楊靖雯， 周海文

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔黏膜病科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國家口腔醫(yī)學(xué)中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海（200011）

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種新型非編碼RNA，1976 年circRNA 在植物病毒中被首次發(fā)現(xiàn)，描述為“共價閉合的單鏈環(huán)狀RNA 分子”，起初被認(rèn)為是RNA 異常剪接的副產(chǎn)物［1］。隨著RNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)circRNA在生物的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用：miRNA 海綿功能、調(diào)節(jié)可變剪接以及調(diào)節(jié)基因表達(dá)［2］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)circRNA 在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和耐藥性中起著至關(guān)重要的作用，且circRNA 在外泌體和人體體液中含量豐富，可通過細(xì)胞間通訊對腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響［3］。circRNA 主要由外顯子環(huán)化形成，廣泛穩(wěn)定存在于生物體內(nèi)，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可作為疾病的生物標(biāo)志物，在臨床診斷和治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾是發(fā)生在堿基腺嘌呤（A）第六位N 原子上的甲基化，主要發(fā)生在RRACH 序列中的A 上。近年研究發(fā)現(xiàn)，m6A 甲基化修飾circRNA 在人胚胎干細(xì)胞中顯示出特異性甲基化模式，m6A 修飾可促進(jìn)circRNA 降解、核輸出，并對circRNA 翻譯有調(diào)控作用［4］。本文就circRNA m6A 甲基化修飾在機(jī)體生理過程、惡性腫瘤及口腔疾病中的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 m6A 修飾概述

m6A 甲基化修飾是一個動態(tài)且可逆的過程，這種修飾由3 種調(diào)節(jié)蛋白控制，分別是甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和閱讀蛋白。①甲基轉(zhuǎn)移酶促使RNA m6A 甲基化，甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3/14（methyltransferase-like 3/14，METTL3/14）可形成復(fù)合物使RNA m6A 甲 基 化，Wilmstunwell binding 蛋 白 輔 助METTL3/14 定位并維持體內(nèi)m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶的催化活性［5］，此外，RNA 結(jié)合基序蛋白15/15B（RNAbindingmotifprotein 15/15B，RBM15/15B）和類病毒m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶（vir-like m6A methyltransferase associated，VIRMA）在調(diào)節(jié)METTL3 和METTL14 活動中發(fā)揮重要作用［6］；②去甲基化酶執(zhí)行RNA 去甲基化功能，肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）和alkB 同 源 物5（demethylated by human AlkB homolog H5，ALKBH5）一起維持轉(zhuǎn)錄組中m6A 水平的平衡［7-8］；③閱讀蛋白可識別m6A 位點(diǎn)并結(jié)合甲基化RNA，其中最突出的是含有YTH 結(jié)構(gòu)域的RNA 結(jié)合蛋白，在細(xì)胞質(zhì)中特異性識別m6A 修飾的mRNA，能與m6A RRACH 片段重疊以介導(dǎo)RNA 特異性結(jié)合［9］，此外，閱讀蛋白還包括異質(zhì)核核糖核蛋白（eterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNP）家族（HNRNPC/HNRNPG/HNRNPL/HNRNPA2B1）［10］、胰島素樣生長因子2 結(jié)合蛋白家族（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BP1/2/3）及PRRC2A。

2 m6A 修飾對circRNA 的調(diào)控作用

2.1 m6A 修飾調(diào)節(jié)circRNA 翻譯

Yang 等［11］發(fā)現(xiàn)m6A 基序通過募集YTH m6A RNA 結(jié)合蛋白1（YTH m6A RNA binding protein 1，YTHDF1）和翻譯起始因子eIF4G2/eIF3A 啟動并誘導(dǎo)circRNA 翻譯，且數(shù)百種的內(nèi)源性circRNA 具有翻譯潛力。近期研究表明，m6A 修飾可通過YTHDF3 和eIF4G2 的識別調(diào)節(jié)circRNA 翻譯［12］。

2.2 m6A 修飾促進(jìn)circRNA 的核輸出

Chen 等［13］首次發(fā)現(xiàn)m6A 修飾會促進(jìn)circRNA的核輸出：YTHDC1 可與源自NOP2/Sun 結(jié)構(gòu)域家族成員2（NOP2/Sun domain family member 2，NSUN2）的circNSUN2 結(jié)合，促進(jìn)circNSUN2 以m6A 依賴性方式從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)。此外有研究發(fā)現(xiàn)，Hel25E 的同源蛋白UAP56 和URH49 可介導(dǎo)不同長度的circRNA 的出核，然而兩者對circRNA 長度測量的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚［14］。

2.3 m6A 修 飾 促 進(jìn)circRNA 降 解

由于封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，circRNA 不易被水解，往往比其親本線性RNA 更穩(wěn)定。m6A 甲基化修飾的circRNA 依賴熱反應(yīng)蛋白-12（heat-responsive protein 12，HRSP12）與YTHDF2 結(jié)合，通過核糖核酸內(nèi)切酶切割選擇性降解circRNA［15］。

3 circRNA m6A 甲基化修飾在機(jī)體生理過程中的作用

3.1 免疫系統(tǒng)

研究表明m6A 甲基化修飾可調(diào)控免疫反應(yīng)，circRNA 為封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能逃離末端監(jiān)控系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體通過YTHDF2 識別m6A 以辨認(rèn)“自身”circRNA，抑制RIG-I 激活從而抑制先天免 疫［16］。 此 外，源 自NDUFB2 的circNDUFB2（hsa_circ_0007518）可觸發(fā)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的免疫防御反應(yīng)，通過RIG-I 識別以激活RIG-I-MAVS信號級聯(lián)，將免疫細(xì)胞募集到腫瘤微環(huán)境中［17］。

3.2 生殖系統(tǒng)

在雌性生殖系統(tǒng)中，METTL14 介導(dǎo)的m6A 甲基化修飾改變了circGFRα1 向細(xì)胞質(zhì)的輸出，circ-GFRα1 通過充當(dāng)競爭性內(nèi)源性RNA 促進(jìn)雌性生殖系干細(xì)胞自我更新，吸附miR-449，增強(qiáng)GFRα1表達(dá)和激活膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路［18］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在雄性生殖細(xì)胞中，ALKBH5 和METTL3 通過調(diào)節(jié)m6A 水平影響circRNA生物合成，circRNA 在減數(shù)分裂晚期和早期單倍體雄性生殖細(xì)胞中積累并發(fā)揮作用，持續(xù)供應(yīng)對晚期精子發(fā)生和正常精子功能至關(guān)重要的蛋白質(zhì)［19］。

3.3 肌細(xì)胞

隨著成肌細(xì)胞發(fā)育分化，eIF4G2 和m6A 閱讀蛋白YTHDF3 的mRNA 相對表達(dá)水平增加，m6A 可驅(qū)動circRNA 翻譯，并預(yù)測骨骼肌C2C12 成肌細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)的circRNA 的功能和編碼潛力［20］。在高糖處理的血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)circYTHDC2 的穩(wěn)定受YTHDC2 介導(dǎo)的m6A 修飾正向調(diào)節(jié)，而circYTHDC2上調(diào)可由血管平滑肌細(xì)胞中的高葡萄糖刺激誘導(dǎo)，敲除circYTHDC2 可抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和侵襲并阻止細(xì)胞周期進(jìn)程［21］。

4 circRNA m6A 甲基化修飾在惡性腫瘤中的作用

此前，m6A 甲基化修飾的研究僅局限于mRNA水平，直至2017 年Yang 等［11］報道了由m6A 甲基化驅(qū)動的廣泛翻譯，首次探索了m6A 修飾對circRNA的調(diào)控作用，為circRNA 水平的m6A 修飾研究開啟了新篇章。該研究發(fā)現(xiàn)circRNA 含有大量共有m6A 基序，且在翻譯起始因子eIF4G2 和m6A 閱讀蛋白YTHDF3 介導(dǎo)單個m6A 位點(diǎn)驅(qū)動翻譯起始，并被甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14 增強(qiáng)，被去甲基酶FTO 抑制。研究發(fā)現(xiàn)circRNA m6A 修飾在結(jié)直腸癌［22］和肝癌［23］發(fā)生發(fā)展中也具有重要調(diào)控作用，m6A 修飾誘導(dǎo)circ1662 剪接與表達(dá)可加速YES 關(guān)聯(lián)蛋白1 重組蛋白核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移；hsa_circ_0007456 通過與hsa-miR-139-5p 結(jié)合促進(jìn)YTHDF1 表達(dá)，從而促進(jìn)HCC 細(xì)胞增殖。值得注意的是，Chen 等［13］在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中發(fā)現(xiàn)了m6A 甲基化可促進(jìn)circRNA 的核輸出，circNSUN2 通過YTHDC1 與IGF2BP2 從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，增強(qiáng)下游靶基因HMGA2 的mRNA 穩(wěn)定性，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲性，此研究結(jié)果為結(jié)直腸癌提供了一個潛在的治療靶點(diǎn)circNSUN2。近年來研究發(fā)現(xiàn)circRNA m6A 修飾還在宮頸癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、下咽鱗癌、肺動脈高壓和胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用［24］。

5 circRNA m6A 甲基化修飾在口腔領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

目前，circRNA 水平的m6A 甲基化修飾在口腔方向的文獻(xiàn)極少，研究僅限于在成釉細(xì)胞瘤和口腔種植骨吸收方向初步研究。Niu 等［25］首次提供了人類成釉細(xì)胞瘤的m6A 修飾表達(dá)譜全景觀，認(rèn)為m6A 修飾影響長鏈非編碼RNA 和circRNA 的加工，并鑒定了具有高甲基化或低甲基化m6A 修飾的差異表達(dá)的mRNA，這可能有助于觀察m6A 介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。在口腔種植方向，RNA 甲基化酶METTL3 作用于成骨細(xì)胞外泌體中circ_0008542 的m6A 功 能 位 點(diǎn)，促 進(jìn)circ_0008542 與miRNA-185-5p 的競爭結(jié)合，導(dǎo)致靶基因RANK（receptor activator of NF-kB）的增加和破骨細(xì)胞骨吸收的啟動；而RNA 去甲基化酶ALKBH5 抑制circ_0008542 與miRNA-185-5p 的結(jié)合，從而糾正骨吸收過程，提示可使用釋放ALKBH5 的外泌體增強(qiáng)即刻種植體的抵抗力［26］。

此外，口腔扁平苔蘚組織異常表達(dá)的circRNAs表達(dá)譜已構(gòu)建，表明circRNA 在OLP 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用［27］。Xu 等［28］發(fā)現(xiàn)circRNA 在口腔潛在惡性疾病——口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）中發(fā)揮重要作用，構(gòu)建了OLK circRNA 表達(dá)譜并對OLK 中的差異circRNA 進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，源于人白細(xì)胞抗原-C（human leukocyte antigen-C，HLA-C）的circHLA-C 是一種很有前景的診斷生物標(biāo)志物，具有作為OLK 治療性遺傳靶點(diǎn)的潛力；Hsa_circ_0060927 可作為潛在的關(guān)鍵ceRNA，通過上調(diào)三結(jié)構(gòu)域蛋白14（tripartite motifcontaining 14，TRIM14）海綿下游miR-195-5p 并促進(jìn)OLK 癌變，Hsa_circ_0060927 有望成為通過hsa_circ_0060927/miR-195-5p/TRIM14 軸預(yù)防和治療OLK 致癌的分子標(biāo)志物［29］。但circRNA 水平的m6A 甲基化修飾在口腔惡性及潛在惡性疾病方向的研究仍較少。

m6A 修飾與OSCC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中研究最多的是m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3 與METTL14 在OSCC 中的作用，但關(guān)于circRNA 的m6A 修飾在OSCC 及口腔潛在惡性疾病中的研究未見報道，因此筆者僅從m6A 相關(guān)酶在OSCC 中的研究闡述m6A 甲基化修飾在OSCC 中的研究現(xiàn)狀。①M(fèi)ETTL3 是調(diào)節(jié)OSCC 腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素，通過YTHDF1 介導(dǎo)的m6A 修飾增強(qiáng)c-Myc 穩(wěn)定性，促進(jìn)OSCC 發(fā) 生［30］；METTL3 介 導(dǎo) 的m6A 修 飾 促 進(jìn)BMI1 mRNA 翻譯并增強(qiáng)OSCC 的增殖和轉(zhuǎn)移［31］；METTL3 還可通過m6A 介導(dǎo)閱讀蛋白IGF2BP2 結(jié)合 增 強(qiáng)SLC7A11 的mRNA 穩(wěn) 定 性，促 進(jìn)OSCC 進(jìn)展［32］；此外，當(dāng)OSCC 細(xì)胞自噬被激活時，METTL14的表達(dá)上調(diào)，METTL14 的高表達(dá)可有效降低OSCC的增殖、遷移和侵襲［33］。②m6A 去甲基化酶FTO可靶向作用于OSCC 中的eIF4G1 轉(zhuǎn)錄本并調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和腫瘤發(fā)生；在雷帕霉素誘導(dǎo)的OSCC 自噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，敲低FTO 表達(dá)后導(dǎo)致eIF4G1 下調(diào)，同時促進(jìn)自噬并抑制腫瘤發(fā)生［34］；FTO 在有咀嚼檳榔習(xí)慣的OSCC 患者黏膜組織和慢性檳榔堿處理的OSCC 細(xì)胞系中上調(diào)，且FTO 在OSCC 細(xì)胞中受到FOXA2 轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控，表明FTO 在檳榔堿誘導(dǎo)的OSCC 進(jìn)展中發(fā)揮致癌作用［35］；③m6A 閱讀蛋白HNRNPL 可調(diào)節(jié)OSCC 組織中SRSF3 的表達(dá)和SRSF3 外顯子的可變剪接［36］，研究表明HNRNPC 可促進(jìn)OSCC 的癌變，可能成為OSCC 新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［37］；沉默HNRNPA2B1 可通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）抑制OSCC 的增殖、遷移和侵襲，HNRNPA2B1 可能具有通過LINE-1/TGF-β1/Smad2/Slug 信號通路靶向EMT 促進(jìn)OSCC 癌變的潛力［38］。

6 小 結(jié)

綜上所述，circRNA m6A 修飾在多種良惡性疾病中發(fā)揮重要臨床價值，但在口腔領(lǐng)域僅處于初步探索階段。circRNA m6A 修飾在口腔惡性疾病和潛在惡性疾病中的作用有廣闊的研究前景，深入探索circRNA m6A 修飾在口腔疾病中的調(diào)控機(jī)制，為口腔惡性疾病及口腔潛在惡性疾病的診斷與治療提供參考。

【Author contributions】Yang JW wrote the article. Zhou HW revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.