龐佳慧，徐福飛， 3，江海濤，李盛杰，霍光明，吳雨龍*

(1. 南京曉莊學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211171；2. 江蘇省高?！疤厥馍镔|(zhì)廢棄物資源化利用”重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211171；3. 南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046)

各式各樣的酒因其獨(dú)特的口味而在世界各地廣受歡迎.隨著酒消費(fèi)量的大大增加，肝臟疾病也隨之增加.近年來，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的發(fā)病率一直在逐年上升.長(zhǎng)期或過量飲酒已經(jīng)成為導(dǎo)致肝病的最主要因素之一[1].ALD主要包括酒精性脂肪肝、肝炎、肝纖維化等，如不加以控制將最終發(fā)展成為肝癌[2].目前，臨床上仍然沒有有效治療ALD的藥物.ALD可能的發(fā)病機(jī)制主要包括與酒精代謝有關(guān)的氧化應(yīng)激損傷、蛋氨酸代謝異常、炎癥介質(zhì)損傷、營(yíng)養(yǎng)失衡等[3].現(xiàn)已證明體內(nèi)酒精代謝過程中的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)肝臟線粒體功能障礙、脂肪變性、炎癥和纖維化[4-7].因此，調(diào)節(jié)肝臟炎癥，調(diào)控ALD肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，減少肝臟炎癥和免疫損傷反應(yīng)，可為ALD的防治提供新的靶點(diǎn).

菊苣，菊科菊苣屬，系維吾爾族習(xí)用藥材，具有清肝利膽，健胃消食，利尿消腫等功效.菊苣富含黃酮類、多酚類、多糖、菊苣酸等多種功能活性成分[8].Mohafrash等[9]發(fā)現(xiàn)菊苣和洋薊葉的草藥糖漿可通過增加體重及抗氧化酶、減少脂質(zhì)過氧化作用來改善溴氰菊酯對(duì)斷奶雄性大鼠的肝損傷.Wu等[10]研究表明菊苣多糖通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路來減輕高脂肪飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病.Keshk等[11]證明在膳食中添加菊苣可以緩解氧化應(yīng)激并通過AMPK/SIRT1/FXR信號(hào)通路中斷炎癥通路來有效預(yù)防硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝損傷、纖維化和肝硬化.然而，有關(guān)菊苣總黃酮(Chicory total flavonoids, CTF)的肝保護(hù)特性尚未在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探索，因此，本研究探究了CTF對(duì)急性酒精性肝病小鼠模型的作用，為研制開發(fā)菊苣保肝食品或天然藥物提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊苣總黃酮(CTF)由南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院生物功能分子研究室提供.

雄性ICR小白鼠，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001，體質(zhì)量18～22 g，南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供；總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)試劑盒(北京北華康泰臨床試劑有限公司)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒、蛋白定量測(cè)試盒、微量還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；Trizol Reagent(賽默飛世爾科技有限公司)；PrimeScriptTMII第一鏈cDNA合成試劑盒和SYBR Premix Ex Taq TM II(日本TaKaRa公司)；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

BioTek 多功能酶標(biāo)儀、ELx50 洗板機(jī)(美國(guó)BioTek 儀器有限公司)；H600L 尼康顯微鏡(日本尼康公司)；ND-1000 微量紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Nanodrop公司)；Mx3000P 熒光定量PCR儀(美國(guó)Stratagene公司)；Mikro-22R 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Andreas Hettich GmbH8 CO.KG).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CTF的制備

取100.0 g菊苣粉末于燒杯中，加入3700 mL的70%乙醇溶液，按照菊苣粉末量加入2.2%的混合酶(纖維素酶和果膠酶)，攪拌均勻，封上保鮮膜，酶解66 min后，將燒杯放入95 ℃水中10 min滅酶，接著用超聲波處理(超聲功率59 W，超聲時(shí)間24 min)提取液，抽濾，得澄清濾液，濃縮后經(jīng)聚酰胺樹脂70%乙醇洗脫純化，洗脫液濃縮，冷凍干燥得CTF[12].

1.3.2 急性酒精肝損傷動(dòng)物模型的建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、酒精模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(西利馬林)、CTF低劑量組和高劑量組，每組10只.空白對(duì)照組和酒精模型組灌胃純凈水，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃西利馬林(10 mg/kg bw)，CTF低高劑量組分別灌胃50、100 mg/kg bw菊苣總黃酮，連續(xù)15 d.期間每天觀察小鼠生活狀態(tài)，每3 d稱重小鼠一次，并根據(jù)小鼠體重調(diào)整灌胃劑量.第15 d，除空白對(duì)照組外，其余各組在分別灌胃給藥6 h后，均灌胃56度紅星二鍋頭白酒(12 mL/kg bw)，建立小鼠急性酒精肝損傷模型.

1.3.3 指標(biāo)檢測(cè)

各組小鼠在末次灌胃白酒禁食18 h后，用乙醚麻醉，眼球摘除法采血，3000 r/min離心10 min，分離血漿，經(jīng)試劑盒測(cè)定血漿指標(biāo)(TC、TG、ALT和AST).小鼠解剖后迅速切除肝臟并稱重，部分肝臟用福爾馬林固定以進(jìn)行組織學(xué)研究；部分肝臟經(jīng)試劑盒用于生化分析(MDA、GSH、GSH-PX和SOD)；其余肝臟在液氮中快速冷凍，在-70 ℃冰箱保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析.

1.3.4 肝臟中基因表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

取60 mg肝臟組織，用Trizol 試劑根據(jù)銷售商提供的操作指南提取總RNA.用ND-1000 微量紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 的純度和濃度，置于-70 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?用PrimeScriptTMII第一鏈cDNA合成試劑盒按操作說明合成cDNA第一鏈.以SYBR Premix Ex Taq TM II和2 μL稀釋的cDNA為模板，參照操作指南進(jìn)行反應(yīng).用Primers 6.0軟件設(shè)計(jì)目的基因引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1.

表1 目的基因引物序列

PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，一共進(jìn)行40個(gè)循環(huán).每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次.以β-Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法[13]來計(jì)算目的基因轉(zhuǎn)錄的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因.

1.3.5 肝臟病理切片制作

取小鼠右葉相同位置肝臟，用4 ℃生理鹽水沖盡殘血，濾紙拭干，10% 中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化.

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析法及t檢驗(yàn)法分析各組之間的差異，P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，采用Graphpad prism 6作圖分析結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 CTF對(duì)小鼠生長(zhǎng)情況及體重的影響

實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠精神狀態(tài)較好，活潑好動(dòng)，被毛平順有光澤，體重不斷增長(zhǎng)，各組小鼠體重不存在明顯差異，結(jié)果如圖1所示.在灌胃56度紅星二鍋頭白酒后，除空白對(duì)照組外，其余各組小鼠出現(xiàn)行走不穩(wěn)，四肢癱軟，呼吸急促，重者嗜睡醉倒等情況，此狀態(tài)一直持續(xù)1 h左右.18 h后，酒精模型組小鼠仍然精神萎靡不振，反應(yīng)遲鈍，嗜睡，而陽(yáng)性對(duì)照組和CTF劑量組小鼠恢復(fù)較快，活動(dòng)量增多，食欲和整體精神狀態(tài)恢復(fù)較好.結(jié)果表明，預(yù)先灌胃CTF不影響小鼠體重變化，且可緩解酒精帶來的對(duì)小鼠的影響.

圖1 CTF對(duì)小鼠體重的影響

2.2 指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

小鼠的肝臟指數(shù)可部分反映肝損傷的程度.由圖2可知，空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及CTF高劑量組與酒精模型組相比肝臟指數(shù)有顯著性差異(P<0.05).結(jié)果表明，CTF能夠緩解酒精對(duì)肝臟的損傷，具有一定的保肝作用.

圖2 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響＊與模型組相比，差異顯著(P<0.05)；下同.

2.2.2 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠血漿中ALT 、AST、TC和TG的影響

ALT 和AST是評(píng)價(jià)動(dòng)物肝功能和健康狀況的常用指標(biāo)，可以反映動(dòng)物的肝損害和健康狀況.由圖3A和B可知，空白對(duì)照組與酒精模型組相比，血漿ALT和AST活性差異顯著(P<0.05)，表明ALD小鼠模型建模成功.而灌胃CTF和西利馬林組小鼠血漿中ALT和AST活性有不同程度的降低，且CTF高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組與酒精模型組相比差異顯著(P<0.05).圖3C和D顯示了空白對(duì)照組與酒精模型組相比，血漿TC和TG的含量差異顯著(P<0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組和CTF組含量有不同程度下降，且對(duì)于TC含量，CTF高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組與酒精模型組相比差異顯著(P<0.05)；TG含量，CTF各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組與酒精模型組相比差異均顯著(P<0.05).提示CTF具有較好的保護(hù)肝臟受損、降低血漿轉(zhuǎn)氨酶和脂質(zhì)在肝臟中沉積的能力.

圖3 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠血漿中ALT 、AST、TC和TG的影響

2.2.3 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、GSH、GSH-PX和SOD的影響

肝損傷總是與異常的氧化應(yīng)激相關(guān)[14].因此，通過檢測(cè)MDA、GSH、GSH-PX和SOD四種肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)，可以檢驗(yàn)CTF是否能改善酒精所致?lián)p傷引起的肝臟氧化應(yīng)激.由圖4可知，過量飲酒會(huì)導(dǎo)致肝臟中MDA含量顯著上升，而GSH-PX和SOD活性以及GSH含量明顯下降，表明ALD小鼠肝臟氧化應(yīng)激水平明顯升高.與酒精模型組相比，經(jīng)西利馬林和CTF作用后，各組小鼠抗氧化能力有不同程度的提高，MDA含量顯著降低(P<0.05)，GSH-PX和SOD活性顯著上升(P<0.05).此外，CTF高劑量組GSH含量顯著上升(P<0.05).提示CTF具有較好的改善肝組織氧化應(yīng)激的能力.

圖4 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、GSH、GSH-PX和SOD的影響

2.3 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟中HO-1、Nrf-2、CYP2e1、TNF-α、TLR-4和FAS基因mRNA表達(dá)的影響

為了探討CTF抗酒精性肝病活性的分子機(jī)制，分析了肝臟中與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因(HO-1、Nrf-2和CYP2e1)、脂質(zhì)過氧化基因(FAS)和免疫調(diào)節(jié)基因(TNF-α和TLR-4)的表達(dá)水平，結(jié)果見圖5.與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和CTF組HO-1和Nrf-2基因的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而CYP2e1、TNF-α、TLR-4和FAS基因的表達(dá)則顯著降低(P<0.05).提示CTF具有緩減由酒精引起的肝組織氧化應(yīng)激、降低脂質(zhì)在肝臟中的積累以及提高機(jī)體免疫力的功效.

圖5 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟中HO-1、Nrf-2、CYP2e1、TNF-α、TLR-4和FAS基因mRNA表達(dá)的影響

2.4 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化影響

病理觀察可以直接驗(yàn)證CTF是否對(duì)酒精所致的急性肝損傷具有緩減作用.各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果如圖6所示，空白對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核圓而清晰，胞漿豐富，無明顯組織學(xué)病變(圖6A).不同的是，在酒精模型組中，暴露于酒精中的小鼠出現(xiàn)肝小葉破壞、肝索紊亂、肝細(xì)胞腫脹、肝細(xì)胞球囊化和核固縮(圖6B).然而，經(jīng)CTF處理的實(shí)驗(yàn)組，肝損傷明顯降低，且呈現(xiàn)劑量依賴狀態(tài)(圖6D-E)，特別是CTF高劑量組(圖6E)，肝細(xì)胞改善情況與陽(yáng)性對(duì)照組相似(圖6C).提示CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷有較好的緩減作用.

A.空白對(duì)照組；B. 酒精模型組；C.陽(yáng)性對(duì)照組；D. CTF低劑量組；E. CTF高劑量組圖6 CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化影響(HE， ×400)

3 討論

近些年來，對(duì)天然活性產(chǎn)物防治酒精性肝病的研究進(jìn)一步深入.大多數(shù)報(bào)道主要集中在天然多糖對(duì)酒精性肝病的防治，如鐵皮石斛多糖、平菇菌絲體多糖、云芝菌絲體多糖等[15-17].此外，也有關(guān)于二酮類和三萜類藥物對(duì)肝臟的保護(hù)作用的報(bào)道[18，19].本研究探討了CTF對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠的影響.同時(shí)發(fā)現(xiàn)CTF組的小鼠生長(zhǎng)情況和體重與空白對(duì)照組比較無明顯差異，即灌胃CTF對(duì)小鼠的生長(zhǎng)和體重?zé)o影響.

動(dòng)物肝臟指數(shù)可部分反映肝損傷的程度.本研究中，與空白對(duì)照組相比，酒精模型組小鼠肝臟指數(shù)顯著上升；而與酒精模型組相比，CTF各劑量組的肝臟指數(shù)出現(xiàn)不同程度降低，且CTF高劑量組與酒精模型組差異顯著，接近空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組水平，表明CTF能夠抑制肝細(xì)胞腫脹，緩解酒精對(duì)肝臟的損傷.

血清生化指標(biāo)ALT和AST是衡量肝功能是否正常的重要指標(biāo)，當(dāng)肝臟受到酒精的影響，肝組織受損，肝細(xì)胞膜通透性增加，血液中ALT和AST水平會(huì)明顯升高[20].本研究顯示，與空白對(duì)照組相比，酒精模型組血漿 ALT和 AST的水平均顯著的升高，而CTF各劑量組不同程度降低了酒精所致急性肝損傷小鼠血清中ALT 和 AST 水平，表明CTF可以緩解酒精對(duì)肝臟的損害.人體內(nèi)的TC和TG主要在肝臟中合成，若肝臟受損，則血液中游離脂肪酸水平上升，導(dǎo)致血液中TG水平升高，引起高TG血癥，致使肝臟合成TC能力增強(qiáng)，引起血液中TC濃度升高.因此血清中TC和TG含量的高低間接反映了肝臟受損的程度[21].本研究顯示，與酒精模型組相比，CTF各劑量組可以緩減酒精所致的小鼠急性肝損傷，降低血清中TC和TG含量.

飲酒引起的氧化應(yīng)激是各種肝病常見的病理生理學(xué)特征[22].過度的飲酒可以降低機(jī)體中SOD、GSH、GSH-PX等抗氧化酶的水平，增加脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物MDA，誘導(dǎo)肝組織損傷.本研究發(fā)現(xiàn)，酒精模型組小鼠肝臟SOD、GSH和GSH-PX活性明顯低于空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，而MDA含量明顯升高；CTF各劑量組可以不同程度提高肝受損小鼠肝臟中SOD、GSH和GSH-PX活性，降低MDA的含量，表明預(yù)先灌胃CTF能夠提高機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的能力.

在肝細(xì)胞中，細(xì)胞色素氧化酶P4502E1(CYP2e1)是參與酒精代謝的主要酶之一，具有較強(qiáng)的NADPH氧化酶活性，它可以使酒精氧化產(chǎn)生活性氧基團(tuán)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡[23]，而Nrf-2可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激并減少炎癥反應(yīng)，當(dāng)其處于氧化應(yīng)激環(huán)境中時(shí)，CYP2e1被解離.HO-1是Nrf-2已知的靶基因，當(dāng)Nrf-2被激活時(shí)，HO-1表達(dá)增加，從而保護(hù)機(jī)體免受損傷[24].研究表明，酒精攝入可上調(diào)FAS基因的轉(zhuǎn)錄，該基因與脂肪酸合成密切相關(guān)，并影響脂質(zhì)代謝[25].炎癥也是引起酒精性肝病的一個(gè)重要因素.有報(bào)道稱，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中TLR-4的激活可以促進(jìn)TNF-α的釋放，增加促炎細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)[26].本研究結(jié)果表明，CTF可以減輕酒精對(duì)肝臟氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)基因表達(dá)的負(fù)面影響.

病理學(xué)切片觀察能夠直觀反映肝臟病理變化情況.本研究中，酒精模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、水樣變性、點(diǎn)狀壞死等病理改變.而預(yù)先灌胃CTF的小鼠肝組織的病理?yè)p傷和炎癥反應(yīng)能明顯減輕，且病理改善作用呈劑量相關(guān)性，CTF劑量越大，改善越明顯.

綜上所述，菊苣總黃酮能夠明顯緩解酒精所致小鼠急性肝損傷，在預(yù)防急性酒精性肝損傷方面很有開發(fā)前景.