張曉騰，韓建軍，白燕

華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，石家莊050035

蛋白類藥物在腫瘤、免疫等疾病上，具有特異性高、療效快、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，因此，近年來(lái)，蛋白類藥物的研發(fā)引起了人們廣泛的關(guān)注，尤其是抗體藥物，已成為醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展最迅速、研發(fā)數(shù)量最多的產(chǎn)品之一［1-2］。截至2020年，單克隆抗體產(chǎn)品全球銷售額約1 250億美元，占藥品總銷售額的15%［3］。2019年共批準(zhǔn)上市了9款抗體藥物，累計(jì)上市的抗體藥物數(shù)量是2010 年的近3 倍，且后期臨床管線較豐富，與2010 年相比，處于后期研究階段的抗體療法數(shù)量增加了2倍多；同時(shí)，早期臨床管線也較多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，有500 多種新型抗體療法已進(jìn)入臨床Ⅰ、Ⅰ/Ⅱ、Ⅱ期試驗(yàn)［4-5］。

蛋白類藥物主要成分是蛋白質(zhì)，其分子量大、不穩(wěn)定且具有高度復(fù)雜的二維和三維構(gòu)象，有些蛋白質(zhì)還有特定的糖基化修飾，其不穩(wěn)定性導(dǎo)致對(duì)外界條件較敏感，易發(fā)生降解，從而影響其功效。蛋白類藥物的降解產(chǎn)物具有免疫原性，這也是蛋白類藥物的主要危險(xiǎn)因素。因此，穩(wěn)定性研究是蛋白類藥物質(zhì)量控制的重要內(nèi)容之一。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）、國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）（Q1A8、ICH Q5C）和世衛(wèi)組織（World Health Organization，WHO）（Annex 10）指南規(guī)定了藥物穩(wěn)定性試驗(yàn)的要求，用于了解在各種環(huán)境因素的影響下，原料藥和藥品的質(zhì)量是如何隨時(shí)間變化的。強(qiáng)制降解是穩(wěn)定性試驗(yàn)中最重要的部分，也是預(yù)測(cè)藥物穩(wěn)定性最常用的工具，可以預(yù)測(cè)外界條件對(duì)藥品純度、效力和安全性的影響，從而制定藥品包裝、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等條件要求。目前，對(duì)于強(qiáng)制降解研究，僅在ICH Q1B 中對(duì)強(qiáng)光條件設(shè)置有明確的規(guī)定，其他條件如高溫、高濕、酸/堿水解及氧化條件均無(wú)明確規(guī)定。雖然化學(xué)藥物強(qiáng)制降解研究已相對(duì)成熟，但蛋白類藥物對(duì)環(huán)境和條件更敏感，因此，蛋白類藥物強(qiáng)制降解與化學(xué)藥物差異較大。本文主要綜述了蛋白類藥物的強(qiáng)制降解條件及其對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，以期為蛋白類藥物強(qiáng)制降解試驗(yàn)條件設(shè)計(jì)提供理論參考依據(jù)。

1 蛋白類藥物不穩(wěn)定性因素

蛋白類藥物的穩(wěn)定性由物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性組成。物理不穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)高階結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)，包括熱不穩(wěn)定性和構(gòu)象不穩(wěn)定性，其中熱不穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的展開(kāi)溫度有關(guān)；構(gòu)象不穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)有關(guān)。物理不穩(wěn)定性可能由降解導(dǎo)致，如去折疊、解離、變性、吸附、聚集和沉淀，其中蛋白質(zhì)去折疊是非常重要的物理不穩(wěn)定性因素，會(huì)影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種構(gòu)象變化可能會(huì)導(dǎo)致蛋白類藥物的生物活性下降并可誘導(dǎo)不可逆的蛋白質(zhì)聚集［6-8］。而化學(xué)不穩(wěn)定性與蛋白類藥物一級(jí)結(jié)構(gòu)中共價(jià)鍵的形成和/或斷裂有關(guān)，可由氧化、還原、脫酰胺、水解、精氨酸轉(zhuǎn)化、β-消除等不同降解途徑引發(fā)［9］。

2 蛋白類藥物強(qiáng)制降解條件

不同類型的蛋白質(zhì)其結(jié)構(gòu)、分子量均不相同，導(dǎo)致穩(wěn)定性差異較大，因此，難以制定強(qiáng)制降解條件的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。但目前對(duì)于降解量，F(xiàn)DA和WHO建議為5%～30%。強(qiáng)制降解的條件若過(guò)于激烈，可能會(huì)導(dǎo)致次級(jí)降解產(chǎn)物的生成，甚至導(dǎo)致主峰被完全破壞，且在研究中這些次級(jí)降解產(chǎn)物的穩(wěn)定性較差，對(duì)于蛋白類藥物的穩(wěn)定性及雜質(zhì)譜無(wú)指導(dǎo)價(jià)值。若強(qiáng)制降解的條件過(guò)于平緩，降解產(chǎn)物的含量很難達(dá)到檢出限或者定量限，進(jìn)而很難對(duì)穩(wěn)定性試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的雜質(zhì)做出正確的預(yù)測(cè)。因此，合理的試驗(yàn)條件是強(qiáng)制降解成功的關(guān)鍵。目前，強(qiáng)制降解試驗(yàn)條件主要考察高溫、pH（強(qiáng)酸、強(qiáng)堿）、氧化、光照、反復(fù)凍融、振蕩等。

2.1 高溫

蛋白類藥物受溫度影響較大，一般儲(chǔ)存于2～8 ℃下，隨著溫度的升高，蛋白構(gòu)象可能會(huì)發(fā)生展開(kāi)或者部分展開(kāi)，展開(kāi)后的蛋白質(zhì)更易發(fā)生降解或者聚集。隨著溫度的持續(xù)升高，會(huì)達(dá)到蛋白質(zhì)融化溫度，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的聚集。在高溫下，構(gòu)象發(fā)生變化的蛋白質(zhì)其氨基酸更易與化學(xué)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，因此，在高溫下，蛋白質(zhì)除了發(fā)生聚集外，還會(huì)伴隨其他化學(xué)反應(yīng)，如氧化、脫酰胺等。蛋白類藥物的溫度設(shè)置條件需高于穩(wěn)定性研究加速考察溫度的10 ℃以上，還需低于融化溫度的10～20 ℃，才可以獲取有效的降解信息。Mcavan 等［10］研究表明，IgG4 單克隆抗體在40、50 ℃處理14 d 后，發(fā)生了聚集反應(yīng)，進(jìn)一步對(duì)肽圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Met、Trp 和His 殘基發(fā)生了氧化，且50 ℃處理下，發(fā)生了明顯的脫酰胺反應(yīng)；同時(shí)，利妥昔單抗在45、55、65°C處理4 h，發(fā)現(xiàn)在低于熔化溫度（45、55 ℃）時(shí)，His 和Lys 殘基發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致單抗的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，而在65°C時(shí)，利妥昔單抗發(fā)生聚體沉淀。

藥物的高溫降解一般遵循阿倫尼烏斯（Arrhenius）方程，其可用來(lái)實(shí)時(shí)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)降解情況，但蛋白類藥物降解并不遵循阿倫尼烏斯方程。Didier等［11］發(fā)現(xiàn)凍干減毒活疫苗在37 ℃強(qiáng)制條件下處理14 d，病毒的滴度下降不符合阿倫尼烏斯方程，分析原因?yàn)椴《镜味认陆凳紫扔刹《九c海藻糖之間的氫鍵發(fā)生變化引起，而后發(fā)生構(gòu)象變化（α-螺旋增加、β-轉(zhuǎn)角減少）和脫酰胺導(dǎo)致病毒失活造成病毒滴度下降，該現(xiàn)象實(shí)際遵循二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。在其他生物制品中，高溫對(duì)蛋白類藥物造成的降解也發(fā)現(xiàn)此種情況，二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型在儲(chǔ)運(yùn)期間（包括溫度偏移）的穩(wěn)定性均可以被準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，而阿倫尼烏斯方程在穩(wěn)定性預(yù)測(cè)方面會(huì)產(chǎn)生顯著誤差［12］。

2.2 pH

蛋白質(zhì)在極端pH 條件下由于維持構(gòu)象的分子內(nèi)或分子間作用力（如氫鍵、靜電力和疏水力）被破壞，從而可能導(dǎo)致永久變性或聚集。在細(xì)胞培養(yǎng)階段、低pH 病毒失活、純化階段等常造成局部溶液pH極端，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白類藥物降解，因此，對(duì)于工藝研究，了解極端pH條件導(dǎo)致的蛋白類藥物降解至關(guān)重要。蛋白類藥物pH 強(qiáng)制條件一般為低pH 在3～5 之間，高pH 在8～9 之間，處理時(shí)間1～3 周，甚至3 個(gè)月［13］。低pH 條件下蛋白類藥物易發(fā)生Gln 脫酰胺和Asn 殘基脫酰胺，在高pH 條件下蛋白類藥物易發(fā)生Met殘基氧化、Gln殘基脫酰胺、Asn 殘基脫酰胺和蛋白質(zhì)纖維化［14］。但以上條件并不是絕對(duì)的，藥品中的某些物質(zhì)也會(huì)導(dǎo)致蛋白類藥物的降解，如在低pH 下，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞宿主蛋白也會(huì)加速蛋白類藥物Phe 和Trp殘基的降解［15］。

高溫可以加速pH 依賴的降解，因此，pH 誘導(dǎo)的強(qiáng)制降解試驗(yàn)的溫度一般在25 ℃或者40 ℃［16］。但溫度對(duì)pH誘導(dǎo)的強(qiáng)制降解加速并不是絕對(duì)的，與緩沖液類型也有一定的關(guān)系。Pacea 等［17］發(fā)現(xiàn)溫度影響不同pH 緩沖液下IgG1 單克隆抗體的脫酰胺速率，在40 ℃時(shí)，酸性緩沖液溶液的脫酰胺速率快于堿性緩沖液，但在5 ℃時(shí)，堿性緩沖液溶液的脫酰胺速率快于酸性緩沖液，原因?yàn)镺H-濃度與單克隆抗體的脫酰胺速率相關(guān)，而溫度的劇烈變化會(huì)影響緩沖液中的OH-濃度。pH 對(duì)溫度造成的蛋白質(zhì)聚集影響較大，人單克隆IgG2 抗體在4 ℃下表現(xiàn)出典型的pH 依賴性的二聚體聚集。然而在37 ℃下，高分子量聚集體與pH 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明其與溫度介導(dǎo)的剪切相關(guān)［18］。

2.3 氧化

蛋白類藥物中S 原子比較活躍，容易被氧化，因此，Met 和Cys 殘基是最容易被氧化的氨基酸。在堿性條件下，Met 和Cys 殘基氧化可生成Met 亞砜或Met 砜甚至形成分子內(nèi)/間二硫鍵。由于氨基酸結(jié)構(gòu)中存在芳香環(huán)，芳香環(huán)容易被氧化，因此，His、Tyr 和Trp 殘基也容易被氧化［19］。蛋白質(zhì)的氧化易受到外界環(huán)境的刺激，進(jìn)而加速氧化，如某些金屬離子、高溫、光照、化學(xué)添加劑等。最常用的化學(xué)氧化劑為H2O2、叔丁基過(guò)氧化氫、2-偶氮雙（2-氨基丙烷）二鹽酸鹽等，常用的金屬離子為Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+等，其中H2O2氧化法是最經(jīng)典的氧化方法，添加量為0.03～500 mmol·L-1，但反應(yīng)時(shí)間差異較大。氧化法常結(jié)合高溫或者光照輔助加速氧化，但有時(shí)氧化反應(yīng)速度過(guò)快，并且在低溫甚至冷凍條件下仍然可以進(jìn)行，因此，很難將氧化反應(yīng)終止，目前，最常用的氧化終止法是緩沖液交換法。蛋白類氧化會(huì)造成藥物的療效降低，甚至導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。Singh 等［20］在25 ℃條件下采用300 mmol H2O2氧化人粒細(xì)胞刺激 因 子（human granulocyte-stimulating factor，G-CSF），發(fā)現(xiàn)G-CSF 的Met殘基最易被氧化，氧化位 點(diǎn) 為Met1、Met138、Met127 和Met 122，其 中Met127 和Met122 的氧化還會(huì)引起G-CSF 的Asp113和Thr117殘基的輕微位移，從而導(dǎo)致局部構(gòu)象發(fā)生變化。此外，一些賦形劑（如聚山梨酯、聚乙二醇和吐溫-80）、潤(rùn)滑劑和包裝材料的過(guò)氧化物的污染可導(dǎo)致蛋白類藥物的氧化［21］。使用不同的氧化劑雖然均能氧化蛋白質(zhì)，但氧化的位點(diǎn)優(yōu)先順序卻存在差異，強(qiáng)光氧化條件下IgG1 重鏈的Met 優(yōu)先氧化，而叔丁基過(guò)氧化氫氧化條件下Met氧化是隨機(jī)的［22］。

2.4 光照

蛋白類藥物一般建議避免陽(yáng)光直射，并且有些藥物需采取相應(yīng)的措施以避免直接或者長(zhǎng)期暴露于陽(yáng)光下，但在蛋白類生產(chǎn)用藥過(guò)程中很難完全避免光照，如純化層析過(guò)程中紫外燈的檢測(cè)、半成品的配制和轉(zhuǎn)移可能暴露于人工光源下等。光強(qiáng)制降解是眾多條件中，唯一有指導(dǎo)原則的試驗(yàn)。ICHQ1B 光穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則要求對(duì)光源的波長(zhǎng)分布除450～650 nm 的可見(jiàn)光區(qū)外，還應(yīng)包括320～400 nm 的近紫外區(qū)。因此，光源有2 種選擇方式，第1種是光源分布波長(zhǎng)特性相當(dāng)于ISO室外日光標(biāo)準(zhǔn)D65 與室內(nèi)間接日光標(biāo)準(zhǔn)ID65 的光源，如日光熒光燈、氨燈、鹵燈等；第2種是同時(shí)暴露于冷白熒光燈和近紫外熒光燈下。并且ICH還要求樣品應(yīng)暴露于總照度不低于1.2×106lx·h，近紫外能量不低于200 w·h·m-2。光誘導(dǎo)的強(qiáng)制降解與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象、制劑配方組成、包裝形式以及光波長(zhǎng)、光強(qiáng)度和光照時(shí)間密切相關(guān)。光強(qiáng)制降解可導(dǎo)致多種產(chǎn)物生成，包括蛋白質(zhì)聚集、交聯(lián)和降解。光強(qiáng)制降解常作用于Cys、Trp、Tyr和Phe 靶點(diǎn)［23］。光照條件下存在的氧化劑或者金屬離子均可加速蛋白質(zhì)氧化。光強(qiáng)制降解雖然只影響單個(gè)氨基酸的化學(xué)變化，但單個(gè)氨基酸可能在活性氧和水共同存在下與其他氨基酸發(fā)生反應(yīng)使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致聚集，或者在長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間，產(chǎn)生的小濃度聚集物作為成核中心，進(jìn)而產(chǎn)生可見(jiàn)顆粒物。酪氨酸的氧化產(chǎn)物是二酪氨酸，脫質(zhì)子化的二酪氨酸具有光敏作用，可以產(chǎn)生O2-、H2O2和O2，進(jìn)一步與其他氨基酸發(fā)生反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)［24］。

除了蛋白類藥物的氨基酸光照后形成的氨基酸氧化產(chǎn)物是光敏劑外，糖基化終產(chǎn)物和過(guò)氧化物也可以作為光敏劑，進(jìn)而破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)可與還原糖發(fā)生非酶反應(yīng)，形成結(jié)構(gòu)多樣的雜環(huán)交聯(lián)產(chǎn)物——高級(jí)糖基化終產(chǎn)物，如戊糖苷、甲基乙二醛賴氨酸二聚體、乙二醛賴氨酸二聚體和脫氧葡萄糖基賴氨酸二聚體。這種高級(jí)糖基化產(chǎn)物在紫外光的作用下產(chǎn)生O2-、H2O2和O2等，進(jìn)而氧化破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)［25-26］。蛋白類藥物制劑中一般不存在還原糖，但蔗糖等二糖常作為穩(wěn)定劑添加到制劑中。蔗糖在酸性和高溫條件下易水解為葡萄糖和果糖，如單克隆抗體在蔗糖中29 ℃保存6 個(gè)月即可以生成高級(jí)糖基化產(chǎn)物［25］。聚山梨酯-80是蛋白類藥物中常用的抗氧化劑，亞油酸是其游離的脂肪酸成分。亞油酸可以通過(guò)殘余宿主細(xì)胞蛋白的催化水解或者氧化釋放出來(lái)。亞油酸可以進(jìn)一步氧化生成丙二醛。丙二醛可與Lys 殘基反應(yīng)生成二氫吡啶加合物，其在光照條件下可產(chǎn)生O2，以氧化蛋白質(zhì)［27］。

2.5 反復(fù)凍融

蛋白類藥物在儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過(guò)程中，易受到外界環(huán)境的劇烈變化導(dǎo)致發(fā)生凍融過(guò)程。蛋白類藥物運(yùn)輸儲(chǔ)藏過(guò)程中易發(fā)生低于0 ℃情況，此時(shí)藥物是否可以使用需要依據(jù)蛋白類藥物反復(fù)凍融的機(jī)制去評(píng)估。在反復(fù)凍融過(guò)程中，可能會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)與冰表面張力變化、溫度劇烈變化、濃縮、賦形劑結(jié)晶、相分離和pH 變化，這些變化會(huì)影響蛋白類藥物的聚集，但影響程度取決于制劑的組分、蛋白質(zhì)本身性質(zhì)及反復(fù)凍融的溫度及溫度變化速率［28-29］。蛋白質(zhì)的聚集主要是由于蛋白結(jié)構(gòu)在冷凍過(guò)程中被打開(kāi)，蛋白質(zhì)單體可與相鄰單體發(fā)生聚合反應(yīng)，形成二聚體和三聚體，但此聚合過(guò)程是可逆的。但若pH 在冷凍過(guò)程中變化導(dǎo)致緩沖液pH 接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，近距離蛋白質(zhì)單體之間互相排斥的電荷被中和，疏水力會(huì)增大，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)重新折疊成聚集體（此過(guò)程是可逆的）或者與另一個(gè)蛋白質(zhì)單體發(fā)生β-折疊形成不可逆的聚集體［30］。如單克隆抗體在-80 ℃下冷凍，室溫下解凍會(huì)發(fā)生明顯的聚集，但此聚集體是不可逆的，當(dāng)冷凍過(guò)程pH 由酸性偏向于中性時(shí)，蛋白質(zhì)聚集體的含量也隨之增加［31］。蛋白質(zhì)聚集體在高溫強(qiáng)制條件下也可以形成，但形成機(jī)制不同。如單克隆抗體在高溫條件下形成的聚集體是以二硫鍵連接的，而在反復(fù)凍融過(guò)程中形成的聚集體是以非共價(jià)鍵連接起來(lái)的，形成的機(jī)制不同，導(dǎo)致生物物理性質(zhì)和高階結(jié)構(gòu)與單體相比差異也較大。反復(fù)凍融形成的聚集體在生物活性、物理性質(zhì)和高階結(jié)構(gòu)方面與單體差異較小，但由于空間位阻的存在，導(dǎo)致其生物活性顯著降低［32］。

反復(fù)凍融試驗(yàn)中，試驗(yàn)樣品的體積參數(shù)也非常重要，1～5 mL 蛋白質(zhì)溶液在幾分鐘冷凍，而大體積的蛋白質(zhì)溶液冷凍過(guò)程漫長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液出現(xiàn)不均一現(xiàn)象，這是由于發(fā)生了冷凍濃縮現(xiàn)象，水溶液的冰點(diǎn)低首先凍結(jié)，導(dǎo)致下層溶液蛋白質(zhì)、緩沖液成分均變大，引起滲透壓、pH 發(fā)生變化，因此，在反復(fù)凍融試驗(yàn)中，試驗(yàn)的體積應(yīng)盡可能小。冷凍溫度一般需要低于蛋白類藥物的玻璃態(tài)融化溫度，一般選擇-20 ℃或者-80 ℃。融化溫度一般選擇5 ℃或者25 ℃。反復(fù)凍融的周期一般應(yīng)大于3個(gè)周期。

2.6 振蕩或攪拌

蛋白類藥物在生產(chǎn)、運(yùn)輸和最終給藥過(guò)程中常會(huì)受到振蕩或攪拌，因此，測(cè)試其在振蕩或者攪拌情況下的穩(wěn)定性非常重要。蛋白質(zhì)在振蕩或者攪拌中會(huì)暴露于剪切力增大、氣液兩相、局部溫度變化等情況下，這些情況可能導(dǎo)致蛋白類藥物發(fā)生降解。蛋白類藥物在混合、過(guò)濾等制造過(guò)程中易受到剪切力的作用從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集，但研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)剪切力達(dá)到20～150 pN 時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)才可能被破壞，從而導(dǎo)致聚集。一般在混合、過(guò)濾過(guò)程中，剪切力最高不超過(guò)0.06 pN，理論上無(wú)法使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，但也有蛋白質(zhì)發(fā)生聚集的情況，原因?yàn)榈鞍踪|(zhì)暴露于氣液兩相界面上導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性發(fā)生變化，其發(fā)生的聚集是不可逆的甚至?xí)纬刹蝗茴w粒［33-34］。剪切力可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的融化溫度降低從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如重組人生長(zhǎng)激素（recombinant human growth hormone，rhGH）在高剪切力作用下，雖然構(gòu)象未發(fā)生變化，但其焓值發(fā)生了明顯變化［35］。

在蛋白類藥物的實(shí)際運(yùn)輸過(guò)程中，雖然難以發(fā)生高剪切力作用，但可能由于多種因素的共同作用導(dǎo)致蛋白類藥物的聚集，如蛋白類藥物濃度越高，蛋白質(zhì)在疏水作用下越容易自發(fā)展開(kāi)折疊進(jìn)而形成聚集體。因此，應(yīng)充分考慮運(yùn)輸路線、交通工具、運(yùn)輸距離、運(yùn)輸時(shí)間、裝載模式、外界環(huán)境等因素。通過(guò)試驗(yàn)，在運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)確認(rèn)產(chǎn)品處于擬定的保存條件下可以保持產(chǎn)品的穩(wěn)定性［36］。目前，對(duì)于運(yùn)輸振蕩的模擬，一般采用渦流振蕩器法、搖床振蕩法和振動(dòng)試驗(yàn)機(jī)法。Fleischman等［37］采用渦流振蕩器、搖床和振動(dòng)試驗(yàn)機(jī)來(lái)模擬運(yùn)輸對(duì)IgG1和IgG4的影響，發(fā)現(xiàn)振動(dòng)試驗(yàn)機(jī)能夠預(yù)測(cè)在實(shí)時(shí)運(yùn)輸過(guò)程中，單克隆抗體在西林瓶和預(yù)灌封注射器中發(fā)生的聚集，而其他方法不能實(shí)時(shí)預(yù)測(cè)，表明振動(dòng)試驗(yàn)機(jī)是模擬蛋白類藥物在實(shí)際運(yùn)輸過(guò)程中蛋白質(zhì)聚集的有效手段。

3 提高蛋白類藥物穩(wěn)定性策略

雖然以提高蛋白類藥物穩(wěn)定性的新技術(shù)或手段較多，但目前仍以物理和化學(xué)兩種策略為主。在物理策略上，主要通過(guò)改變劑型或調(diào)整緩沖液的組分以達(dá)到提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的目的。目前蛋白類藥物劑型主要為注射劑或粉針劑。粉針劑是采用冷凍干燥制得，其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性比注射劑更強(qiáng)，主要是由于蛋白質(zhì)在冷凍干燥后其分子在介質(zhì)中的熱運(yùn)動(dòng)及相互作用降低，并且制劑中的賦形劑也可維持蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，從而其穩(wěn)定性也大大提高［38-39］。因此，對(duì)于不穩(wěn)定的蛋白主要采用冷凍干燥制成粉針。在冷凍干燥中使用的賦形劑主要有糖類或糖醇（如甘露醇、葡糖糖等）、氨基酸（如組氨酸［40］、精氨酸等［41］）、表面活性劑（如吐溫20、吐溫80 等）、聚集物（如乙二醇、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等［42］）。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，脂質(zhì)體包埋［43］、納米微球［44］、聚電解質(zhì)［45］等也是提高蛋白類藥物穩(wěn)定性的有效有段，其可以較好地抵抗溫度、pH 造成的蛋白質(zhì)降解。在注射制劑中，調(diào)整緩沖液的pH或組分是提高蛋白類藥物穩(wěn)定性最常用的策略［46］。蛋白類藥物易受到pH的影響，因此，將蛋白類藥物調(diào)整到穩(wěn)定性的范圍內(nèi)是最經(jīng)濟(jì)的手段。在組分添加中，主要添加物有表面活性劑、糖類等物質(zhì)。表面活性劑中吐溫-80 應(yīng)用最廣泛，其可以防止蛋白聚集，從而達(dá)到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的目的［47］。糖類可通過(guò)非特異性的靜電作用提高蛋白類藥物的穩(wěn)定性［48］。

在化學(xué)策略上，主要是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾以達(dá)到穩(wěn)定的目的，主要手段有定點(diǎn)突變、聚乙二醇修飾、糖基化修飾、脂肪酸修飾及末端修飾等，其中聚乙二醇修飾及脂肪酸修飾是最成功的手段，均有大量商業(yè)化產(chǎn)品上市。定點(diǎn)突變主要是通過(guò)對(duì)不穩(wěn)定的氨基酸殘基側(cè)鏈進(jìn)行替換，且不對(duì)活性中心進(jìn)行修飾，以達(dá)到不影響其活性且增加穩(wěn)定性的目的。Palmer 等［49］發(fā)現(xiàn)蛋白G在堿性條件下，Asn37 殘基易發(fā)生降解導(dǎo)致其蛋白不穩(wěn)定，而將其位置突變?yōu)門hr 后發(fā)現(xiàn)其耐堿性增加8 倍。用聚乙二醇對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾后形成了大量的氫或離子鍵，這些親水健的形成，會(huì)提高其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期，如商業(yè)化聚乙二醇化人粒細(xì)胞刺激因子等。糖基化修飾是對(duì)蛋白質(zhì)的N-糖基、O-糖基、C-糖基以及糖基磷脂酰肌醇等進(jìn)行修飾，是最簡(jiǎn)便、有效的工具［50］。CH2結(jié)構(gòu)域是人類IgG 恒定區(qū)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，但其最不穩(wěn)定。有研究者［51］對(duì)CH2結(jié)構(gòu)域的糖基化進(jìn)行修飾，構(gòu)建出不含糖基化的CH2結(jié)構(gòu)域后，發(fā)現(xiàn)其不會(huì)造成蛋白聚集，其免疫原性也更強(qiáng)，表明CH2結(jié)構(gòu)域的糖基化易造成蛋白聚集。脂肪酸修飾也是商業(yè)化較為成功的方法，如利拉魯肽等均已成功上市。脂肪酸修飾后的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性更強(qiáng)，還有利于提高其脂溶性［52］。末端修飾主要應(yīng)用于多肽類藥物，多肽中的靜電作用力是維持肽鏈結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性的主要應(yīng)力，因此，對(duì)肽鏈末端進(jìn)行修飾可加強(qiáng)靜電作用進(jìn)而提高多肽的穩(wěn)定性。Zheng 等［53］將神經(jīng)六肽的N 端和C 端分別連接Phe 和Thr 后發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，且不易發(fā)生聚集。

4 展望

強(qiáng)制降解是蛋白類藥物研發(fā)過(guò)程中最重要的一環(huán)，其可以闡明蛋白類藥物的內(nèi)在穩(wěn)定性及降解機(jī)制，從而為分析方法的建立及制劑開(kāi)發(fā)等指明方向。強(qiáng)制降解條件是強(qiáng)制降解研究成功的關(guān)鍵，但目前強(qiáng)制降解條件與穩(wěn)定性研究試驗(yàn)條件相比缺少相關(guān)的指南和建議，對(duì)蛋白類藥物的強(qiáng)制降解條件主要依靠蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和研究人員經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行確定，因此，需要質(zhì)量研究人員對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有清楚的認(rèn)知，雖然藥典中未對(duì)強(qiáng)制降解的批次進(jìn)行要求，但在前期試驗(yàn)條件探索過(guò)程中，需要大量的試驗(yàn)和批次才能確認(rèn)較好的試驗(yàn)條件。在強(qiáng)制降解試驗(yàn)中制劑使用的包材（如預(yù)灌封注射器、西林瓶等）質(zhì)量較穩(wěn)定，然而在原液中使用的包材大多數(shù)為重復(fù)使用的材料，質(zhì)量穩(wěn)定性較差，容易對(duì)試驗(yàn)造成干擾，因此，建議使用質(zhì)量較好的且未使用的原液包材進(jìn)行強(qiáng)制降解，以保證批次間的一致性。

綜上所述，反復(fù)凍融和震蕩或攪拌主要引起蛋白質(zhì)物理不穩(wěn)定性，造成蛋白質(zhì)的聚集，而高溫、氧化、光照可以引起蛋白質(zhì)化學(xué)不穩(wěn)定性，造成蛋白質(zhì)氨基酸氧化、脫酰胺等，從而使蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白類藥物失活。此外，一些緩沖液或制劑成分會(huì)加速蛋白質(zhì)的降解，如金屬離子、還原糖等。目前強(qiáng)制降解試驗(yàn)中仍存在降解程度過(guò)低的問(wèn)題，導(dǎo)致長(zhǎng)期試驗(yàn)中難以發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)，進(jìn)而造成檢測(cè)條件不合理，影響患者身體健康；同時(shí)，也存在降解條件過(guò)于劇烈，檢測(cè)到降解產(chǎn)物再次降解，這些次級(jí)降解產(chǎn)物在藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)中很難出現(xiàn)，造成方法及降解產(chǎn)物毒理學(xué)研究過(guò)度。在強(qiáng)制降解試驗(yàn)中也存在分析方法靈敏度過(guò)低、方法不合理的問(wèn)題，這需要對(duì)于可能降解的產(chǎn)物采用更加靈敏的方法，如質(zhì)譜法、核磁共振等進(jìn)行分析，以期確定其結(jié)構(gòu)或者可能發(fā)生降解的位點(diǎn)，為制劑配方的開(kāi)發(fā)或穩(wěn)定性改造奠定研究基礎(chǔ)。此外，強(qiáng)制降解條件的合理設(shè)計(jì)是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。本文為蛋白類藥物研發(fā)人員的強(qiáng)制降解條件的選擇以及降解產(chǎn)物的分析提供了理論參考。