王斯亮，羅序梅，張傳溪,3*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院昆蟲科學(xué)研究所，杭州 310058；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 溫州 325006；3.寧波大學(xué)植物病毒學(xué)研究所，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和浙江省植物保護(hù)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波315211）

神經(jīng)肽廣泛存在于低等和高等生物中，作為激素、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)發(fā)揮生理功能。褐飛虱（Nilaparvata lugens）是我國(guó)南方稻區(qū)的首要害蟲，主要吸食水稻葉鞘韌皮部的汁液，田間褐飛虱種群的為害造成“虱燒”現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起大面積水稻枯稈倒伏[1]。對(duì)于害蟲的綠色防治，利用天敵、病原微生物以及特異性環(huán)境友好型農(nóng)藥是重要的方法。得益于褐飛虱基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的解析以及褐飛虱系統(tǒng)性RNA干擾操作體系的建立[2-3]，褐飛虱的功能基因組的研究正在逐步開展，其中，分析鑒定得到的褐飛虱重要生理功能基因，具有成為防治褐飛虱的特異性農(nóng)藥靶標(biāo)的潛力。神經(jīng)肽在昆蟲中承擔(dān)著調(diào)控多種重要生理功能的作用，包括蛻皮、取食、求偶、繁殖、形體表觀發(fā)育等[4-5]。一些神經(jīng)肽（如影響蛻皮的神經(jīng)肽）的功能缺失或失調(diào)會(huì)造成昆蟲重要的形態(tài)或生理缺陷，或使昆蟲死亡。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多的昆蟲神經(jīng)肽通過組學(xué)方法被識(shí)別。TANAKA等[6]通過對(duì)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組的分析，搜索鑒別到一系列神經(jīng)肽以及相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體的同源基因序列。與此相同，本研究對(duì)褐飛虱神經(jīng)肽及其受體基因進(jìn)行RNA 干擾，對(duì)神經(jīng)肽生理功能進(jìn)行篩查驗(yàn)證，期望得到具有敲減后致死致畸表型的神經(jīng)肽基因，以及對(duì)尚未明確功能的神經(jīng)肽進(jìn)行功能分析。本文也概覽了褐飛虱神經(jīng)肽的生理功能，篩選出對(duì)褐飛虱存活率和發(fā)育有明顯影響的神經(jīng)肽及其受體基因，為害蟲的綠色防控提供了新的潛在靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

褐飛虱試蟲于2008 年采集自浙江大學(xué)華家池校區(qū)（30°16′35.21″ N，120°11′37.16″ E），傳代飼養(yǎng)至今。用于飼養(yǎng)褐飛虱的水稻品種為‘秀水134’。飼養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照周期16 h/8 h（光照/黑暗）。

1.2 序列查找

利用TANAKA 等[6]報(bào)道的褐飛虱神經(jīng)肽及其受體基因cDNA 序列，通過Blast 2.2.29+程序，在褐飛虱轉(zhuǎn)錄組和基因組中搜索比對(duì)，并搜索可變剪接本的存在，通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）和克隆測(cè)序驗(yàn)證，得到用于設(shè)計(jì)雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA）的褐飛虱神經(jīng)肽及其受體基因的模板序列。

1.3 RNA 干擾（RNA interference,RNAi）

在特異性引物的5′端添加T7 啟動(dòng)子，利用MEGAscript T7 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（MEGAscript T7 Transcription Kit，美國(guó)Ambion 公司）合成目標(biāo)基因的dsRNA（根據(jù)不同基因的開放閱讀框長(zhǎng)度，dsRNA 長(zhǎng)度范圍設(shè)計(jì)為200～500 bp），用無核酸酶的水將dsRNA溶液稀釋為5 μg/μL。注射綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因的dsRNA（dsGFP）組作為陰性對(duì)照。使用FemtoJet顯微注射儀（德國(guó)Eppendorf公司）將dsRNA注射到褐飛虱體內(nèi)，每組選取50～100 頭若蟲進(jìn)行注射，3 齡若蟲每頭注射20 nL，5 齡若蟲每頭注射100 nL。干擾后2～3 d取蟲樣提取總RNA，采用定量PCR驗(yàn)證干擾效果。為了排除實(shí)驗(yàn)中不同批次的水稻苗的營(yíng)養(yǎng)條件差異造成的背景干擾，本研究采用“成蟲相對(duì)存活率”來代表實(shí)驗(yàn)組中褐飛虱成蟲的存活率，其中，成蟲相對(duì)存活率=實(shí)驗(yàn)組成蟲存活率/對(duì)照組成蟲存活率。

1.4 總RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol 法提取褐飛虱的總RNA。利用cDNA 第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒［HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)］（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系為20 μL，加入1 μg總RNA進(jìn)行反應(yīng)。

1.5 熒光定量PCR 分析

用熒光定量PCR試劑盒（SYBR Green PCR Kit，美國(guó)Bio-Rad公司）制備熒光定量PCR反應(yīng)體系，在Bio-Rad CFX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中反應(yīng)。內(nèi)參基因?yàn)楹诛w虱18S rRNA[7]（Nl18S，GenBank登錄號(hào)為JN662398.1），正向引物為5′-CGCTACTACCGA TTGAA-3′，反向引物為5′-GGAAACCTTGTTACG ACTT-3′。熒光定量PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。利用相對(duì)定量法2－ΔΔCT[8]計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 神經(jīng)肽及其受體基因的功能篩查

通過PCR 擴(kuò)增并驗(yàn)證得到了41 個(gè)神經(jīng)肽基因（含1個(gè)可變剪接本）和44個(gè)受體基因。以褐飛虱3齡若蟲代表低齡若蟲，5齡代表高齡若蟲，利用RNA干擾法沉默目標(biāo)神經(jīng)肽基因，隨后觀察褐飛虱表型。將陰性對(duì)照dsGFP注射入3齡若蟲后，褐飛虱培養(yǎng)至成蟲的存活率在0.6左右，而在注射5齡若蟲后，培養(yǎng)至成蟲的存活率在0.9左右。結(jié)果（表1）顯示：在褐飛虱3 齡時(shí)進(jìn)行注射，RNA 干擾后成蟲相對(duì)存活率＜0.2的有4個(gè)神經(jīng)肽基因，即NlCCAP［編碼甲殼類動(dòng)心肽（crustacean cardioactive peptide,CCAP）］、NlETH［編碼蛻皮誘導(dǎo)激素（ecdysis triggering hormone,ETH）］、NlOKA［編碼螯蝦激肽（orcokinin,OK）］和NlPK［編碼焦谷氨酸激肽（pyrokinin,PK）］。其余基因沉默后，成蟲相對(duì)存活率都在0.6以上。在褐飛虱5 齡時(shí)進(jìn)行注射，對(duì)所有基因進(jìn)行RNA 干擾后成蟲相對(duì)存活率＞0.5。NlCCAP和NlETH基因的沉默對(duì)低齡若蟲具有劇烈的致死效果，但對(duì)高齡若蟲的致死效果不明顯。在低齡若蟲中進(jìn)行RNA 干擾造成高死亡率的基因有NlPK和NlOKA，而在高齡若蟲中RNA 干擾此類基因卻不具有致死效果，成蟲相對(duì)存活率＞0.9。

表1 褐飛虱神經(jīng)肽基因的RNA干擾效果Table 1 RNAi effects of neuropeptide genes in N.lugens

通過對(duì)神經(jīng)肽基因功能的篩查驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)4 種神經(jīng)肽基因NlETH、NlCCAP、NlPK、NlOKA經(jīng)RNA干擾后可造成蛻皮階段致死的表型。Nlburs-a和Nlburs-b（分別編碼鞣化激素的2個(gè)亞基）受到干擾后，褐飛虱成蟲無法展翅。神經(jīng)肽基因Nlelevenin受到干擾后，褐飛虱體壁顏色黑化。在3 齡若蟲階段，上述這些神經(jīng)肽基因沉默后產(chǎn)生明顯的表型變化，而在5 齡若蟲階段受到干擾后表型變化不顯著。

對(duì)受體基因進(jìn)行RNA干擾發(fā)現(xiàn)，當(dāng)干擾3齡若蟲時(shí)，僅NlA36（PK 受體基因）和NlA46（鞣化激素受體基因）經(jīng)干擾后成蟲相對(duì)存活率＜0.2，其余均大于0.5。5 齡若蟲中NlA46經(jīng)干擾后成蟲仍有較高的死亡率，其相對(duì)存活率約為0.3（表2）。對(duì)NlA42與Nlelevenin進(jìn)行干擾后產(chǎn)生的褐飛虱表型變化一致，均為體壁黑化[9]。

表2 褐飛虱神經(jīng)肽受體基因的RNA干擾效果Table 2 RNAi effects of neuropeptide receptor genes in N.lugens

表2（續(xù)） Continuation of Table 2

針對(duì)受RNA 干擾后產(chǎn)生明顯外觀變化的神經(jīng)肽 及 其 受 體 基 因Nlburs-a、Nlburs-b、NlCCAP、NlETH、Nlelevenin、NlA36、NlA42和NlA46，我們分別設(shè)計(jì)了與原干擾片段不重疊的另一段干擾片段，通過觀察干擾后產(chǎn)生的表型是否一致來驗(yàn)證是否存在脫靶效應(yīng)。結(jié)果顯示，所有基因在新雙鏈RNA的干擾下產(chǎn)生的表型與原雙鏈RNA的一致，且干擾效率均達(dá)到65%以上。

2.2 經(jīng)典蛻皮相關(guān)神經(jīng)肽在褐飛虱中的表現(xiàn)

2.2.1 蛻皮誘導(dǎo)激素（ETH）

對(duì)褐飛虱3齡若蟲進(jìn)行RNA干擾，發(fā)現(xiàn)NlETH沉默后，若蟲主要在4 齡末和5 齡末蛻皮前死亡。對(duì)4 齡若蟲注射dsNlETH，蛻皮前死亡的現(xiàn)象主要出現(xiàn)在5齡末；對(duì)5齡若蟲進(jìn)行干擾，褐飛虱成蟲只有約一半表現(xiàn)為蛻皮前死亡（圖1）。

圖1 褐飛虱在NlETH基因經(jīng)RNA干擾后的存活率和表型Fig.1 Survival rates and phenotypes of N.lugens with NlETH knockdown after RNAi

2.2.2 甲殼類動(dòng)心肽（CCAP）

本研究對(duì)褐飛虱3齡若蟲注射dsNlCCAP后，發(fā)現(xiàn)其在4 齡至5 齡蛻皮以及5 齡至成蟲蛻皮期間死亡，蛻裂線沒有完全打開，整個(gè)蟲體無法從舊皮中脫出（圖2）。與NlETH相似，NlCCAP在褐飛虱中的沉默表型也表現(xiàn)為跨齡期的模式。對(duì)4齡若蟲進(jìn)行干擾，蛻皮受阻的表型主要出現(xiàn)在5 齡蛻皮至成蟲階段；對(duì)5齡若蟲進(jìn)行干擾，則大部分褐飛虱能正常蛻皮羽化為成蟲。

圖2 褐飛虱在NlCCAP 基因經(jīng)RNA 干擾后的存活率和表型Fig.2 Survival rates and phenotypes of N. lugens with NlCCAP knockdown after RNAi

2.2.3 鞣化激素

鞣化激素是由2個(gè)不同基因編碼的亞基組成的神經(jīng)肽類激素。在褐飛虱中，編碼鞣化激素2 個(gè)亞基的基因分別為Nlburs-a和Nlburs-b。

在針對(duì)編碼鞣化激素基因的RNA 干擾實(shí)驗(yàn)中，對(duì)Nlburs-a及Nlburs-b進(jìn)行獨(dú)立干擾時(shí)不影響另一個(gè)亞基的表達(dá)量（圖3）。注射dsNlburs-a和dsNlburs-b產(chǎn)生的表型變化一致，均是造成成蟲展翅不正常（圖4）。在不同齡期干擾鞣化激素基因，均對(duì)褐飛虱的存活率沒有顯著影響，但產(chǎn)生的表型有所不同。在3齡若蟲時(shí)期進(jìn)行RNA干擾，褐飛虱發(fā)育至成蟲時(shí)翅發(fā)育嚴(yán)重畸形，表現(xiàn)為無法正常伸展；在4齡若蟲時(shí)期進(jìn)行干擾，成蟲的翅仍無法正常伸展，但翅展面積比3齡若蟲時(shí)期干擾時(shí)稍大；而在5 齡若蟲時(shí)期進(jìn)行干擾，成蟲翅面能伸展至透明狀態(tài)，但仍有部分彎曲。隨著注射的蟲齡增加，干擾后產(chǎn)生的卷翅成蟲的比例也越少（圖5）。編碼鞣化激素的基因經(jīng)干擾后，褐飛虱表型呈現(xiàn)越低齡期進(jìn)行干擾，受到的影響越嚴(yán)重。對(duì)鞣化激素的受體基因NlA46進(jìn)行干擾，結(jié)果（圖6）顯示產(chǎn)生的外觀表型與Nlburs-a和Nlburs-b沉默的效應(yīng)一致，但不同的是成蟲的死亡率較高，此時(shí)大部分成蟲蛻皮后表皮柔軟，鞣化過程明顯受阻，最終死亡。該結(jié)果揭示了神經(jīng)肽受體基因經(jīng)RNA 干擾后產(chǎn)生的效應(yīng)比配體基因受干擾后更劇烈。

圖3 注射不同的dsRNA 后編碼鞣化激素的2 個(gè)亞基的基因表達(dá)量變化Fig.3 Expression level changes of genes encoding two subunits of bursicon after injected with different dsRNAs

圖4 褐飛虱在Nlburs-a和Nlburs-b基因經(jīng)RNA干擾后的存活率和表型Fig.4 Survival rates and phenotypes of N. lugens with Nlburs-a and Nlburs-b knockdown after RNAi

圖5 褐飛虱不同齡期干擾鞣化激素基因?qū)Τ上x表型（A）及成蟲卷翅率（B）的影響Fig.5 Effects of bursicon knockdown on phenotypes(A)and wing-unstretched rates of adults(B)in different instars of N.lugens

圖6 褐飛虱在NlA46基因經(jīng)RNA干擾后的存活率和表型Fig.6 Survival rates and phenotypes of N.lugens with NlA46 knockdown after RNAi

3 討論

RNA 干擾應(yīng)用于害蟲防治是一種可行的策略[10]。本研究通過RNA 干擾方法對(duì)褐飛虱神經(jīng)肽及其受體基因的生理功能進(jìn)行篩查，以成蟲相對(duì)存活率=0.5為界，發(fā)現(xiàn)在干擾3齡若蟲時(shí)，在神經(jīng)肽基因中，僅NlCCAP、NlETH、NlOKA和NlPK在褐飛虱3 齡階段沉默后可造成存活率顯著降低的現(xiàn)象；受體基因中NlA36（PK 受體基因）和NlA46（鞣化激素受體基因）受干擾后成蟲相對(duì)存活率＜0.5。然而CCAP的受體基因NlA27以及ETH的受體基因NlA6沉默后沒有產(chǎn)生明顯的表型變化。而這些在低齡若蟲中被干擾產(chǎn)生致死現(xiàn)象的基因，在高齡（5 齡）若蟲中被干擾時(shí)，除了NlA46外其余均沒有產(chǎn)生明顯的致死效果。

蛻皮是包括昆蟲在內(nèi)的節(jié)肢動(dòng)物的重要生理過程。由于表皮以外骨骼的形式存在，個(gè)體的生長(zhǎng)會(huì)受到阻礙，因此就需要在一定階段脫去舊的表皮，使舊表皮內(nèi)已經(jīng)生長(zhǎng)的軀體得到釋放并形成新的表皮。前人的研究表明，蛻皮受多種激素、神經(jīng)肽調(diào)控，包括蛻皮誘導(dǎo)激素（ETH）、甲殼類動(dòng)心肽（CCAP）、促前胸腺激素（prothoracicotropic hormone, PTTH）、羽化激素（eclosion hormone, EH）等[11]。鞣化激素在昆蟲中具有調(diào)控蛻皮后表皮鞣化的重要作用[12-13]。在赤擬谷盜（Tribolium castaneum）中，研究人員對(duì)ETH、EH、CCAP、鞣化激素相應(yīng)的基因進(jìn)行了干擾，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谕懫さ牟煌A段（蛻皮前、蛻皮時(shí)、蛻皮后）中都扮演著重要的角色[14]。而在本研究中，NlCCAP和NlETH基因沉默后，褐飛虱表現(xiàn)出蛻皮受阻或蛻皮前死亡的現(xiàn)象，Nlburs-a、Nlburs-b與NlA46基因沉默后，褐飛虱表現(xiàn)出表皮柔軟、無法正常展翅的現(xiàn)象。這些基因與在其他昆蟲中報(bào)道的功能相似。而PTTH、EH等在其他昆蟲中表現(xiàn)為對(duì)蛻皮有調(diào)控作用的神經(jīng)肽，其在褐飛虱中的相應(yīng)同源基因受干擾后沒有產(chǎn)生明顯的表型。另外幾種褐飛虱中干擾后造成蛻皮受阻現(xiàn)象的基因?yàn)镹lOKA（編碼OK）、NlPK（編碼PK）以及PK 的受體基因NlA36。OK 在家蠶中可以刺激前胸腺的活性，被認(rèn)為可能是蛻皮激素的上游調(diào)控因子[15]。在長(zhǎng)紅獵蝽（Rhodnius prolixus）中，編碼OK 的基因受干擾后也會(huì)造成蛻皮受阻[16]。而PK 的功能仍有很多未解之處，且在不同昆蟲中功能差異很大，如在馬德拉蜚蠊（Leucophaea maderae）中可引起后腸收縮[17]，在家蠶（Bombyx mori）中參與飛行肌的運(yùn)動(dòng)調(diào)控[18]，在麻蠅（Neobellieria bullata）中促進(jìn)化蛹[19]，在甲蟲中調(diào)控臟肌收縮和血糖水平[20]。在本研究中，首次發(fā)現(xiàn)PK在褐飛虱中與蛻皮有關(guān)，不過有關(guān)褐飛虱OK和PK的研究有待深入開展。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究通過RNA 干擾對(duì)褐飛虱神經(jīng)肽及其受體基因進(jìn)行了初步功能篩查，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)神經(jīng)肽基因（NlCCAP、NlETH、NlOKA和NlPK）和2 個(gè)受體基因（NlA36和NlA46）對(duì)褐飛虱的存活至關(guān)重要，具有成為害蟲防治靶標(biāo)的潛力，并初步概覽了褐飛虱神經(jīng)肽的生理功能。對(duì)RNA 干擾后未產(chǎn)生明顯表型變化的神經(jīng)肽及其受體基因，后續(xù)可以對(duì)其進(jìn)行“組合干擾”[21]，觀察這些基因之間是否存在功能互補(bǔ)等，以進(jìn)一步理解褐飛虱神經(jīng)肽/受體信號(hào)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。