關(guān)致穎， 潘建章,2， 方 群*,2,3

(1.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州 310058；2.浙江大學(xué)杭州國際科創(chuàng)中心,浙江杭州 311200；3.浙江大學(xué)激發(fā)態(tài)材料浙江省重點實驗室，浙江杭州 310007)

1 引言

細(xì)胞是生命活動的基本單位，生物體內(nèi)組成不同、功能各異的多種細(xì)胞中時刻進行著復(fù)雜的生命活動[1]。蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)功能的直接執(zhí)行者，蛋白質(zhì)組學(xué)層面的差異標(biāo)志著細(xì)胞功能的差異[2]。基因表達過程從DNA、mRNA到蛋白質(zhì)，存在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平以及翻譯后水平三個層次的調(diào)控，這使得組織中mRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性大大降低。蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾(Post-Translation Modification,PTM)等過程均不能從其基因編碼序列中預(yù)測，只能從功能蛋白的層面展開分析。因此，從蛋白質(zhì)組學(xué)層面展開深入研究具有重大意義。

質(zhì)譜(Mass Spectrometry,MS)作為一種靈敏度和分辨率極高的分析方法，可在無標(biāo)記的情況下直接測定樣品離子的質(zhì)量數(shù)與電荷數(shù)之比(質(zhì)荷比，m/z)。20世紀(jì)80年代末,基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization,MALDI)[3]和電噴霧電離(Electron Spray Ionization,ESI)[4]兩種軟電離技術(shù)的誕生推動了生物質(zhì)譜的快速發(fā)展，可以實現(xiàn)對多肽等生物大分子快速、精確的測定[5]。基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法主要有自上而下(Top-down)[6 - 8]和自下而上(Bottom-up)[9 - 13]兩種策略。自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)分析能夠?qū)?fù)雜的生物樣品提供足夠的鑒定深度和廣度，已成為主流的蛋白質(zhì)組學(xué)方法之一，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的鑒定及其PTM分析中。在以液相色譜-質(zhì)譜(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)分析系統(tǒng)為基礎(chǔ)的自下而上鳥槍法(Shotgun)蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，蛋白質(zhì)需要在進入LC-MS分析系統(tǒng)前被蛋白酶消化成分子量更小的肽段。常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)前處理操作主要包括以下步驟：首先，使用細(xì)胞裂解劑破碎細(xì)胞膜，釋放其中的蛋白質(zhì)；其次，加入還原劑，使蛋白質(zhì)中的二硫鍵斷裂并形成半胱氨酸殘基；之后加入烷基化試劑將半胱氨酸殘基烷基化使其無法再次形成二硫鍵，從而破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，將其展開為長鏈，使切割位點充分暴露。上述每個步驟的時間通常都不到1 h。第四步是加入胰蛋白酶，將蛋白質(zhì)長鏈消化成肽段，這一過程通常要求37 ℃下過夜反應(yīng)，反應(yīng)后加入甲酸調(diào)節(jié)體系酸堿度并終止反應(yīng)。樣品經(jīng)脫鹽處理后，送入LC-MS系統(tǒng)進行分離和檢測，單個樣品的分離檢測時間通常在2 h以內(nèi)。顯然，在整個蛋白質(zhì)組學(xué)分析過程中，過夜的胰蛋白酶消化是最關(guān)鍵也是最耗時的一步，耗時數(shù)小時以上的酶解反應(yīng)制約了蛋白質(zhì)組學(xué)前處理操作的通量和效率。酶解反應(yīng)的完全性和專一性對于蛋白質(zhì)及其序列的鑒定起到?jīng)Q定性的作用，酶解程度受到酶的種類和活性、反應(yīng)體系酸堿度(pH值)、溫度、時間等因素影響。探索能夠顯著加快胰酶消化速度的方法能夠顯著提高蛋白組學(xué)分析的效率，以應(yīng)對大規(guī)模、高通量的分析需求。以下，本文將從引入額外能量、縮小反應(yīng)體系體積、改變酶試劑形態(tài)三種策略來介紹近年來蛋白質(zhì)快速酶解研究工作的進展。

2 引入額外能量的快速酶解策略

蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)效率取決于酶分子的活性、蛋白質(zhì)切割位點的暴露程度、兩種分子間發(fā)生碰撞及相互作用的幾率等因素。向蛋白質(zhì)酶解體系提供額外的能量，能夠向體系提供充足的反應(yīng)溫度，提升酶分子的活性，促進蛋白質(zhì)分子中各類化學(xué)鍵的振動，幫助蛋白質(zhì)分子暴露切割位點并與活躍的酶分子相結(jié)合，從而顯著加快蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)的進程。

紅外光是波長在770 nm到1 mm之間的電磁波，紅外激光可用于許多生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)和疾病的治療，其中發(fā)射波長約為800 nm的近紅外激光應(yīng)用尤為廣泛[14 - 18]。這種近紅外激光即使在高功率和長時間照射下也可以很容易地穿透水且?guī)缀鯖]有能量損失，相較于其它激光輻射而言，對生物組織造成不可逆損傷的概率明顯降低。如果激光功率足夠高，它能夠加速熱量積累并提高生物過程中的組織溫度。除了光熱效應(yīng)外，高能近紅外輻射還可以激發(fā)組織內(nèi)有機成分化學(xué)鍵的振動，提高分子水平的反應(yīng)活性。對于蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)而言，近紅外激光的熱效應(yīng)能夠幫助胰酶維持在適宜的反應(yīng)溫度且不損傷蛋白質(zhì)和胰酶的活性，對蛋白質(zhì)分子中的N-H、C-O、C-N鍵振動的促進作用有可能幫助蛋白質(zhì)暴露更多的胰蛋白酶切割位點，從而有效提升酶解反應(yīng)的效率。

2008年，Wang等[19]首次將紅外光用于提升胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)的效率。他們將蛋白質(zhì)∶胰蛋白酶=40∶1(w/w)的混合溶液置于密封透明的離心管中，在250 W紅外燈照射下進行酶解反應(yīng)，通過熱電偶溫度計維持溶液溫度在37 ℃。結(jié)果顯示，該方法可將牛血清白蛋白(Albumin from Bovine Serum,BSA)和肌紅蛋白(Myoglobin,MYO)的消化時間縮短到5 min，通過MALDI-TOF MS鑒定序列覆蓋率分別為69%(BSA)和90%(MYO)，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法38%(BSA)和69%(MYO)的消化結(jié)果。2010年，Yao等[20]使用功率為5 W、波長為808 nm的光纖耦合二極管紅外激光照射蛋白質(zhì)和胰酶的混合溶液來加速酶解反應(yīng)的進程。如圖1a，紅外激光器照射在密封的透明離心管或不銹鋼 MALDI 靶板上，輻照度約為25.5 W/cm2。結(jié)果顯示，使用紅外激光照射能夠?qū)㈦x心管內(nèi)的肌紅蛋白酶解反應(yīng)縮短到幾十秒，且所得序列覆蓋度略高于過夜酶解12 h的樣品。對于MALDI靶板上的樣品，紅外激光照射可將酶解過程縮短至5 s，所得蛋白質(zhì)序列覆蓋度和離心管內(nèi)溶液樣品基本相同。實驗顯示紅外激光對十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解效率也有提升作用，但不如離心管內(nèi)溶液反應(yīng)的效果，可能是由于808 nm的紅外激光更容易穿透含水量高的樣品。文章使用該方法進行大鼠腦提取物的前處理，酶解時間為1 min，用LC-MS/MS鑒定，得到728條肽段和134個蛋白質(zhì)。為探究激光熱效應(yīng)對反應(yīng)的實際作用，他們將離心管置于冰水浴中并照射激光，以控制溶液在反應(yīng)過程中的溫度。結(jié)果顯示，冰水浴中樣品所得的BSA序列覆蓋度(26%)低于不加冰水浴的結(jié)果(42%)，說明紅外激光的熱效應(yīng)是促進蛋白質(zhì)酶解的一個重要因素，但與此同時也存在其他作用機理。在此基礎(chǔ)上，2011年Zhang等[21]將紅外激光與固定化酶反應(yīng)器(Immobilization Enzyme Reactor,IMER)聯(lián)用來提高蛋白質(zhì)酶解的效率。激光輔助IMER蛋白酶解系統(tǒng)如圖1b所示，IMER通過胰蛋白酶丙烯酰化和原位水相聚合兩步反應(yīng)整體固定在毛細(xì)管中，長度約為1 cm。實驗使用發(fā)射波長為808 nm、功率為5 W的光纖耦合二極管紅外激光器，光纖透鏡和IMER之間的距離固定為10 cm。通過注射泵將蛋白質(zhì)溶液注入固定有IMER的毛細(xì)管，蛋白質(zhì)消化過程可在60 s內(nèi)完成，使用MALDI-TOF MS鑒定得到BSA的序列覆蓋率為33%，細(xì)胞色素c(Cytochrome c,Cyt-c)的序列覆蓋率為73%，β-酪蛋白(Beta-Casein,β-casein)的序列覆蓋率為22%，與常規(guī)溶液中反應(yīng)14 h所得蛋白質(zhì)序列覆蓋度基本相同，顯著高于僅使用IMER的效果。蛋白質(zhì)N-末端的靶向分析有助于闡明成熟蛋白質(zhì)N-末端的起始位點和翻譯后修飾。Li等[22]將紅外激光輔助蛋白質(zhì)酶解的方法用于蛋白質(zhì)的N-末端分析。實驗結(jié)果顯示，兩種蛋白酶解方法所得的4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的肽段數(shù)量和序列覆蓋率基本相同，而紅外激光輔助酶解的方法可以增強蛋白質(zhì)中N-末端肽的釋放。與傳統(tǒng)的過夜消化相比，激光輔助消化的方法從小鼠肝臟中識別出的N-末端肽數(shù)量提高了28.3%，消化時間成本從過夜縮短到40 s。

微波是波長在0.01～1 m、頻率在0.3～30 GHz之間的電磁輻射。作為常見的熱源之一[23]，微波加熱的原理是促進物質(zhì)內(nèi)部極性分子的高頻往復(fù)運動，它無需熱傳導(dǎo)過程即可使物質(zhì)內(nèi)外均勻地受熱升溫，這使得其加熱效率遠(yuǎn)高于常規(guī)熱源。將微波加熱運用于化學(xué)反應(yīng)當(dāng)中，可以有效地提升反應(yīng)的產(chǎn)率和效率[24 - 32]。對于蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)而言，選擇適當(dāng)?shù)奈⒉üβ始凹訜釙r長，可以顯著加速酶解反應(yīng)的進程。

2002年，Pramanik等[33]使用最大功率為300 W、具有溫控功能的單束微波發(fā)生器產(chǎn)生微波，實現(xiàn)了微波輔助的溶液內(nèi)蛋白質(zhì)快速酶解。實驗使用胰蛋白酶∶蛋白質(zhì)=1∶25(w/w)的比例處理細(xì)胞色素c、泛素、溶菌酶、肌紅蛋白和干擾素-2b，反應(yīng)溫度設(shè)定在37 ℃，微波照射10 min，使用 MALDI-TOF MS或ESI MS技術(shù)進行分析。與傳統(tǒng)方法所需的數(shù)小時相比，微波輔助可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成蛋白質(zhì)的消化。為了研究微波照射加速蛋白質(zhì)酶解的機制，實驗在不同的微波溫度設(shè)置下進行干擾素-2b的酶解，并在不同時間點采集反應(yīng)樣品，結(jié)果顯示，溶液溫度快速升高到60 ℃以上將大大增強酶解反應(yīng)效率。為進一步驗證快速升溫是否對酶解反應(yīng)的加速有重要作用，在沒有微波照射的情況下將反應(yīng)混合物放入預(yù)熱至60 ℃的加熱塊中，所測得的酶解情況與微波實驗獲得的結(jié)果相似，說明反應(yīng)溫度的快速升高是微波加速酶解反應(yīng)的重要原因之一。Lin等[34]研究了在不同種類溶劑系統(tǒng)中進行微波輻射加速蛋白質(zhì)酶解的反應(yīng)情況。有機溶劑具有促進蛋白質(zhì)變性的作用，在傳統(tǒng)酶解實驗中，加入甲醇、乙腈等有機溶劑雖然能促進蛋白底物的變性，但同時會使胰蛋白酶失去活性。使用600 W微波爐產(chǎn)生微波輻射，將肌紅蛋白、細(xì)胞色素c、溶菌酶和泛素作為底物，胰酶∶蛋白質(zhì)比例為1∶25(w/w)，反應(yīng)時間為10 min。結(jié)果顯示，在微波作用下，乙腈、甲醇和氯仿中的胰酶酶解反應(yīng)消化效率和所得蛋白質(zhì)的序列覆蓋度均較常規(guī)酶解反應(yīng)有顯著提升。這些結(jié)果表明，微波輻射能夠在一定程度上提高蛋白質(zhì)酶解體系對有機溶劑的耐受性，使得酶解效率進一步提升。Sun等[35]使用850 W微波爐產(chǎn)生微波，將200 μL 1 mg/mL BSA溶液置于0.6 mL離心管中，加熱時在離心管旁放置1 000 mL水吸收多余能量，微波加熱時間為1 min。實驗比較了不同的反應(yīng)條件的結(jié)果，說明對于快速酶解反應(yīng)，蛋白質(zhì)還原步驟較為重要而烷基化步驟可以省略。對于凝膠內(nèi)蛋白質(zhì)，將樣品放于1.5 mL離心管微波加熱5 min可得到比常規(guī)實驗更好的消化效率。在使用BSA對實驗條件進行優(yōu)化后，他們將該系統(tǒng)應(yīng)用于人尿液提取蛋白和酵母裂解產(chǎn)物這兩種復(fù)雜樣品中，能夠分別在6 min 或25 min內(nèi)完成溶液中(人尿液提取蛋白)或凝膠中(酵母裂解物)的蛋白質(zhì)混合樣品前處理，獲得了與常規(guī)過夜酶解等效或更佳的反應(yīng)效果，顯示了微波輔助酶解技術(shù)在復(fù)雜生化樣品分析中的應(yīng)用潛力。Zhao等[36]開發(fā)了一種集成化的蛋白質(zhì)樣品制備方法imFASP，將原位過濾器輔助的樣品預(yù)處理方法和微波輔助的胰酶酶解方法結(jié)合，可在1 h內(nèi)高效地處理微克至納克級的復(fù)雜蛋白樣品。如圖1c所示，首先，將溶解在8 mol/L尿素中的蛋白質(zhì)上樣至截留分子量為10 kDa的過濾器上，然后進行原位蛋白質(zhì)預(yù)濃縮、變性、還原、烷基化和微波輔助胰蛋白酶消化。與傳統(tǒng)溶液中樣品前處理的鑒定結(jié)果(1 952個蛋白質(zhì)和18 645個肽段)相比，imFASP方法從45 mg大腸桿菌蛋白質(zhì)提取物中鑒定到的結(jié)果(2 215個蛋白質(zhì)，23 012個肽段)更高，且樣品前處理通量提高了14倍。當(dāng)將大腸桿菌細(xì)胞裂解物的量降至50～500 ng的水平時，imFASP方法相對于傳統(tǒng)溶液過夜酶解的方法，對蛋白質(zhì)和肽的鑒定數(shù)分別提高了30%和44%，說明imFASP方法在微量蛋白質(zhì)組樣品的分析方面有獨特的優(yōu)勢，有望成為高效、高通量的微量蛋白質(zhì)組分析方法。

圖1 引入額外能量的蛋白質(zhì)快速酶解系統(tǒng)[20,21,36]Fig.1 Rapid enzymatic proteolysis systems based on introducing additional energy[20,21,36]

超聲波作為一種波長很短的機械波，也被用于加速蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)。2005年，Lopez-Ferrer等[37]首次使用高強度超聲探頭進行蛋白質(zhì)酶解。2007年，Rial-Otero等[38]報道了一種使用基于超聲反應(yīng)器的加速蛋白質(zhì)酶解動力學(xué)的新方法。他們將兩種不同的超聲發(fā)生裝置——超聲反應(yīng)器和超聲探頭分別用于蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)中，建立了超聲波輔助蛋白質(zhì)酶消化(Ultrasonic-assisted Protein Enzymatic Digestion,USAPED)分析方法，通過MALDI-TOF MS鑒定蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜。作者優(yōu)化了胰蛋白酶/蛋白質(zhì)比例、超聲時間、超聲波振幅、蛋白質(zhì)底物濃度等一系列反應(yīng)條件。結(jié)果顯示，兩種超聲發(fā)生裝置最佳的胰蛋白酶/蛋白質(zhì)比例和能夠檢出的最低蛋白質(zhì)濃度基本相同，所用胰蛋白酶的量高于常規(guī)酶解反應(yīng)體系的用量。在同樣使用50%超聲振幅的情況下，超聲探頭消化蛋白質(zhì)所需的時間(60 s)比超聲反應(yīng)器(120 s)更短，但使用超聲反應(yīng)器獲得的MALDI-TOF MS譜圖更清晰，標(biāo)準(zhǔn)偏差更小。此外，超聲反應(yīng)器有六個樣品通道，樣品前處理的通量更高，更加適用于小體積樣品，而超聲探頭一次只能處理一個樣品，易造成微量樣品的攜出損失。

3 縮小反應(yīng)體系體積的快速酶解策略

微反應(yīng)體系具有不同于常規(guī)毫升至微升級體系的反應(yīng)特征和獨特優(yōu)勢，在微米級反應(yīng)體系(如微液滴或微通道)中微尺度效應(yīng)凸顯，物質(zhì)傳質(zhì)傳熱加快，反應(yīng)的效率會得到顯著的提升。微米級的微液滴可以通過電噴霧、微流體、紙噴霧等多種方法產(chǎn)生[39 - 45]。微液滴體系被廣泛運用于加速各種類型的單相或雙相有機反應(yīng)，這些反應(yīng)往往動力學(xué)過程緩慢，在常規(guī)大體積反應(yīng)中需要加入特定的催化劑[46 - 49]。微液滴反應(yīng)過程結(jié)合質(zhì)譜檢測也被用于研究快速反應(yīng)動力學(xué)，推進化學(xué)合成、納米材料合成等方面的研究[50 - 53]。微液滴內(nèi)反應(yīng)速率顯著提升的確切原因目前尚未完全明確，但通常推測是與微尺度體系內(nèi)的各種因素如液滴大小、表面電荷、溶劑組成、液滴蒸發(fā)等[54,55]有關(guān)。微液滴除了在有機合成方面發(fā)揮重要作用外，水性微滴能夠提供與生命體系兼容的環(huán)境，故其在促進生化反應(yīng)方面也有很大潛力。

2020年，Zhong等[56]使用電噴霧質(zhì)譜噴霧過程中產(chǎn)生的微液滴來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速酶解。如圖2a所示，在室溫下將10 μmol/L肌紅蛋白和5 μg/mL胰蛋白酶的5 mmol/L NH4HCO3溶液通過自主搭建的± 3 kV高壓噴霧裝置噴射形成直徑9 μm、體積3 pL左右的液滴，液滴噴霧口和質(zhì)譜口之間的距離約為2 cm，毛細(xì)管周圍使用干燥N2作為鞘氣，質(zhì)譜入口毛細(xì)管溫度始終保持在275 ℃，電壓保持在0 V，實驗在不到1 ms的時間內(nèi)獲得100%的肌紅蛋白序列覆蓋率。將相同的溶液置于37 ℃反應(yīng)14 h，使用商品化電噴霧電離源產(chǎn)生直徑約為60 μm的大液滴進行噴霧和質(zhì)譜分析，得到的肌紅蛋白序列覆蓋度為60%，說明液滴尺寸對反應(yīng)效率有顯著的影響。他們還研究了微滴質(zhì)譜法中蛋白質(zhì)酶解適宜的pH范圍。當(dāng)pH小于4時，微滴質(zhì)譜法促進酶解的程度會受到抑制，測得蛋白質(zhì)序列覆蓋度約為40%；當(dāng)pH高至11時，微滴質(zhì)譜法仍可完全消化合成肽。該方法被用于治療性抗體曲妥珠單抗(約148 kDa)的序列分析，得到輕鏈100%、重鏈85%的序列覆蓋率，證明了其在藥物開發(fā)中的應(yīng)用潛力。

4改變酶試劑形態(tài)的快速酶解策略

生物酶催化效率高、專一性強,通常在常溫、常壓等生物適宜的條件下發(fā)揮催化作用[57]。然而，當(dāng)離開細(xì)胞及其特定環(huán)境,酶分子難以長時間保持活性或進行重復(fù)利用。固定化酶是指通過某種方法將酶固定于固體載體上或限制于一定區(qū)域內(nèi)，在保證其催化能力的基礎(chǔ)上提高酶試劑的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率[58,59]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、能源、環(huán)境等領(lǐng)域。固定化酶提供了一個局部高濃的酶環(huán)境，能夠有效加速蛋白質(zhì)酶解反應(yīng)動力學(xué)。常見的固定化酶載體有玻璃、膜、聚合物、磁珠、凝膠、多孔硅膠、多孔整體式材料等，固定方法也多種多樣，如吸附法、包埋法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法等[60 - 62]。

Kosuke等[63]通過使用毛細(xì)管內(nèi)固定化酶的方法來實現(xiàn)少量細(xì)胞的在線高效蛋白質(zhì)組樣品前處理(In-Line Sample Preparation For Efficient Cellular Proteomics,ISPEC)。ISPEC分析系統(tǒng)如圖2b，將2 μL HeLa細(xì)胞懸液滴到玻璃板上，將相同體積的裂解液滴在另一塊玻璃板的同一位置上，依次吸取空氣500 nL、裂解液2 μL、空氣500 nL、HeLa細(xì)胞懸液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液，空氣500 nL。使用帶有電荷耦合器件(Charge Coupled Device,CCD)相機的顯微鏡對細(xì)胞進行計數(shù)，確定收集在采樣毛細(xì)管中的細(xì)胞數(shù)量。之后，使用PicoClear聯(lián)結(jié)器將采樣毛細(xì)管連接到填充有固定化胰蛋白酶的反應(yīng)毛細(xì)管和色譜柱，用注射泵以5 μL/min的流速推動水溶液進入毛細(xì)管，使得毛細(xì)管中收集的細(xì)胞與裂解液混合而裂解，再將流速更改為1 μL/min，推動溶液與固定化胰蛋白酶微球接觸使蛋白質(zhì)酶解，最終將酶解所得的肽段捕獲在液相色譜柱的入口端，整個酶解和進樣過程約1 h。將所得的裝有樣品的毛細(xì)管色譜分析柱連接到液相泵上，使用含有5%乙腈和0.1%甲酸的水溶液作為流動相進行30 min的液相分離。為避免樣品間的交叉污染，每次分析均需更換固定化胰蛋白酶柱和色譜分析柱。使用經(jīng)過優(yōu)化的ISPEC方法和nano-LC-MS分析方法，他們分別從100個、10個和單個HeLa細(xì)胞中鑒定到了1351、351和60種蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)針對少量哺乳動物細(xì)胞樣品展開方法設(shè)計和優(yōu)化，降低了樣品制備過程中的損失，提高了固定化胰蛋白酶消化的穩(wěn)定性和效率。

圖2 縮小反應(yīng)體系體積和使用固定化酶的蛋白質(zhì)快速酶解系統(tǒng)[56,63 - 65]Fig.2 Rapid enzymatic proteolysis systems based on reducing reaction system volume and using immobilized enzyme reactors[56,63 - 65]

Shen等[64]比較了采用固定化胰蛋白酶(Immobilized Trypsin,IM)和游離胰蛋白酶(Free Trypsin,FT)兩種方法的酶解結(jié)果，同時系統(tǒng)地分析了IM相對于FT的作用區(qū)別以及IM固定基質(zhì)的引入對蛋白質(zhì)裂解機理或選擇性的影響。如圖2c所示，分別使用了胺基官能化(IM-N)或羧基官能化(IM-C)的固定化酶磁珠以及FT來消化大腸桿菌蛋白質(zhì)組樣品。與FT相比，IM在其消化蛋白的過程中沒有特殊的選擇性，對于位置不同、功能不同、豐度不同的蛋白都可以較好地進行鑒定。IM-N方法(用時15 min)和FT方法(用時12 h)都可以從小鼠腦蛋白質(zhì)組中鑒定出9000種蛋白質(zhì)。該工作建立了使用固定化酶進行消化的高通量自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程：蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理(包括蛋白質(zhì)變性，還原和烷基化)用時40 min，IM-N消化用時15 min，肽段脫鹽和凍干用時1 h，毛細(xì)管區(qū)帶電泳質(zhì)譜(Capillary Zone Electrophoresis,CZE-MS/MS)分析時間為30 min，數(shù)據(jù)分析用時30 min，整個分析流程總時長約3 h，從小鼠腦蛋白質(zhì)組中識別出1000多種蛋白質(zhì)和6000多種肽，具有良好的定性和定量重現(xiàn)性。

Atacan等[65]使用熱溶劑法制備了Fe3O4磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles,MNPs)，并開發(fā)了一種新方法將胰蛋白酶共價固定在單寧修飾的MNP上，表征了所得納米粒子的形貌、結(jié)構(gòu)和磁性。Fe3O4納米粒子具有優(yōu)良的藥物相容性和超順磁性，非常適用于固定化酶的研究，但裸露的Fe3O4納米粒子通常穩(wěn)定性和分散性較差，因此需要開發(fā)表面修飾方法來獲得穩(wěn)定且更具生物相容性的Fe3O4納米粒子。單寧酸是一種天然的多酚分子，廣泛存在于多種植物中，葡萄糖作為中心核通過酯鍵與十個沒食子酸基團相連，其大量羥基結(jié)構(gòu)易與生物聚合物相互作用，故可用作固定化酶結(jié)構(gòu)的結(jié)合涂層。實驗利用多酚的pH依賴性氧化反應(yīng)，通過升高pH在單寧修飾納米顆粒上生成醌基，利用席夫堿反應(yīng)或Michael加成反應(yīng)將胰蛋白酶共價固定在單寧修飾的Fe3O4MNPs上(圖2d)。室溫下，F(xiàn)e3O4MNPs的飽和磁化值為60.18 emu/g，而單寧修飾的Fe3O4MNPs和固定有胰酶的單寧修飾Fe3O4MNPs的飽和磁化值分別為57.82 emu/g和55.16 emu/g，這表明單寧涂層和胰蛋白酶固定良好。他們使用BSA作為樣品來表征固定化酶效果，分別在1 min、5 min和15 min內(nèi)進行了BSA的酶解，并且在微波輔助下將酶解過程縮短到15 s，使用MALDI-TOF MS鑒定到39個特征肽段，在1 min的消化時間下獲得了84%的蛋白質(zhì)序列覆蓋率。

2020年，Wei等[66]基于玻璃芯片研制了一種集成了固定化酶反應(yīng)器(IMER)的一體化蛋白質(zhì)預(yù)處理微流控系統(tǒng)。玻璃芯片由三個入口通道和兩組蛇形通道組成，可使蛋白質(zhì)溶液、還原劑和烷基化試劑同時注入芯片通道，保證反應(yīng)液在線高效混合和充分反應(yīng)。IMER通過硫醇-烯點擊化學(xué)反應(yīng)制備，經(jīng)檢測2個月內(nèi)IMER酶活性降低13.8%，體現(xiàn)了IMER系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)利用的能力。在此基礎(chǔ)上，該研究組[67]于2021年發(fā)展了通過微流控芯片集成反相色譜、IMER和分子印跡整體柱的樣品處理系統(tǒng)，實現(xiàn)在線蛋白質(zhì)分離、變性、消化和多肽富集。該微流控系統(tǒng)完整處理一組樣品的時間(約9.6 h)短于傳統(tǒng)方法(約13.3 h)。2022年，該研究組[68]報道了基于微流控系統(tǒng)的分子印跡聚合物(MIP)和IMER相結(jié)合的富集策略，提高了質(zhì)譜鑒定N-肉豆蔻酰化肽的水平，從MCF-7細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)混合物中鑒定出1 296個蛋白質(zhì)和5 670個肽段，包括71個肉豆蔻?；鞍缀?8個肉豆蔻?；?。

5 總結(jié)與展望

隨著人們在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的認(rèn)識和研究不斷深入，少量細(xì)胞乃至單個細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)組學(xué)研究引起了廣泛關(guān)注[69 - 71]?；邙B槍法的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)前處理流程較為復(fù)雜且耗時，如何顯著提升蛋白質(zhì)酶解速率是一大挑戰(zhàn)。紅外光輔助酶解策略通常用于離心管內(nèi)數(shù)十微升體積的樣品，蛋白質(zhì)底物濃度較高，可將蛋白質(zhì)酶解時間縮短至30 s～5 min。紅外激光輔助的酶解系統(tǒng)裝置簡單，操作方便，易于集成，但它要求反應(yīng)器為敞開式或者基于紅外透過特性，方便光線照射到樣品溶液。紅外激光器的性質(zhì)決定了它更適合于流動式的反應(yīng)體系，對于大規(guī)模批式樣品，紅外激光器產(chǎn)生的激光難以同時均勻作用于每個反應(yīng)單元，因此需要組裝運動元件控制其在不同反應(yīng)單元上方移動和定位，或采用多個紅外激光器構(gòu)建反應(yīng)器陣列。已報道的微波輔助酶解策略同樣用于離心管內(nèi)數(shù)十微升體積的樣品，可將蛋白質(zhì)酶解時間縮短至30 s～10 min。使用微波爐產(chǎn)生微波的方法非常適用于批量樣品同時反應(yīng)，操作簡單高效，但是微波爐本身難以集成到自動化微量樣品前處理模塊中。另外，高功率的紅外激光和微波在操作中都具有一定的危險性。超聲輔助酶解策略適用于數(shù)十微升樣品，反應(yīng)時間通常在1～20 min，操作簡單，但超聲波引起的振動對液體造成的擾動較大，不適用于微液滴原位反應(yīng)體系。另一種基于微尺度效應(yīng)的快速酶解策略利用電噴霧產(chǎn)生的皮升級微液滴將酶解反應(yīng)加速到毫秒級，產(chǎn)物直接噴入質(zhì)譜，裝置簡單，反應(yīng)效率極高，但是僅適用于底物較為純凈單一的反應(yīng)，目前尚難以推廣到樣品組成復(fù)雜、前處理操作繁瑣、需要經(jīng)液相色譜分離的蛋白質(zhì)組分析體系中?；诠潭ɑ阜磻?yīng)器的快速酶解策略是微體系反應(yīng)中最常用的快速酶解策略，樣品體積通常在百納升至百微升，酶解反應(yīng)時間在2 s～2 h，它的作用效果穩(wěn)定，能一定程度上減少酶自切反應(yīng)的發(fā)生，可靈活放置于各類微反應(yīng)器中，尤其適合流動反應(yīng)體系。然而，固定化酶制備步驟相對繁瑣，對酶試劑的消耗較大，易向體系引入吸附殘留、交叉污染等問題。

促進蛋白質(zhì)快速酶解的目的是加快蛋白組學(xué)樣品前處理的反應(yīng)進程，以實現(xiàn)更大規(guī)模、更高通量的蛋白組學(xué)分析研究。在未來的研究中，如何對現(xiàn)有的蛋白質(zhì)快速酶解策略進行選擇和組合，實現(xiàn)集成化、自動化的蛋白組學(xué)快速樣品前處理，是蛋白組學(xué)分析系統(tǒng)實用化進程中應(yīng)該重點關(guān)注的問題。此外，隨著研究者們對細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識不斷加深，以及相關(guān)分析技術(shù)和儀器的不斷發(fā)展，針對少量細(xì)胞乃至單個細(xì)胞的蛋白組學(xué)研究已成為當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究的熱點領(lǐng)域。目前文獻報道的快速酶解策略多以常規(guī)量的某一種或數(shù)種蛋白質(zhì)作為底物，以蛋白質(zhì)序列覆蓋度作為表征酶解效果的主要依據(jù)，這種方法的局限性是無法定量地反映體系中的所有蛋白質(zhì)是否都被充分地酶解。當(dāng)樣品中的蛋白質(zhì)含量極低時，可能存在蛋白質(zhì)酶解不充分、響應(yīng)低于檢出限以至于影響蛋白質(zhì)鑒定的問題。因此，對于少量和單細(xì)胞蛋白組學(xué)分析水平的微量樣品而言，在常規(guī)蛋白組學(xué)分析中所采用的加速酶解方案是否依然適用，仍需要進一步的試驗和驗證。