鐘新英,蘇曉茹,張藝娜,張美芳,史曉麗

（寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100）

對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是對蝦養(yǎng)殖中毒害最大的病毒之一，其所導(dǎo)致的對蝦白斑綜合癥傳播速度快、破壞性強、防治困難，給我國乃至全球的對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的危害，制約了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1].據(jù)統(tǒng)計，我國每年因此造成的經(jīng)濟損失達到數(shù)千萬元[2].為了降低該病毒的危害，在過去的數(shù)十年里，學(xué)者們開展了大量的研究工作，如控制水質(zhì)量、切斷傳播途徑、提高對蝦抵抗力等，但是效果并不顯著[3-6].

在WSSV 的侵染過程中，檢測感染對蝦的病毒含量是了解病毒侵染過程最重要方法之一.宿主的抗性也會影響疾病的暴發(fā)[7]，宿主中的病毒含量可以反應(yīng)出它們對疾病的抵抗力及感染時期[8-9]，故病毒含量檢測尤為重要.目前已有多種檢測WSSV含量的方法，如原位雜交、免疫組化、一步法聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、多重PCR 和real-time PCR 等[10-11].在諸多方法中，real-time PCR 因其檢測快速、靈敏度高，常被用于實時檢測感染對蝦病毒含量，目前已被應(yīng)用于斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本對蝦(Penaeus japonicus)等對蝦的病毒含量檢測[12-13].已有研究表明，在對蝦養(yǎng)殖過程中，處于低濃度感染時，對蝦不一定會暴發(fā)性死亡，攜帶少量病毒的對蝦可以繼續(xù)生存，如細角瀕對蝦(Litopenaeus stylirostris)體內(nèi)病毒含量雖已達到2.1×103～2.72×105copies·ng-1，但其還可以繼續(xù)生長且沒有表現(xiàn)出任何臨床癥狀[15].只有當(dāng)對蝦體內(nèi)的病毒含量達到一定數(shù)量時，如凡納濱對蝦（Litope?naeus vannamei）為1.6×106copies·ng-1、細角濱對蝦為4.3×105～3.0×106copies·ng-1、斑節(jié)對蝦為2.1×106copies·ng-1時，對蝦才會死亡[14].孟憲紅[16]在中國對蝦的研究中發(fā)現(xiàn)，不同感染時期（感染初期、高峰期和后期）對蝦死亡個體的WSSV 含量分別為8.8×104～1.5×105、4.4×105～1.2×106、8.5×105～4.6×106copies·ng-1，死亡個體的平均WSSV 含量為9.5×106copies·ng-1，這也表明，WSSV 的感染程度和對蝦死亡之間存在一定的關(guān)聯(lián).此外，不同對蝦品種之間的差異也較大，如孫成波等[17]對凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦致死量的研究發(fā)現(xiàn)，不同感染時間（感染后24、48 h 和瀕死個體）2 種對蝦攜帶病毒數(shù)量的范圍為1.6×105～4.3×105copies·g-1，這也為實踐中進一步優(yōu)化對蝦養(yǎng)殖條件、減少和控制WSSV暴發(fā)提供了理論基礎(chǔ).

凡納濱對蝦又稱南美白對蝦，具有抗逆力強、生長快、繁殖期長、耐低鹽養(yǎng)殖等優(yōu)點,是世界對蝦養(yǎng)殖的三大品種之一，也是我國極為重要的養(yǎng)殖對蝦[18]，但其養(yǎng)殖長期受到WSSV 病害的困擾.因此，本研究通過對凡納濱對蝦進行WSSV人工投喂感染，采用real-time PCR 技術(shù)，對不同感染時期的凡納濱對蝦組織樣品進行病毒含量檢測，觀察感染W(wǎng)SSV后對蝦體內(nèi)病毒含量的增殖變化，以期為凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中WSSV的防治及抗WSSV育種提供參考.

1 實驗方法

1.1 實驗材料

供試對蝦購買自寧德對蝦養(yǎng)殖場，購買后運輸至寧德師范學(xué)院國家海洋局海西海洋生物種質(zhì)資源及生物制品開放利用公共服務(wù)平臺循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行暫養(yǎng).暫養(yǎng)期間，每日投喂3 次配合餌料（日投喂量占對蝦總體質(zhì)量的3%～5%），每日換水，換水量根據(jù)攝食情況調(diào)整，溫度在26～28 ℃之間，鹽度27‰.對蝦體長5～8 cm，體質(zhì)量1.5～2.8 g，約500 尾.WSSV 人工感染實驗前，隨機選取5 尾對蝦進行熒光定量PCR檢測，確認對蝦體內(nèi)WSSV含量為陰性后再進行后續(xù)感染.

1.2 WSSV人工感染

采用單尾、口飼法對凡納濱對蝦進行WSSV人工感染.感染所用毒餌為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所對蝦遺傳育種實驗室饋贈，病毒含量為107copies·ng-1，加入可食用紅色色素混合均勻后即可進行下一步感染，感染之前毒餌暫存于-80 ℃冰箱.感染之前，對蝦先饑餓處理12 h，保證其腸胃排空.之后將對蝦撈至單獨容器中，用鑷子夾取約10 mg毒餌送至對蝦口器處，待對蝦飽食后即可在胃部觀察到明顯的紅色，然后將其放回至養(yǎng)殖桶.所有對蝦飼喂完成后，正常養(yǎng)殖，并觀察對蝦死亡情況，及時撈出死亡個體.

1.3 樣品采集及處理

實驗開始后，從出現(xiàn)第一尾死亡對蝦開始，每隔2 h撈取死亡對蝦，記錄其死亡時間、體重及水溫，并取其肌肉組織保存于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)病毒含量的檢測.

1.4 病毒含量測定

使用TIANGEN 基因組DNA 提取試劑盒對對蝦肌肉組織的DNA 進行提取，DNA 提取結(jié)束后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計測定其濃度.采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II 對病毒的絕對含量進行測定（艾科瑞，湖南），引物由上海生工生物工程公司合成.熒光定量PCR 反應(yīng)體系參考說明書，具體如下：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix II 10 μL，模板2 μL，引物各0.8 μL (10 μmol·L-1)，ROX 0.4 μL (4 μmol·L-1)，加無菌水補至20 μL.PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40 個循環(huán).實驗所用引物見表1；實驗所用標準品為自行合成的含有目標片段的重組pMD-T∕WSSV69 質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度為5.0×108copies·μL-1，將標準品進行10 倍梯度稀釋并對其進行擴增，采用滅過菌的雙蒸水作為陰性對照，每個梯度設(shè)置3個平行.每個DNA樣品平行檢測2次，取其平均值作為該樣品的病毒含量值.

表1 實驗所用引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

采用SPSS 22.0的單因素方差分析（One-way ANOVA）對對蝦體內(nèi)的病毒含量進行分析，顯著性水平為0.05.

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 人工感染W(wǎng)SSV結(jié)果

對蝦感染W(wǎng)SSV后的死亡情況見圖1，感染34 h以后，開始出現(xiàn)死亡對蝦，感染150 h為死亡高峰期，高峰期死亡85 尾，最后沒有對蝦存活，對蝦最長存活時間為285 h，累計出池對蝦487 尾，對蝦平均體重（4.34±0.47）g.結(jié)合對蝦死亡情況，我們把感染后的40～60 h定為死亡初期，感染140～170 h定為死亡高峰期，感染230～250 h定為死亡后期.每個時期選取20尾對蝦進行基因組DNA的提取，統(tǒng)計分析病毒含量.

圖1 凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV后的死亡情況

2.2 標準曲線制備結(jié)果

以標準品拷貝數(shù)的Log值為橫坐標，以測得的Ct值為縱坐標，繪制標準曲線，得到的標準曲線的R2=0.998 2，且所有的陰性對照均沒有擴增信號.

圖2 質(zhì)粒的標準曲線

2.3 對蝦體內(nèi)病毒含量分析

不同時期的死亡對蝦體內(nèi)的病毒含量結(jié)果見表2.隨著感染時間的延長，死亡對蝦體內(nèi)的病毒含量在逐漸升高.感染初期、高峰期和后期，死亡對蝦體內(nèi)的病毒含量分別為1.37×105～4.47×106、1.92×106～1.30×107、3.75×106～1.90×107copies·ng-1，各感染時期的平均病毒含量分別為1.56×106、7.56×106、1.02×107copies·ng-1.應(yīng)用獨立樣本T 檢驗分析各期對蝦體內(nèi)的病毒含量，感染初期和后期對蝦體內(nèi)WSSV 含量差異顯著(P=0.023).

表2 死亡對蝦體內(nèi)WSSV含量

3 討論

人工感染W(wǎng)SSV的方法包括飼喂、注射、浸泡等，其中，注射方法見效快，對蝦死亡較快，但容易給對蝦造成機械損傷；浸泡方法不會產(chǎn)生機械損傷，但WSSV 一旦游離在海水中4 h就會失去感染活性[19]，故其浸泡效果不是很好.通常對蝦主要是通過攝食攜帶WSSV的對蝦或者鹵蟲導(dǎo)致病毒感染，所以本實驗采用口飼的方法對對蝦進行感染，符合自然狀態(tài)下養(yǎng)殖對蝦感染W(wǎng)SSV 的情況，這與逄錦菲[20]報道的研究方法類似，并且在感染過程中，隨時撈出死亡對蝦，有效防止了對蝦殘食帶來的重復(fù)感染，確保了結(jié)果的準確性.

WSSV 在養(yǎng)殖池塘中一旦爆發(fā)，造成的死亡率可以達到100%、，但是不同的對蝦種類、感染方式和感染劑量會影響對蝦最終的死亡時間[19].如孫成波等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過注射的方式感染凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦后，在低劑量感染的時候，凡納濱對蝦表現(xiàn)出了更明顯的抗性，而在WSSV 劑量為6×104copies時，凡納濱對蝦體內(nèi)的WSSV 含量在感染后的48 h，便達到了107copies·g-1，對蝦的平均存活時間為79.5 h，而斑節(jié)對蝦的平均存活時間僅為65.7 h.Durand 等[21]也研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用104copies 的WSSV 對對蝦進行注射后，所有對蝦在4 d 內(nèi)全部死亡.逄錦菲[20]通過對中國對蝦“黃海2 號”進行大規(guī)模的口飼WSSV 感染，發(fā)現(xiàn)感染后期死亡對蝦體內(nèi)的平均病毒含量為8.71×105copies·ng-1，對蝦最長存活時間達到了602 h.本實驗通過口飼法感染凡納濱對蝦，每尾對蝦攝食的餌料中的病毒粒子達到了109copies，超過了很多學(xué)者通過注射或者浸泡測試對蝦抗WSSV的劑量，最長的存活時間為285 h，說明了凡納濱對蝦對WSSV具有較強的耐受力.

已有研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過WSSV感染存活的中國對蝦個體內(nèi)，病毒含量出現(xiàn)了兩級分化的現(xiàn)象，有的對蝦體內(nèi)病毒含量很低（＜100 copies·ng-1），有的對蝦體內(nèi)病毒含量很高（＞106copies·ng-1）[20].孟憲紅[16]也發(fā)現(xiàn)，在中國對蝦大規(guī)模的WSSV感染中，最終存活的個體中有一半對蝦體內(nèi)的病毒含量小于100 copies·ng-1.Huang等[14]在凡納濱對蝦的研究中也發(fā)現(xiàn)，高抗家系存活對蝦的WSSV 含量(23.84±2.56)×106copies·g-1顯著低于其他家系，這就說明有的對蝦是可以阻止WSSV 在體內(nèi)復(fù)制的，而有的對蝦可以耐受更高水平的WSSV 劑量，那些高抗性的對蝦一方面可以阻止病毒的復(fù)制，另一方面還可以耐受一定的高水平的WSSV 劑量.本實驗結(jié)束時并沒有發(fā)現(xiàn)存活對蝦，感染后期死亡對蝦個體中的平均WSSV 含量在107copies·ng-1，最小和最大WSSV含量值僅差了10倍，差異不顯著，沒有出現(xiàn)兩極分化的現(xiàn)象.但是在病毒含量的檢測中，我們發(fā)現(xiàn)，早期死亡的對蝦個體內(nèi)的最小病毒含量僅為1.37×105copies·ng-1，隨著感染時間的延長，死亡對蝦體內(nèi)的最小病毒含量達到了106copies·ng-1，說明在感染后期死亡的對蝦對WSSV的耐受力更強，感染實驗中存活時間久的對蝦對WSSV的抵抗力顯著強于存活時間短的對蝦，這就為進一步開展抗WSSV相關(guān)的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ).

本研究以商品化的凡納濱對蝦為實驗材料，通過口飼的方法進行WSSV 感染，分析了感染后的WSSV含量變化，為解決凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中的WSSV病害防治提供了理論參考價值.