郭宇婷，鮑金秋，沙建軍，霍光明*

(1. 南京曉莊學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院/南京市食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，江蘇 南京 211171；2. 南京金時川生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇 南京 211121)

猴頭菇(Hericiumerinaceus)是我國傳統(tǒng)食藥用菌，營養(yǎng)豐富且具有安神、抗癌的作用，對身體虛弱、消化不良、失眠、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、消化道腫瘤等疾病有很好的治療作用[1， 2].目前，猴頭菇的研究主要集中在多糖方向[3-5]，多糖具有較好的活性，但分子結(jié)構(gòu)過大、水溶性較差、血腦屏障通過率較低，多糖活性成分的釋放變得困難，不易被人體消化吸收.與多糖相比，寡糖具有類似多糖的活性，但分子量更小，易被人體吸收利用[6]，但猴頭菇寡糖在有效成分的提取、生理功能研究和結(jié)構(gòu)鑒定等方面鮮見報道.

本研究采用熱水浸提法從猴頭菇子實體中提取寡糖，用蒽酮硫酸法測得寡糖含量，乙醇沉淀制得粗寡糖通過離子交換層析法進行分離純化.通過離子交換色譜法、高效液相色譜法、傅里葉變換紅外光譜方法，測定寡糖樣品中單糖組分、分子量、紅外圖譜等結(jié)構(gòu)信息，并評價寡糖樣品對酪氨酸酶的抑制活性能力.

1 材料和方法

1.1 材料

猴頭菇子實體來源于南京曉莊學(xué)院菌物研究所食用菌生產(chǎn)基地，選取品相優(yōu)良、外觀完整、個頭適中的猴頭菇子實體，剔除根部及霉?fàn)€部分，瀝去多余水分，去皮稱重.將猴頭菇切片處理，放置于烘箱50 ℃下烘干至恒重，制成干猴頭菇片，在高速粉碎機中粉碎成 60目的猴頭菇粉末，以便溶劑能充分浸提其中寡糖物質(zhì).

1.2 實驗方法

1.2.1 猴頭菇寡糖提取、分離和純化

猴頭菇粉(273 g)與石油醚(m：v=1∶5)浸泡除脂，除脂猴頭菇粉末加入蒸餾水(m：v=1∶20)，80 ℃提取12 h，用30～50 μm定性濾紙過濾，濾液濃縮后與乙醇(最終濃度為 80%)混合沉淀，得到乙醇沉淀部分.沉淀部分重新溶解后用5KD超濾膜再生纖維素膜PLCC(美國 Millipore公司)分離，滲透液濃縮后經(jīng) DEAE Sephadex A-50柱分離純化.

1.2.2 單糖組成測定

先取16種單糖標(biāo)準(zhǔn)品配成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用離子色譜儀[7]測定單糖組成，分別精密稱量10.00 mg(H8026和H8053)猴頭菇樣品置于安瓿瓶中，加入3M TFA 10 ml，120 ℃水解3 h.準(zhǔn)確吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)移至管中氮氣吹干，加入10 ml水渦旋混勻，吸取100 μL加入900 μL去離子水，12000 rpm下離心5 min.取上清液進行IC分析.

色譜柱：DionexCarbopacTMPA20(3*150);流動相：A:H2O； B:15 mM NaOH；C: 15 mM NaOH&100 mM NaOAC；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：電化學(xué)檢測器.

1.2.3 分子量測定

精密稱取樣品和標(biāo)準(zhǔn)品右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)配套(Dextran Standards Kit，Sigma)，樣品配制成5 mg/ml溶液，12000 rpm 離心10 min，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，然后將樣品轉(zhuǎn)置于1.8 ml進樣小瓶中.通過HPGPC[8]測定多糖分子量和純度.

色譜柱：BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱(8 × 300 mm)；流動相：0.05 M NaCl溶液；流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL；檢測器：示差檢測器RI-10A.

1.2.4 傅里葉紅外圖譜分析

精密稱取樣品2 mg和溴化鉀 200 mg，壓制成片，空白對照采用溴化鉀粉末壓片而成.分別置于傅里葉變換紅外光譜儀[9]FT-IR650(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)進行掃描記錄，而后分析多糖的官能團.

1.2.5 猴頭菇寡糖抑制酪氨酸酶活性的測定

參照文獻抑制酪氨酸酶活性測定方法[10， 11]，并稍做修改.實驗分為四組，包含陰性對照組、空白組、空白對照組、實驗組.底物為20 mmol/L的L-多巴，不同濃度(包含0.5 、1.0、3.0、5.0、7.0 mg/mL)的猴頭菇寡糖H8026和H8053組分，各濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的VC樣品溶液，將底物與酶的濃度保持恒定，改變抑制劑濃度，測定酶催化活力，得到酶抑制率.反應(yīng)液總體積為200 uL，混勻；在加底物前，先將96孔板放置在酶標(biāo)儀30 ℃下預(yù)熱5 min，反應(yīng)10 min，在波長475 nm下測定，平行實驗3次.酪氨酸酶活性的抑制率計算如下：

抑制率=[(A-B)-(D-C)]/(A-B)×100%

(1)

其中，A(陰性對照):磷酸緩沖液+酪氨酸酶+底物；B(空白組):磷酸緩沖液+底物；C(空白對照組)：磷酸緩沖液+不同濃度(多糖和VC)抑制劑樣品+底物；D(實驗組)：磷酸緩沖液+不同濃度(多糖和VC)抑制劑樣品+酪氨酸酶+底物.

2 結(jié)果與分析

2.1 猴頭菇寡糖的制備

猴頭菇寡糖經(jīng)除脂、水提醇沉和膜過濾后，經(jīng)DEAE Sephadex A-50柱分離純化得到組分H8026和H8053(圖1)，質(zhì)量分別為5.72 g和7.34 g.

圖1 濃度為0.1 mol/L NaOH的80%乙醇沉寡糖洗脫峰圖

2.2 單糖組成分析

采用離子色譜法分析寡糖中單糖組分(圖2).標(biāo)準(zhǔn)母液溶液中16種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(圖2A)為(巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖鹽酸鹽、鹽酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古羅糖醛酸、甘露糖醛酸)，其出峰時間依次為6.125、11.284、11.717、12.384、14.000、15.475、17.517、19.359、20.275、20.850、23.700、25.959、44.675、45.317、47.475、50.184.根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間鑒定H8026和H8053猴頭菇寡糖的單糖組成.

對照圖2A單糖混合對照標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中的主要色譜峰的保留時間，則H8053中的單糖由阿拉伯糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖和木糖組成(圖2B)，其摩爾比例為0.177∶0.010∶0.078∶0.479∶0.019∶0.237(表1)；而H8026由半乳糖、葡萄糖和木糖組成(圖2C)，摩爾比例為0.966∶0.020∶0.014(表1).

圖2 混標(biāo)16糖、H8053單糖及H8026單糖的離子色譜圖

表1 H8026和H8053單糖組成、保留時間、摩爾比以及相應(yīng)面積

2.3 分子量測定

本實驗采用HPLC凝膠色譜法測定猴頭菇寡糖的分子量測定及純度.HPLC凝膠色譜法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點.lgMw-RT(重均分子量)校正曲線方程為：y=-0.1817x+11.798，R2=0.9958；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線，得出計算公式進而計算出樣品的分子量(表2).結(jié)果表明，H8026猴頭菇寡糖在46.897 min出峰，lgMw分別為3.3，重均分子量Mw為1892，峰面積比為82.329%；H8053猴頭菇寡糖出峰時間在46.964 min，lgMw分別為3.3，重均分子量Mw為1839，峰面積比為77.647%.

表2 H8026、H8053猴頭菇寡糖的分子量及峰面積

2.4 猴頭菇寡糖紅外圖譜分析

H8053及H8026寡糖組分的紅外圖譜分析結(jié)果見圖3.H8053在3315cm-1吸收峰是糖類的特征峰，歸因于O-H的伸縮振動.1735cm-1、1695cm-1屬于C=O伸縮振動，1625cm-1屬于N-H變角振動，1403cm-1屬于C-O伸縮振動，1047cm-1、1031cm-1處屬于O-H變角振動[12].H8053在850cm-1處有吸收峰，由此判斷該寡糖是β-吡喃糖.H8026在3423cm-1、3311cm-1是糖類O-H的伸縮振動吸收峰，1735cm-1、1695cm-1屬于C=O伸縮振動，1623cm-1屬于N-H變角振動，1407cm-1屬于C-O伸縮振動，1047cm-1、1031cm-1屬于O-H變角振動[12].

圖3 H8053及H8026寡糖紅外圖譜分析

2.5 猴頭菇寡糖對酪氨酸酶活性的抑制作用

探究猴頭菇寡糖對酪氨酸活性的影響，結(jié)果如表3所示，猴頭菇寡糖H8026、H8053對酪氨酸酶均表現(xiàn)出抑制活性.酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶，以酪氨酸酶為靶標(biāo)，猴頭菇寡糖在抑制褐變等領(lǐng)域有望得到應(yīng)用.

表3 猴頭菇寡糖對酪氨酸酶活性的抑制作用

3 小結(jié)

在本文中，我們提取、分離了寡聚糖H8026和H8053并進行了表征，兩種寡糖對酪氨酸酶活性均表現(xiàn)出一定的抑制作用.與多糖相比，寡糖更容易被提取、分離和鑒定，也更容易被人體吸收和利用.猴頭菇子實體寡糖研究對猴頭菇的開發(fā)利用和功能產(chǎn)品研發(fā)有重要意義.