王福紅 李銀塔 劉希鳳

1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東濰坊 261061 2.威海海洋職業(yè)學(xué)院 山東榮成 264300

副溶血性弧菌又稱嗜鹽弧菌，為革蘭氏陰性桿菌，呈絲狀、弧狀、桿狀等多種形狀，無(wú)芽孢。副溶血性弧菌屬于一種海洋細(xì)菌，主要存在于近海岸的海水、海底沉積物，以及魚(yú)、蝦、貝殼、蟹以及海藻等海產(chǎn)品中。在生產(chǎn)過(guò)程中，海產(chǎn)品由于殺菌不徹底、烹調(diào)加熱不足等因素容易造成交叉污染，人們食用含有副溶血性弧菌的食物，從而導(dǎo)致食物中毒。

近年來(lái)，利用蝦蟹殼為主要原料制備的海鮮調(diào)味料正越來(lái)越受到關(guān)注，蝦蟹殼是水產(chǎn)工業(yè)加工的固體廢棄物，將其加工成海鮮調(diào)味料，不僅減少生態(tài)環(huán)境污染，還可作為食品添加劑應(yīng)用于肉類灌腸制品中，改善制品風(fēng)味，滿足不同群體的消費(fèi)需求。然而海鮮調(diào)味料制備過(guò)程若衛(wèi)生處理不當(dāng)，會(huì)引起肉類灌腸制品中副溶血性弧菌污染[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，副溶血性弧菌引起的食物中毒在中國(guó)細(xì)菌性食物中毒中位居第三，由此菌引發(fā)的衛(wèi)生問(wèn)題已引起食品行業(yè)的高度重視[2]。

通過(guò)對(duì)基于海鮮調(diào)味料的不同肉類灌腸制品中副溶血性弧菌進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)分析[3]，以期為開(kāi)發(fā)新型海鮮肉類灌腸制品，并控制其致病菌的污染，提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

3個(gè)生產(chǎn)批次、2種不同肉類灌腸制品(蟹味親親腸和蝦味旺旺腸)共120份樣品，均來(lái)自濰坊市中百大廚房肉制品有限公司。

1.1.2 試劑

氧化酶試劑、革蘭氏染色液、ONPG試劑、V-P試劑，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；

3%Nacl溶液，由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自行配置。

1.1.3 培養(yǎng)基

3%Nacl堿性蛋白胨水、TCBS瓊脂平板、3%Nacl胰蛋白胨大豆瓊脂平板、3%Nacl三糖鐵瓊脂斜面、3%Nacl甘露醇試驗(yàn)培養(yǎng)基、3%Nacl賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、3%Nacl MR-VP培養(yǎng)基，均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；

嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基(0%、6%、8%和10%不同Nacl濃度的胰胨水)，由山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自行配置。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

無(wú)菌操作，稱取25g海鮮肉類灌腸制品，加入盛有225mL 3%Nacl堿性蛋白胨水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min。

1.2.2 增菌

1.2.2.1 定性檢測(cè)

將制備的1∶10樣品勻液于36±1℃培養(yǎng)8～18h。

1.2.2.2 定量檢測(cè)

用無(wú)菌刻度吸管吸取1∶10樣品勻液1mL，注入含有9mL 3%Nacl堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制成1∶100的樣品勻液。另取一支1mL無(wú)菌刻度吸管，按上述操作程序，制成1∶1 000的樣品勻液。在做10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別接種3管3%Nacl堿性蛋白胨水，每管接種1mL，并做好標(biāo)記。置36±1℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)8～18h。

1.2.3 分離

對(duì)所有顯示生長(zhǎng)(變渾濁)的增菌液，用接種環(huán)沾取一環(huán)增菌液，于TCBS平板上劃線分離，36±1℃培養(yǎng)18～24h。

1.2.4 純培養(yǎng)

每個(gè)有可疑菌落生長(zhǎng)的平板上挑取至少3個(gè)，分別劃線接種3%Nacl胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36±1℃培養(yǎng)18～24h。

1.2.5 初步鑒定

1.2.5.1 氧化酶試驗(yàn)

用無(wú)菌細(xì)玻璃棒挑取新鮮純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，涂布在氧化酶試劑濕潤(rùn)的濾紙上，10s內(nèi)觀察顏色變化。

1.2.5.2 涂片染色鏡檢

將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態(tài)及染色特性。

1.2.5.3 3%Nacl三糖鐵試驗(yàn)

挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，接種3%Nacl三糖鐵瓊脂斜面，接種時(shí)先斜面劃線后穿刺底層，36±1℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。

1.2.5.4 嗜鹽性試驗(yàn)

挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%的不同Nacl濃度的胰胨水，36±1℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。

1.2.6 確定鑒定

1.2.6.1 3%Nacl甘露醇試驗(yàn)

取純培養(yǎng)物接種含3%Nacl的甘露醇培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。

1.2.6.2 3%Nacl賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)

取純培養(yǎng)物接種含3%Nacl的賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。

1.2.6.3 3%Nacl V-P試驗(yàn)

取純培養(yǎng)物接種含3%Nacl的MR-VP培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)24～48h后，向培養(yǎng)基中加V-P甲液和V-P乙液各2滴，輕輕搖動(dòng)，觀察結(jié)果。

1.2.6.4 ONPG試驗(yàn)

挑取3%Nacl三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物1滿環(huán)，接種于0.25mL 3%Nacl溶液，在通風(fēng)櫥中滴加1滴甲苯，搖勻后，置37℃水浴5min，加0.25mL ONPG溶液，36±1℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)

TCBS平板上可疑菌落呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2～3mm。

2.2 鑒定結(jié)果

2.2.1 氧化酶試驗(yàn)結(jié)果

濾紙?jiān)?0s之內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色，為陽(yáng)性結(jié)果。

2.2.2 涂片染色鏡檢結(jié)果

革蘭氏陰性菌，菌體呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，未見(jiàn)有芽孢。

2.2.3 3%Nacl三糖鐵試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)基斜面顏色不變或紅色加深，底層變黃不變黑，有動(dòng)力，無(wú)氣體產(chǎn)生。

2.2.4 嗜鹽性試驗(yàn)結(jié)果

在6%Nacl和8%Nacl的胰胨水中生長(zhǎng)旺盛，無(wú)Nacl和10%Nacl的胰胨水中微弱生長(zhǎng)或不生長(zhǎng)。

2.2.5 3%Nacl甘露醇試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)基變黃，為陽(yáng)性結(jié)果。

2.2.6 3%Nacl賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)基紫色，為陽(yáng)性結(jié)果。

2.2.7 3%Nacl V-P試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)基未呈現(xiàn)粉紅，為陰性結(jié)果。

2.2.8 ONPG試驗(yàn)結(jié)果

溶液不變色，為陰性結(jié)果。

2.3 不同批次海鮮肉類灌腸制品中副溶血性弧菌定性、定量檢測(cè)結(jié)果

副溶血性弧菌在TCBS平板上的可疑菌落呈圓形、半透明、表面光滑、綠色。副溶血性弧菌的生化性狀見(jiàn)表1所示。

表1 副溶血性弧菌的生化性狀

根據(jù)檢出的可疑菌落生化性狀進(jìn)行結(jié)果報(bào)告，不同批次海鮮肉類灌腸制品中副溶血性弧菌定性、定量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2所示。

從表2可知：蟹味親親腸有2個(gè)生產(chǎn)批次檢出副溶血性弧菌各1株，蝦味旺旺腸3個(gè)生產(chǎn)批次均未檢出副溶血性弧菌，定性檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性樣品占比為1.66%；第1個(gè)生產(chǎn)批次蟹味親親腸陽(yáng)性樣品中副溶血性弧菌MPN值是3MPN/g，第2個(gè)生產(chǎn)批次蟹味親親腸陽(yáng)性樣品中副溶血性弧菌MPN值是3.6MPN/g。

表2 不同批次海鮮肉類灌腸制品中副溶血性弧菌定性、定量檢測(cè)結(jié)果

本次檢測(cè)結(jié)果與試生產(chǎn)時(shí)的相比(2022年6月試生產(chǎn)的海鮮肉類灌腸制品中，蟹味親親腸和蝦味旺旺腸共60份樣品中，檢出3株副溶血性弧菌，其檢測(cè)方法與本次檢測(cè)相同，參考GB 4789.7-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》)，陽(yáng)性樣品占比從5%下降為1.66%，陽(yáng)性樣品占比下降了3.34%。

3 討論

(1)在3個(gè)生產(chǎn)批次的120份海鮮肉類灌腸制品中共分離出3株弧菌，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、染色特性觀察、生化試驗(yàn)等證實(shí)分離出的3株疑似弧菌有2株為副溶血性弧菌菌株；同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)，其中1份蟹味親親腸陽(yáng)性樣品中副溶血性弧菌MPN值是3MPN/g，另1份陽(yáng)性樣品中副溶血性弧菌MPN值是3.6MPN/g。因本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)條件有限，未對(duì)分離到的副溶血性弧菌菌株使用生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定。

(2)副溶血性弧菌又稱嗜鹽弧菌，是一種海洋性細(xì)菌，存在于海水和海產(chǎn)品中。蟹味親親腸由于生產(chǎn)過(guò)程中殺菌不徹底、烹調(diào)加熱不足等造成交叉污染[4]，存在副溶血性弧菌菌株。本菌是致病性的菌株，可引起食物中毒。中毒癥狀以急性發(fā)病，腹痛、腹瀉、嘔吐等為主，亦有大便膿血，一般3～5d天痊愈，但重癥者亦可造成脫水、休克。中毒的發(fā)生無(wú)年齡、種族的差異[1]。

(3)本次檢測(cè)結(jié)果與前期試生產(chǎn)的海鮮肉類灌腸制品相比，陽(yáng)性樣品占比下降3.34%。這可能與正式投產(chǎn)后調(diào)整殺菌溫度、時(shí)間及加強(qiáng)衛(wèi)生管理有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)只對(duì)基于海鮮調(diào)味料的肉類灌腸制品中副溶血性弧菌進(jìn)行了檢驗(yàn)，基于海鮮調(diào)味料的肉類灌腸制品中是否存在其它致病菌，還有待進(jìn)一步研究鑒定。