)發(fā)現(xiàn)了微生物細(xì)胞的存在，并認(rèn)為“任何生長(zhǎng)在植物組織內(nèi)部的生物體都稱為內(nèi)生菌”。隨后，內(nèi)生菌的定義被眾多研究者逐一修訂，直到1991年，Petrini做出了最恰當(dāng)?shù)拿枋觥獌?nèi)生菌是指在其生活史的一定階段定殖于植物組織而不會(huì)對(duì)宿主植物造成任何傷害的任何微生物［8］。

1.1 內(nèi)生菌群落多樣性

越來越多的研究證明內(nèi)生菌是多菌群微生物，可以無癥狀的在植物的莖、葉、根、種子等不同健康組織中生長(zhǎng)，其分布和種群結(jié)構(gòu)受到宿主植物遺傳特性、健康狀況以及周圍生態(tài)環(huán)境的影響。已報(bào)道的植物內(nèi)生菌種類覆蓋原核和真核微生物類群，包括細(xì)菌、古菌、真菌以及藻類。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的16S rDNA序列可知原核內(nèi)生菌包括23個(gè)已知門成員，其中21個(gè)來自細(xì)菌門，2個(gè)來自古菌門。常見于報(bào)道的藥用植物內(nèi)生細(xì)菌有16個(gè)門，大多屬于厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria［9］。常用的分離培養(yǎng)手段和基于16S rDNA序列分析的高通量測(cè)序技術(shù)是目前解析內(nèi)生菌多樣性的主流方法，根據(jù)鑒定結(jié)果顯示，前者從每株植物可獲得的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為10-200種不等，后者則為20-600種［10］。棒桿菌屬Clavibactersp.、纖維單胞菌屬Cellulomonassp.、短桿菌屬Curtobacteriumsp.、微小桿菌屬M(fèi)icrobacteriumsp.、芽孢桿菌屬Bacillussp.和假單胞菌屬Pseudomonassp.都是常見的有定殖潛力的內(nèi)生細(xì)菌［11］。其中，放線菌屬細(xì)菌是革蘭氏陽性的絲狀細(xì)菌，多數(shù)都具有產(chǎn)生抗菌、抗癌化合物的代謝潛力。

藥用植物中的真核內(nèi)生菌主要由絲狀真菌組成。研究發(fā)現(xiàn)，不論采用何種分析方法，都顯示內(nèi)生真菌群落有非常寬泛的多樣性特征，是植物內(nèi)生菌中最豐富的優(yōu)勢(shì)類群?；趥鹘y(tǒng)培養(yǎng)的研究結(jié)果顯示，每株植物中有大約5-350種內(nèi)生真菌，而基于18S或ITS rDNA序列分析的高通量測(cè)序結(jié)果表明，每株植物可能有40-1 200種內(nèi)生真菌［10］。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分類，已報(bào)道的內(nèi)生真菌包括禾草內(nèi)生真菌和非禾草內(nèi)生真菌。前者主要侵染高寒地區(qū)草本植物，后者多存在于非維管植物、蕨類、裸子植物和被子植物的組織中，常見類群主要是形成菌絲的子囊菌門Ascomycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota和球囊菌門Glomeromycota［9］。這其中的某些屬，例如直立枝頂孢屬Acremoniumsp.、鏈格孢屬Alternariasp.、枝孢屬Cladosporiumsp.、盾殼霉屬Coniothyriumsp.、附球菌屬Epicoccumsp.、鐮刀霉屬Fusariumsp.、莖點(diǎn)霉屬Phomasp.和格孢腔菌屬Pleosporasp.在藥用植物內(nèi)生系統(tǒng)中分布十分廣泛，尤其是具有產(chǎn)生天然產(chǎn)物的生物合成能力。例如，知名中藥鴉膽子（Brucea javanica）是苦木科鴉膽子屬植物，因具有消炎、抗癌、抗瘧疾等功效而廣泛應(yīng)用于臨床治療。研究顯示，該植物中定殖有包括木霉Trichodermasp.、鐮刀霉Fusariumsp.、青霉Penicilliumsp.、曲霉Aspergillussp.等在內(nèi)的不少于83種內(nèi)生真菌，其中木霉產(chǎn)生的糖苷類化合物具有明顯的抗突變和抗氧化活性［12］。與上述非禾草內(nèi)生真菌相比，禾草內(nèi)生真菌多樣性較低，分類學(xué)上屬于麥角菌科香柱菌屬Epichlo?sp.和瘤座菌屬Balansiasp.，其顯著特點(diǎn)是通過植物種子垂直傳播，主要能產(chǎn)生抗蟲和抗脊椎動(dòng)物的生物堿類活性化合物［10］。

1.2 內(nèi)生菌功能多樣性

內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中最重要的組成之一，對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響。內(nèi)生菌定殖后，在從宿主植物那里獲得穩(wěn)定生活環(huán)境的同時(shí)，還對(duì)植物發(fā)揮益生作用，主要表現(xiàn)在以下3個(gè)方面。（1）影響宿主植物的健康和生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，一些內(nèi)生菌可以通過產(chǎn)生例如吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-乙腈等植物生長(zhǎng)激素，或者獲取對(duì)植物有用的如氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的方式來促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)。例如，內(nèi)生真菌石斛小菇Mycena dendrobii通過分泌IAA而顯著促進(jìn)天麻種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)［13］；內(nèi)生黏質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescensAL2-16可以通過固氮作用加強(qiáng)牛膝對(duì)氮素營(yíng)養(yǎng)的利用［14］；人參內(nèi)生的藤黃微球菌Micrococcus luteus、巨大芽孢桿菌B. megaterium、賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus fusiformis都可以通過產(chǎn)生高濃度IAA、鐵鰲合載體以及溶解磷酸鹽的方式實(shí)現(xiàn)植物促生作用［15］。此外，內(nèi)生菌對(duì)植物生長(zhǎng)的其它好處還包括影響根系形態(tài)改變、增強(qiáng)磷酸鹽溶解活性、提高植物對(duì)滲透脅迫的耐性以及氣孔調(diào)節(jié)等多種形式［15-16］。（2）增強(qiáng)宿主植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性。植物對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)主要依靠其次生代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，內(nèi)生菌可以產(chǎn)生不同的生物活性化合物，如生物堿、二萜、異黃酮、抗氧化劑等，幫助宿主植物抵御環(huán)境污染、提高抗病害能力。農(nóng)作物病蟲害是造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最重要的原因之一，多項(xiàng)研究已證實(shí)內(nèi)生菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)與宿主植物抗病能力之間有密切相關(guān)性。例如，中藥當(dāng)歸的內(nèi)生枯草芽孢桿菌B. subtilis可以產(chǎn)生苯五胺類的生物堿，對(duì)抗病原真菌尖孢鐮刀霉F. oxysporum和索蘭尼鐮刀霉F. Solani對(duì)植株的侵染［17］；銀杏內(nèi)生的解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens可以通過產(chǎn)生抗生素并誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的方式間接抑制植物枯萎病的發(fā)生［18］。此外，在例如干旱、高鹽的非生物脅迫環(huán)境下，藥用植物甘草內(nèi)生的短小芽孢桿菌B. pumilus能夠通過提高抗氧化物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，以及調(diào)節(jié)碳氮代謝酶活性的形式提高植株抗性，從而減輕干旱缺水環(huán)境對(duì)植物細(xì)胞造成的損傷［19］。（3）促進(jìn)藥用植物中生物活性化合物的積累。越來越多的研究表明，一些內(nèi)生菌可以促進(jìn)宿主植物產(chǎn)生不同種類的次生代謝產(chǎn)物。例如紫杉醇、青蒿素、喜樹堿、大黃素等都是知名的天然藥物。雖然著名抗癌化合物紫杉醇最早是在短葉紅豆杉中內(nèi)生的安德氏紫杉霉Taxomyces andreanae中發(fā)現(xiàn)的，但實(shí)際上，目前已知定殖在其它植物中的內(nèi)生泊爾盤端角菌Seimatoantlerium nepalense、金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae、瘤座菌Tuberculariasp.等也能合成紫杉醇［20］。

普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，在長(zhǎng)期的共生和協(xié)同進(jìn)化過程中，內(nèi)生菌與宿主植物之間通過一種特殊的微生物-植物相互作用而建立了互惠互利的關(guān)系。內(nèi)生菌具有同宿主極為相似或相同的生物學(xué)特性，可以完成各種信號(hào)的傳遞以及物質(zhì)、信息的交流，從而誘導(dǎo)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)抗病能力、積累活性成分，其中某些產(chǎn)物還可以作為有益的藥物供人類使用。因此，與未感染植株相比，內(nèi)生菌的存在使宿主植物更具有生存競(jìng)爭(zhēng)能力，而內(nèi)生菌與藥用植物之間的相互關(guān)系也會(huì)對(duì)天然藥物的生產(chǎn)造成一定影響。

2 內(nèi)生菌影響藥用植物產(chǎn)生藥理活性化合物的機(jī)制

隨著對(duì)植物和內(nèi)生菌互作研究的深入，幾乎所有被調(diào)查的植物中都證實(shí)了內(nèi)生菌可以深入?yún)⑴c宿主植物的生理或代謝過程。因此，植物被認(rèn)為是包含內(nèi)部微生物的“共生功能體”。雖然內(nèi)生菌與宿主互作介導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物積累的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但是通過對(duì)多種藥用植物產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌和植物的聯(lián)合代謝對(duì)這些天然化合物的產(chǎn)生有重要影響。這種聯(lián)合代謝有些是在植物和微生物酶類聯(lián)合催化作用下的產(chǎn)物，有些是微生物基因表達(dá)的產(chǎn)物在植物體內(nèi)受植物生理環(huán)境影響而導(dǎo)致合成量增加或生成新的化合物，有些則是宿主植物受內(nèi)生菌刺激后啟動(dòng)合成了新的次生代謝物［21］。

2.1 內(nèi)生菌直接合成植物中的藥理活性化合物

目前，已報(bào)道了紫杉醇（抗腫瘤）、喜樹堿（抗腫瘤）、辛可寧（抗瘧疾）、鬼臼毒素（抗皰疹病毒）等90多種植物來源的藥理活性化合物可由內(nèi)生菌代謝產(chǎn)生。雖然關(guān)于內(nèi)生菌與宿主植物之間共同進(jìn)化機(jī)制的許多方面仍不十分清楚。但有觀點(diǎn)認(rèn)為，內(nèi)生菌可以合成與宿主相似或相同的“模擬次生代謝產(chǎn)物”，實(shí)際上介導(dǎo)這些“共享”代謝物合成的功能基因可能原本就是內(nèi)生菌來源的，只是已通過長(zhǎng)期的共同進(jìn)化過程轉(zhuǎn)移到了植物體中［22］。也就是說，內(nèi)生菌可以直接合成藥理活性化合物，成為宿主植物的藥效活性成分，或者其合成的次生代謝產(chǎn)物作為前體物再通過宿主植物的合成酶系催化生成活性成分，通過植物吸收調(diào)控，進(jìn)而影響宿主的次生代謝積累［23］。

例如，東北紅豆杉中分離的內(nèi)生黑曲霉A. niger在體外培養(yǎng)時(shí)可以產(chǎn)生抗癌物質(zhì)紫杉醇，RT-PCR檢測(cè)及基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，該菌株中存在的紫杉醇合成相關(guān)酶GGPPS與來自宿主植物的該酶基因同源性達(dá)到98%［24］。分離自石杉屬植物千層塔中的內(nèi)生真菌膠孢炭疽菌Colletotrichum gloesporioides可以產(chǎn)生藥效活性成分石杉?jí)A甲（Hup A），經(jīng)基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析可知，該菌株的聚酮合酶相關(guān)基因CgPKS-03512對(duì)Hup A的積累有重要作用［25］。鏈格孢菌Alternariasp. MGI是一種從梅洛葡萄中分離出來的內(nèi)生真菌，它可以以葡萄糖為底物代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)白藜蘆醇，研究者采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序解析了從葡萄糖到白藜蘆醇的生物合成過程包括糖酵解、苯丙氨酸合成、苯丙素合成和二苯乙烯類合成途徑，從基因水平上明確了該菌株合成白藜蘆醇的能力［26］。值得注意的是，同樣的化合物在內(nèi)生菌和宿主植物中的生物合成途徑可能是完全不同的。據(jù)報(bào)道，赤霉酸的生物合成中，內(nèi)生真菌藤倉(cāng)赤霉Gibberella fujikuroiIMI 58289是通過甲戊酸途徑由乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化生成赤霉酸，但在宿主植物中赤霉酸主要由甲基磷酸赤蘚糖醇途徑產(chǎn)生［27］。類似的，在內(nèi)生菌構(gòu)巢曲霉A. nidulans中發(fā)現(xiàn)的紫杉醇合成途徑也與已報(bào)道的植物紅豆杉中的紫杉醇合成途徑同源性較低，說明該菌株的紫杉醇合成能力可能是獨(dú)立于植物進(jìn)化而來的。實(shí)際上，某些內(nèi)生菌活性代謝物的生成還必須依賴宿主植物。例如，分離自喜樹樹皮內(nèi)的一株能產(chǎn)生喜樹堿的腐皮鐮刀霉F.solani，在體外培養(yǎng)條件下其喜樹堿的產(chǎn)生能力逐漸減低。研究發(fā)現(xiàn)，該菌能夠自行合成喜樹堿的前體物，隨后要在宿主植物提供的異胡豆苷合成酶作用下才能進(jìn)一步合成藥用成分喜樹堿［28］。更為典型的例子是研究較多的禾草植物香柱菌屬Epichlo?sp.內(nèi)生真菌，雖然其含有完整的麥角纈氨、黑麥草堿類和震顫素類化合物的合成基因，但是只有定殖在植物體內(nèi)的環(huán)境后才能啟動(dòng)真菌中這些化合物相關(guān)基因的表達(dá)［21］。

據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年生產(chǎn)的15-30種新藥中，約75%的候選藥物來源是由微生物而不是植物主導(dǎo)合成的［3］。因此，藥用植物中的內(nèi)生菌是植物來源的藥理活性化合物生成的重要影響因素，在天然藥物生產(chǎn)中的重要性有時(shí)可能大于藥用植物本身，這一發(fā)現(xiàn)可以為篩選有效的合成藥物提供新的思路。

2.2 內(nèi)生菌選擇性催化植物代謝物產(chǎn)生藥理活性化合物

內(nèi)生菌介導(dǎo)藥用植物藥理活性化合物生成的另一主要途徑是通過生物轉(zhuǎn)化作用對(duì)宿主化合物產(chǎn)生影響，這一過程主要是通過內(nèi)生菌產(chǎn)生的胞內(nèi)或者胞外酶的作用，將植物代謝物轉(zhuǎn)化為新的活性物質(zhì)或者提高植物次生代謝物的含量。例如，尖孢鐮刀菌F. oxysporumATCC MYA 4623可以催化肼生成具有抗炎活性的新型化合物3-甲基-1，2，4-三唑并酞嗪［29］；來自黃芪的兩株內(nèi)生鏈格孢菌A.eureka20131E1BL1和新薩托菌Neosartorya hiratsukae20131E2AR1-1可以修飾環(huán)黃芪醇和黃芪醇，生成具有端粒酶抑制作用的新化合物，有望用于阿爾茲海默病和抗衰老治療中［30］。

總結(jié)近年來相關(guān)研究成果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化植物代謝物的研究熱點(diǎn)主要集中在高效菌株篩選、轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化、產(chǎn)物活性分析領(lǐng)域，目前已明確的轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型主要包括：（1）催化O-糖苷鍵和O-醚鍵的合成。例如，虎杖內(nèi)生青霉Penicilliumsp. JQ228238可轉(zhuǎn)化白藜蘆醇生成紫檀芪，后者顯示出更強(qiáng)的藥物穩(wěn)定性和消炎、抗氧化活性［31］；黃芪內(nèi)生新薩托菌N. hiratsukae能將皂苷元轉(zhuǎn)化成新化合物皂苷元-O-吡喃葡萄糖苷，這是一種具有消炎、抗腫瘤活性的潛在新藥來源［32］；常見中藥板藍(lán)根的內(nèi)生黑曲霉A. niger可以去糖基化將相應(yīng)的糖苷前體轉(zhuǎn)化為黃酮糖苷配基，從而得到消炎殺菌活性更強(qiáng)的黃酮糖苷化合物［33］。（2）催化N-糖苷鍵和酰胺鍵的合成。例如，玉米內(nèi)生的輪枝鐮刀霉F. verticillioides可以催化氨基甲酸酯的N-糖苷鍵形成，從而合成有抗癌和抗氧化活性的藥物N-2-羥苯基丙二酸［34］。（3）氧化生成羥基、羰基和環(huán)氧基團(tuán)。有報(bào)道證實(shí)，番瀉葉和積雪草中的4株內(nèi)生真菌草酸青霉P. oxalicum、尖孢鐮刀霉F. oxysporum、圍小從殼菌G. cingulata和深黃傘形霉Umbelopsis isabellinaFJ872076.1可以發(fā)生糖基化、二萜酮化和羥基化生成治療心律失常、心絞痛和高血壓的藥物普萘洛爾［35-37］；三七內(nèi)生的多節(jié)孢菌Nodulisporiumsp. JN254790能將人參皂苷Re的C-C雙鍵轉(zhuǎn)化為二羥基，生成具有抗血小板凝集活性的新藥化合物R13［38］。（4）催化氧化還原反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，刺柏的內(nèi)生真菌煙曲霉A. fumigatesDSM 21023能夠高選擇性的氧化脫氧鬼臼毒素，生成抗病毒藥物鬼臼毒素［39］；菊科植物內(nèi)生的刺盤孢菌Colletotrichum gloeosporioides、皮落青霉P. crustosum和鐮刀菌Fusariumspp.都能氧化二酮哌嗪生成多種抗腫瘤的二酮哌嗪衍生物［40］。

據(jù)此，利用內(nèi)生菌特殊的生物催化活性，可以將植物來源的活性化合物以環(huán)境友好的方式轉(zhuǎn)化生成高質(zhì)量、高純度的天然藥物，不僅能降低天然產(chǎn)物的生物毒性、促進(jìn)人體吸收利用，還能克服化學(xué)合成藥物的技術(shù)瓶頸，同時(shí)也有助于更好的解析藥物結(jié)構(gòu)-藥效活性之間的構(gòu)效關(guān)系。

2.3 內(nèi)生菌誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生藥理活性化合物

研究發(fā)現(xiàn)，外部應(yīng)激刺激能觸發(fā)植物細(xì)胞復(fù)雜的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成和積累。最常見的應(yīng)激刺激包括各種誘導(dǎo)子或信號(hào)分子。內(nèi)生菌是藥用植物生長(zhǎng)環(huán)境中的重要組成部分，可以通過誘導(dǎo)子效應(yīng)或橫向基因轉(zhuǎn)移等改變宿主植物的基因表達(dá)和代謝途徑，導(dǎo)致植物相關(guān)功能基因活性的變化，進(jìn)而誘導(dǎo)某些具有藥理功能的次生代謝產(chǎn)物積累［23］。例如，有研究者發(fā)現(xiàn)適度的尖孢鐮刀霉F. oxysporum菌液誘導(dǎo)子能夠增加中藥鐵皮石斛原球莖中的Do-HDR基因表達(dá)量，從而促進(jìn)其生物堿的合成［41］。著名中藥丹參種子的內(nèi)生真菌莖點(diǎn)霉P. herbarumD603可以刺激植物體內(nèi)與藥用成分丹參醌和丹參酚酸合成相關(guān)的功能基因CPS、DXS、HMGR等表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)植株中丹參酮的合成［42］。

植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是目前研究植物次生代謝物合成的主流手段，而內(nèi)生菌誘導(dǎo)子的使用是提高植物細(xì)胞培養(yǎng)中有用次生代謝物產(chǎn)量最有效的方法之一。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物受到內(nèi)生菌誘導(dǎo)子脅迫時(shí)，激發(fā)植物體內(nèi)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路先將信號(hào)傳遞給受脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，提高mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而誘導(dǎo)次生代謝物關(guān)鍵酶的表達(dá)。因此，完整的誘導(dǎo)合成途徑包括誘導(dǎo)子識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子整合、基因表達(dá)和關(guān)鍵酶的激活4個(gè)水平。（1）識(shí)別誘導(dǎo)子。植物細(xì)胞受體識(shí)別誘導(dǎo)子是植物-內(nèi)生菌互作的第一步，可識(shí)別包括微生物產(chǎn)生的低聚糖、蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪酸成分。例如，殼聚糖是真菌細(xì)胞壁中主要的親水性聚合物，在內(nèi)生真菌與人參發(fā)根共培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，加入殼聚糖、殼聚糖寡糖后，雖然植物根細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，但藥用成份人參皂苷的含量隨著內(nèi)生菌誘導(dǎo)子濃度的上升而顯著增加［43］。像這樣，位于植物細(xì)胞質(zhì)膜上的受體分子選擇性地、高度親和地結(jié)合真菌誘導(dǎo)子后，就將信息傳遞給了信號(hào)誘導(dǎo)子。（2）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的過程，各種信號(hào)都被整合到DNA轉(zhuǎn)錄因子中，隨后引發(fā)植物防御反應(yīng)和植物次生代謝途徑。常見的NO、SA（水楊酸）、ROS（活性氧）都是介導(dǎo)該過程的重要信號(hào)分子。在以往的研究中，通過對(duì)黃花蒿、白術(shù)、銀杏、葛根、黃芪、紅豆杉等多種藥用植物信號(hào)分子的研究發(fā)現(xiàn)，NO、H2O2、JA（茉莉酸酯）、Ca2+、cAMP、G蛋白、IP3（肌醇-1，4，5三磷酸）都與真菌誘導(dǎo)的藥用植物次生代謝途徑有關(guān)［44］，即通過這些不同的信號(hào)通路調(diào)控植物細(xì)胞核中相關(guān)基因表達(dá)，激活不同的植物次級(jí)代謝系統(tǒng)。例如，青蒿植物內(nèi)生的草酸青霉P. oxalicumB4能產(chǎn)生ROS調(diào)控青蒿素生物合成的關(guān)鍵基因紫穗槐二烯合酶和紫穗槐-4，11-二烯單加氧酶轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)而合成有藥用功效的成分青蒿素［45］。藥用植物茅蒼術(shù)在內(nèi)生不動(dòng)桿菌Acinetobactersp. ALEB16的誘導(dǎo)刺激下能產(chǎn)生脫落酸（ABA）和SA，作為信號(hào)分子可顯著提升倍半萜類生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，加速有藥理作用的蒼術(shù)揮發(fā)油類物質(zhì)的積累［46］，從而證實(shí)了內(nèi)生細(xì)菌誘導(dǎo)子通過ABA/SA信號(hào)途徑誘導(dǎo)蒼術(shù)揮發(fā)油合成的分子機(jī)制。（3）轉(zhuǎn)錄因子整合。轉(zhuǎn)錄因子是真核生物基因中與啟動(dòng)子元件特異性結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白。轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控可以激活藥用植物中與次生代謝物合成有關(guān)的多種基因協(xié)同表達(dá)。例如，長(zhǎng)春花中與萜類化合物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CrWEKY1屬于WRKY家族，負(fù)責(zé)調(diào)控萜類吲哚生物堿合成途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子［47］。遺憾的是，目前對(duì)藥用植物中真菌誘導(dǎo)植物次生代謝物積累時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子和各種信號(hào)分子之間的關(guān)系研究相對(duì)較少。（4）基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子通過不同的方式調(diào)控植物基因表達(dá)，包括增加參與次級(jí)代謝物合成的關(guān)鍵酶的數(shù)量，誘導(dǎo)新的酶合成并激活新的代謝途徑，從而有利于植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。例如，大花紅景天中內(nèi)生的瓶頭霉菌Phialocephalasp.能激活關(guān)鍵酶PAL和CA4H基因的表達(dá)，從而促進(jìn)藥用成分酪醇和紅景天苷含量積累［48］。從罌粟果實(shí)中分離的內(nèi)生大理石雕菌Marmoricolasp.和不動(dòng)桿菌Acinetobactersp.與宿主植物共培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)合成嗎啡的關(guān)鍵酶基因COR的表達(dá)，最終提高罌粟中的嗎啡產(chǎn)量［49］。

綜上所述，某些活性化合物的合成基因主要存在于植物細(xì)胞中，在生物或非生物誘導(dǎo)子的脅迫下開始誘導(dǎo)合成，且多數(shù)研究者認(rèn)為，與其他因素相比，內(nèi)生微生物在誘導(dǎo)藥用植物藥效成分積累中的作用更加顯著。因此，內(nèi)生菌誘導(dǎo)子的發(fā)現(xiàn)可以為植物次生代謝產(chǎn)物的研究提供思路，促進(jìn)對(duì)來自藥用植物的天然藥物的開發(fā)和利用。

3 內(nèi)生菌參與合成的藥理活性化合物

內(nèi)生菌是植物內(nèi)部的“化學(xué)合成器”。據(jù)報(bào)道，藥用植物內(nèi)生菌參與合成的眾多藥理活性化合物，如紫杉醇、鬼臼毒素、長(zhǎng)春花堿、金絲桃素等可用于多種人類疾病的臨床治療。按照已知化合物藥理活性的差異，主要分為以下幾類。

3.1 抗微生物活性化合物

2020年5月，世界衛(wèi)生組織、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織召開會(huì)議，將“抗菌藥物”名稱改為“抗微生物藥物”，主要包括殺死或抑制其它微生物生長(zhǎng)的任何天然或人工制劑［50］。已報(bào)道的植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗微生物活性化合物具有結(jié)構(gòu)多樣性特征，包括生物堿、肽、類固醇、萜類、酚類、奎寧和黃酮類。根據(jù)其生物活性，分為抗細(xì)菌、抗真菌和抗寄生蟲類化合物。例如，從蒙古蒿莖中分離的刺盤孢屬內(nèi)生菌Colletotrichum gloeosporioides，可以合成對(duì)枯草芽孢桿菌B. subtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、藤黃八疊球菌Sarcina lutea和假單胞菌Pseudomonassp.有抑菌活性的炭疽菌酸［51］；藥用植物雷公藤中分離的內(nèi)生真菌櫟樹擬隱孢殼Cryptosporiopsis quercina，可以產(chǎn)生一種新型環(huán)肽抗生素，對(duì)皮膚病原真菌毛蘚菌Trichophytonsp.和白色念珠菌Canddida albicans有明顯抑菌活性；澳洲藥用植物蛇藤中分離到的內(nèi)生鏈霉菌StreptomycesNRRL 30562能產(chǎn)生多肽型廣譜抗生素Munumbicins A、B、C和D，可用于控制結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis、炭疽桿菌B. anthraci和惡性瘧原蟲的感染［52］。

眾所周知，在目前的臨床治療中，抗生素耐藥性的發(fā)展已成為威脅人類健康的重要因素。除了合理規(guī)范的使用抗生素，尋找新的抗微生物藥物無疑是解決該問題的重要舉措。而某些藥用植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生新型、高效的多種抗微生物活性化合物，尤其是抗耐藥微生物的活性代謝產(chǎn)物，有望成為替代傳統(tǒng)抗生素的天然抗微生物藥物的重要來源。

3.2 抗病毒活性化合物

病毒感染也是誘發(fā)人類疾病和導(dǎo)致死亡的主要原因。近年來，由內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗病毒化合物已有報(bào)道。例如，藥用植物烏頭內(nèi)生黑孢霉Nigrosporasp.的代謝產(chǎn)物羥基蒽醌衍生物、6-O-脫甲基-4-脫羥基異色酮醇A和8，11-二脫氫美新酮B對(duì)流感毒株H1N1表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗病毒活性［53］；從埃及藥用植物中分離的內(nèi)生格孢腔菌P. tarda可以產(chǎn)生兩種活性化合物交鏈孢菌醇和交鏈孢菌醇-9-甲基醚，分別對(duì)單純皰疹病毒（HSV-2）和水泡性口炎病毒（VSV）顯示40.7%和15.2%的抑制活性［54］。

藥物研發(fā)中，理想的抗病毒藥物應(yīng)對(duì)目標(biāo)毒株有效，但對(duì)人體細(xì)胞副作用最小。迄今為止，已有100多種從沙漠植物中分離出來的內(nèi)生菌株被證實(shí)具有對(duì)抗I型人免疫缺陷病毒（HIV-I）的活性，且這些內(nèi)生菌的提取物對(duì)人體免疫細(xì)胞——T淋巴細(xì)胞的毒性小于30%。因此，內(nèi)生菌的此類活性代謝物可以作為研發(fā)新的抗病毒藥物或抗病毒先導(dǎo)化合物的重要來源。

3.3 抗癌活性化合物

作為人類高發(fā)性和高死亡性疾病，癌癥一直都是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，科研工作者們也在致力于研制和尋找新型抗癌藥物。自從發(fā)現(xiàn)短葉紅豆杉樹皮中分離的內(nèi)生真菌安德氏紫杉霉T. andreanae可以合成抗癌物質(zhì)紫杉醇以來，利用植物內(nèi)生菌篩選新型抗癌藥物受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生菌來源的抗癌活性化合物包括生物堿、聚酮、縮酚肽、色酮、醛、醌、酯、木脂素、環(huán)己酮、二萜等多種結(jié)構(gòu)。例如，從銀杏內(nèi)生真菌球毛殼菌Chaetomium globosum中提取了3種新型化合物氮雜環(huán)酮生物堿，均對(duì)人癌細(xì)胞株HePG2表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒活性［55］；某些紅樹植物內(nèi)生的曲霉屬Aspergillussp.真菌可以合成主要由植物合成的苯丙烷類化合物，在癌細(xì)胞中，該類化合物可以防止組蛋白脫乙酰酶（HDAC）的過度表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［56］。此外，內(nèi)生菌合成的某些活性化合物還可以作為抗癌藥物生產(chǎn)的前體物質(zhì)。例如，喜樹中天然產(chǎn)生的生物堿類化合物——喜樹堿并不溶于水，但可以人工轉(zhuǎn)化為水溶性衍生物伊立替康和拓?fù)涮婵?，分別用作治療結(jié)直腸癌和卵巢癌的臨床藥物［57］；鬼臼毒素是一種木脂素型化合物，最早在19世紀(jì)80年代就從盾葉鬼臼中提取，目前發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)生尖孢鐮刀菌F. oxysporum、煙曲霉A. fumigatus、木霉Trichodermasp.、青霉Penicilliumsp.等也可以產(chǎn)生鬼臼毒素，其衍生物依托泊苷和替尼泊苷是目前已在市場(chǎng)上銷售的用于抗癌治療的化療藥物［58］。

3.4 抗氧化活性化合物

細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能導(dǎo)致人體細(xì)胞受損，進(jìn)而誘發(fā)多種慢性疾病。內(nèi)生菌來源的多種活性化合物都具有清除ROS和超氧自由基的抗氧化特性。最常見的抗氧化劑是多酚類化合物，除此之外，植物和微生物產(chǎn)生的多糖成分也是天然的抗氧化物質(zhì)。例如，貝母內(nèi)生鐮刀菌Fusariumsp.在體外培養(yǎng)中可以產(chǎn)生根皮苷、蘆丁和沒食子酸等化合物，都具有極好的抗氧化能力［59］；榆葉梧桐內(nèi)生的尖孢鐮刀菌F. oxysporum可以產(chǎn)生3種多糖，即胞外多糖（EPS）、菌絲水提多糖（WPS）和NaOH提取的菌絲多糖（SPS），也都顯示出較強(qiáng)的抗氧化能力［60］。實(shí)際上，大量研究證實(shí)，具有抗氧化活性的化合物通常也可能具有抗腫瘤、抗誘變和抗炎活性。因此，植物內(nèi)生菌作為抗氧化化合物的重要天然來源，在針對(duì)癌癥和其他氧化損傷相關(guān)疾病的化學(xué)保護(hù)中可發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.5 免疫調(diào)節(jié)活性化合物

免疫抑制藥物通常用于治療自身免疫性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、異體移植排斥等。為了克服現(xiàn)有臨床藥物副作用大等缺點(diǎn)，尋找內(nèi)生菌來源的免疫抑制劑可能是有效的替代方法。據(jù)報(bào)道，在白茯苓葉中內(nèi)生的球腔菌Mycosphaerella nawaeZJLQ129可以產(chǎn)生二苯并呋喃化合物，隨后，其酰胺衍生物可以通過抑制T細(xì)胞表面抗原，如分化簇（CD69、CD25）和細(xì)胞因子（白介素-2、干擾素-γ）活性來抑制T細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮免疫抑制活性［61］。另一方面，免疫調(diào)節(jié)化合物可以通過激活身體免疫反應(yīng)來治療免疫系統(tǒng)疾病。例如，從藥用植物雷公藤的內(nèi)生真菌擬盤多毛孢Pestalotiopsisspp.中，分離得到3個(gè)具有免疫調(diào)節(jié)作用的活性化合物YS、GS和BS，其中，BS通過調(diào)節(jié)外周血單核細(xì)胞和可溶性IL-2受體表達(dá)來顯示免疫抑制活性，抑制各種細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子和干擾素的產(chǎn)生［52］。

3.6 抗糖尿病活性化合物

糖尿病是一種由于血糖水平升高而引起的代謝疾病。目前臨床所用的抗糖藥物多會(huì)引起腹瀉等各種副作用。植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生具有抗糖活性的代謝物，有助于降低血糖水平。例如，印度蘿芙木莖葉組織中的內(nèi)生鏈霉菌Streptomycessp.可以產(chǎn)生淀粉酶抑制劑，作為抗糖藥物使用。另外，α-糖苷酶抑制劑可以通過充當(dāng)糖類水解酶來減少消化器官對(duì)葡萄糖的吸收。比如，從櫟樹內(nèi)生菌Xylariaceaesp. QGS 01中提取的抗糖化合物8-羥基-6，7-二甲氧基-3-甲基異香豆素，根據(jù)抗糖尿病實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該化合物具有抑制釀酒酵母α-葡萄糖苷酶的潛力［62］。

3.7 抗心血管疾病活性化合物

心血管疾?。–VD）是世界范圍內(nèi)日益增長(zhǎng)的主要致死原因之一，傳統(tǒng)治療方法已經(jīng)很難取得突破，這促使人們從更多來源中去發(fā)現(xiàn)新的有效藥物。目前臨床使用的他汀類藥物通過降低血液中的膽固醇水平，減少中風(fēng)和心血管疾病的發(fā)生，主要包括洛伐他汀和美伐他汀兩類。洛伐他汀是一種聚酮代謝物，主要抑制參與膽固醇合成的HMG-CoA還原酶水平，其主要由多種內(nèi)生真菌產(chǎn)生，包括黃曲霉A.flavus、黑曲霉A. niger、綠色木霉T. viride、紅曲霉Monascussp.、青霉Penicilliumsp.等。另一種降脂藥物普伐他汀是由內(nèi)生真菌土曲霉A. terreus產(chǎn)生，能抑制血管緊張素對(duì)NADPH氧化酶的刺激活性，從而防止超氧化物自由基的生成。

4 展望

植物內(nèi)生菌是一類重要的生物資源。尤其在當(dāng)前傳統(tǒng)藥物耐藥性增加、不斷出現(xiàn)新疾病的時(shí)代，藥用植物內(nèi)生菌成為生產(chǎn)天然藥理活性化合物的重要來源，具有無限的生物特性和應(yīng)用可能性，其重要性不僅在于植物中微生物的新穎性，而是微生物和宿主植物相互作用后產(chǎn)生的新的代謝產(chǎn)物，或者有利于產(chǎn)量顯著增加的代謝物才是更有價(jià)值的。因此，一方面可以利用內(nèi)生菌的優(yōu)勢(shì)，通過控制植物生長(zhǎng)條件來生產(chǎn)更好的藥材。例如，在中藥種植中，可以向植物中添加特定的內(nèi)生菌群來促進(jìn)植株生長(zhǎng)、增加藥效成分，從而獲得更高質(zhì)量的原料藥材料。另一方面，從內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物中直接篩選具有藥用價(jià)值的活性物質(zhì)或新型化合物以創(chuàng)制新藥，解決自然資源不足的現(xiàn)狀，開發(fā)緊缺藥物，能在很大程度上豐富人類的藥物寶庫(kù)。因此，未來藥用植物內(nèi)生菌的研究應(yīng)綜合應(yīng)用高通量篩選、組合化學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段，并重點(diǎn)在以下領(lǐng)域開展工作：（1）構(gòu)建生物工程反應(yīng)系統(tǒng)，在特定培養(yǎng)條件下利用選定的藥用植物與內(nèi)生菌互作，通過生物技術(shù)手段直接生產(chǎn)所需藥物并提高產(chǎn)量；（2）明確藥用植物有益內(nèi)生菌活性標(biāo)準(zhǔn)，更好地指導(dǎo)內(nèi)生菌株的分離篩選工作；（3）建立藥用植物內(nèi)生菌種資源庫(kù)，充分利用有益菌種開展藥用植物種植和培育、藥用植物資源保護(hù)工作，進(jìn)一步提高天然藥物的質(zhì)量和產(chǎn)量。