楊曉穎， 姜 勛， 羅幸玲， 葉小華， 王 梅*

(廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510310)

苯酚和對(duì)苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚是重要的化工原料，也是環(huán)境水體中常見(jiàn)的有機(jī)污染物。因其具有高毒性和難降解性，已被多個(gè)國(guó)家和地區(qū)認(rèn)定為環(huán)境污染物并限制排放[1,2]。酚類(lèi)化合物具有致癌、致畸和致突變的潛在毒性，會(huì)對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成威脅。因此，有必要建立準(zhǔn)確、靈敏、高效的分離分析方法，對(duì)環(huán)境水中酚類(lèi)化合物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。濁點(diǎn)萃取(CPE)應(yīng)用于酚類(lèi)化合物的預(yù)富集已有不少報(bào)道，但大多存在以下不足：?jiǎn)渭兪褂帽砻婊钚詣?duì)具有一定親水性的苯酚類(lèi)化合物(如苯酚、苯二酚)直接進(jìn)行萃取，導(dǎo)致總體萃取效果不佳；步驟較繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。

快速協(xié)同濁點(diǎn)萃取(RS-CPE)是在經(jīng)典CPE基礎(chǔ)上，通過(guò)加入?yún)f(xié)同誘導(dǎo)劑，室溫下即可產(chǎn)生濁點(diǎn)現(xiàn)象，快速完成對(duì)目標(biāo)物分離萃取和富集過(guò)程的新型樣品預(yù)處理方法，具有快捷、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。RS-CPE由溫曉東等[3]于2011年提出，與分光光度法聯(lián)用測(cè)定銅。此后該課題組[4 - 9]、Rahnama[10,11]、楊靜[12]等學(xué)者將此技術(shù)拓展應(yīng)用于鉛、鉍、鎳、硒、鈷和鉻等其他金屬離子的測(cè)定。目前所報(bào)道方法通常以Triton X-114、Triton X-100為萃取劑，以辛醇為協(xié)同誘導(dǎo)劑，通過(guò)添加絡(luò)合劑，如二乙基二硫代氨基甲酸鈉、雙硫腙、1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚、2,2′-呋喃二肟等，將金屬離子轉(zhuǎn)化為可被表面活性劑相萃取的疏水性物質(zhì)。在酚類(lèi)污染物測(cè)定方面，我們課題組選用PEG-6000作萃取劑，克服Triton X系列所帶來(lái)的干擾，通過(guò)加入辛醇，將其濁點(diǎn)(100 ℃)降至室溫，成功建立了與熒光分光光度法聯(lián)用檢測(cè)苯酚的方法。

選擇合適的協(xié)同誘導(dǎo)劑是在常溫下實(shí)現(xiàn)RS-CPE的關(guān)鍵，我們課題組通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，合適的協(xié)同誘導(dǎo)劑應(yīng)具有以下共通性：(1)具有適當(dāng)?shù)氖杷裕山档蜐狳c(diǎn)溫度；(2)粘度低，能直接稀釋富集相；(3)在特定條件下能與水溶液快速分離并快速完成萃取的過(guò)程。乙腈與水互溶，粘度小，是一種同時(shí)具有親水性和疏水性的兩親性極性非質(zhì)子有機(jī)溶劑，可作為高效液相色譜的流動(dòng)相；也常應(yīng)用于各種樣品前處理中。此外，與傳統(tǒng)液-液萃取法中常用的有機(jī)溶劑相比，乙腈危害低，因此成為研究者使用有機(jī)溶劑的首選[13 - 15]。乙腈與水混溶時(shí)形成的是微觀不均一的溶液，這為乙腈/水溶液產(chǎn)生相分離，實(shí)現(xiàn)對(duì)疏水性和親水性的萃取提供了理論依據(jù)[16]。因此，若乙腈能應(yīng)用于RS-CPE中，將會(huì)改善其萃取效果。目前尚未見(jiàn)乙腈RS-CPE應(yīng)用于萃取苯酚類(lèi)化合物的報(bào)道。本研究建立了以乙腈作協(xié)同誘導(dǎo)劑，測(cè)定水中4種苯酚類(lèi)化合物的RS-CPE-HPLC新方法。對(duì)協(xié)同誘導(dǎo)劑、表面活性劑、絡(luò)合劑等影響因素進(jìn)行優(yōu)化，并將該方法應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)廢水中4種苯酚類(lèi)化合物的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

LC-20A型高效液相色譜儀、Shim-pack VP-ODS型C18色譜柱、RF-10AXL型熒光檢測(cè)器(日本，島津公司)；F-2500型熒光分光光度計(jì)(日本，日立高新技術(shù)公司)；Synergy超純水系統(tǒng)(美國(guó)，Merck Millipore公司)。

仲醇聚氧乙烯醚15-S-7(Tergitol 15-S-7)、磷酸三丁酯(TBP)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈均購(gòu)自上海安譜公司；鄰苯二酚、間苯二酚、對(duì)苯二酚、苯酚(純度為99%，均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)；乙酸(天津，科密歐公司)。以上試劑純度均在分析純以上，實(shí)驗(yàn)用水均為Synergy超純水機(jī)系統(tǒng)制備。實(shí)驗(yàn)所用器皿均用10%硝酸+10%乙醇溶液浸泡12 h后,超聲清洗20 min，然后依次用自來(lái)水、超純水清洗，晾干待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜條件流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：乙腈；流動(dòng)相C：1%乙酸水溶液；流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10.0 μL。采用梯度洗脫程序：0～6 min，A∶B∶C=20∶20∶60；6～7 min：A上升至65%；7～12 min：A∶B∶C=65∶20∶15；12～13 min：A下降至20%；13～20 min：A∶B∶C=20∶20∶60。檢測(cè)波長(zhǎng)程序?yàn)椋?～3.8 min：激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為295/325 nm，3.8～20 min：激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)為275/305 nm。

1.2.2 苯酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制1.00 mg/mL的4種苯酚類(lèi)化合物的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取25.00 mg的4種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品于4個(gè)25.00 mL容量瓶中，用純甲醇定容至刻度并密封保存于4 ℃冰箱中。5.00 mg/L的4種苯酚類(lèi)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：分別取50.0 μL(1.00 mg/mL)的上述4種苯酚化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10.00 mL容量瓶中，用純甲醇定容至刻度并密封保存于4 ℃冰箱中。

1.2.3 快速協(xié)同濁點(diǎn)萃取過(guò)程分別移取50.0 μL 5.00 mg/L的4種苯酚類(lèi)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液或者取7.0 mL水樣至10.0 mL離心管中，依次加入Na2SO40.28 g，20% Tergitol 15-S-7溶液1.0 mL，乙腈1.0 mL，磷酸三丁酯0.5 mL，用HCl將溶液pH調(diào)節(jié)至4.0，并用超純水定容至10.0 mL。隨后旋緊瓶蓋，振蕩搖勻，并以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min加速分相，離心后直接取上層富集相過(guò)濾，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.2.4 樣品制備自來(lái)水和工業(yè)廢水樣品用0.45 μm水系濾膜(津騰，混合纖維素膜，Φ=50 mm)過(guò)濾后，貯存于4 ℃冰箱中，盡快測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 絡(luò)合劑的選擇與優(yōu)化

苯酚類(lèi)化合物作為親水性較強(qiáng)的極性物質(zhì)，在RS-CPE過(guò)程中需要使用適當(dāng)?shù)慕j(luò)合劑與之形成疏水性強(qiáng)的絡(luò)合物，才能更好地被萃取進(jìn)入富集相中。磷酸三丁酯作為一種中性磷氧類(lèi)萃取劑，常被用作多種金屬、酚類(lèi)化合物的絡(luò)合劑[17,18]。因此，本研究選擇磷酸三丁酯作絡(luò)合劑并考察其用量對(duì)目標(biāo)物萃取的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖可見(jiàn)，使用0.5 mL磷酸三丁酯時(shí)，所得峰面積最大，繼續(xù)增加其用量則峰面積基本保持不變，說(shuō)明0.5 mL即可使目標(biāo)物完全被絡(luò)合。因此，選擇0.5 mL磷酸三丁酯作后續(xù)研究的最優(yōu)條件。

2.2 協(xié)同誘導(dǎo)劑的選擇與用量

為選擇合適的協(xié)同誘導(dǎo)劑，本實(shí)驗(yàn)對(duì)甲醇、乙醇、乙腈進(jìn)行了評(píng)估，以簡(jiǎn)化CPE過(guò)程。將甲醇、乙醇、乙腈分別與0.5 mol/L Na2SO4結(jié)合，發(fā)現(xiàn)甲醇不能將濁點(diǎn)溫度降至室溫，也未觀察到渾濁；加入3.0 mL乙醇則形成了大量富含表面活性劑的相；而隨著乙腈體積的增加，體系的濁點(diǎn)溫度在逐漸降低。此外，與乙醇相比，乙腈與HPLC的相容性更好，且產(chǎn)生的富表面活性劑相體積較小。分析原因可能是乙腈的加入改變了溶液的極性、溶解度、密度等相關(guān)參數(shù)，并且在電解質(zhì)鹽析的作用下，乙腈的弱親水基氰基與水的作用力被打斷，從而為表面活性劑提供一個(gè)疏水作用力，間接影響膠束的臨界膠束濃度、膠束大小以及析相行為[19]。乙腈自身具有一定的疏水性和萃取目標(biāo)物的能力，故其還可以輔助萃取提高萃取率；并且由于乙腈的粘度小，少量的乙腈溶解于表面活性劑富集相中可起到降低富集相粘度的效果，萃取后的富集相可直接過(guò)濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。故選用乙腈為RS-CPE的協(xié)同誘導(dǎo)劑。

實(shí)驗(yàn)對(duì)乙腈用量進(jìn)行探討(圖2)，當(dāng)乙腈用量為0～1.0 mL時(shí)，4種苯酚類(lèi)化合物的峰面積逐漸增大，并保持相對(duì)平穩(wěn)狀態(tài)，1.5～2.5 mL開(kāi)始下降?？赡苁巧倭康囊译鎱f(xié)同輔助萃取效果較差，所得富集相較粘稠，需進(jìn)一步稀釋?zhuān)蝗欢罅康囊译鏁?huì)增大富集相體積，稀釋了目標(biāo)物，使萃取率下降。綜合考慮環(huán)保、經(jīng)濟(jì)與實(shí)驗(yàn)效果，最后選定1.0 mL的乙腈進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 磷酸三丁酯(TBP)對(duì)4種苯酚類(lèi)化合物萃取率的影響Fig.1 Effect of tributyl phosphate (TBP) on the extraction of four phenolic compounds

圖2 乙腈對(duì)4種苯酚類(lèi)化合物萃取率的影響Fig.2 Effect of acetonitrile on the extraction of four phenolic compounds

2.3 表面活性劑用量

RS-CPE中表面活性劑的用量是影響萃取效率和富集倍數(shù)的重要因素之一。Tergitol 15-S-7因不含苯環(huán)結(jié)構(gòu)，不干擾4種目標(biāo)物的HPLC檢測(cè)，同時(shí)其支鏈少，對(duì)目標(biāo)物的增溶能力強(qiáng)，所得的富集相體積較小，可獲得較高富集倍數(shù)，本研究選用Tergitol 15-S-7作萃取劑。

實(shí)驗(yàn)分別考察了0～1.25 mL 20%Tergitol 15-S-7對(duì)目標(biāo)物萃取效果的影響。如圖3所示，4種目標(biāo)物的峰面積隨萃取劑用量的增加而逐漸上升，當(dāng)用量達(dá)到1.0 mL后，峰面積保持平穩(wěn)。因此，選擇20%Tergitol 15-S-7用量為1.0 mL。

2.4 溶液pH的優(yōu)化

溶液pH值在RS-CPE過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，目標(biāo)分析物含有羥基，其存在狀態(tài)會(huì)隨溶液pH的改變而改變。此外，pH值過(guò)高或過(guò)低也會(huì)導(dǎo)致苯酚類(lèi)化合物與磷酸三丁酯形成的絡(luò)合物不穩(wěn)定或發(fā)生其他反應(yīng)，影響萃取效果。在確保其他條件一致的情況下，用HCl、NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH，考察了溶液pH在2.0～9.0范圍內(nèi)，4種苯酚類(lèi)化合物萃取率的變化情況(圖4)。結(jié)果表明，4種目標(biāo)物的萃取率在pH=2.0～8.0范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，在pH=9.0時(shí)苯酚和間苯二酚有輕微降低的趨勢(shì)，鄰苯二酚和對(duì)苯二酚下降明顯，故選溶液pH=4.0作最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行后續(xù)研究。

2.5 電解質(zhì)種類(lèi)與濃度的選擇

濁點(diǎn)萃取時(shí)，添加適量電解質(zhì)會(huì)迫使膠束中的氫鍵斷裂并使疏水基團(tuán)脫離水相，可降低表面活性劑的濁點(diǎn)溫度、減小凝聚相體積、改變主體水相的密度，從而加速分相。前期實(shí)驗(yàn)探索了4種常用NaCl、Na2CO3、Na2SO4、Na3PO4對(duì)濁點(diǎn)溫度和目標(biāo)物萃取效果的影響。結(jié)果顯示Na2SO4效果最佳，故選擇Na2SO4為電解質(zhì)增強(qiáng)離子強(qiáng)度。同時(shí)考察了Na2SO4濃度范圍在0～0.7 mol/L時(shí)對(duì)目標(biāo)分析物萃取效果的影響，結(jié)果顯示，萃取率隨Na2SO4濃度的增加而增加，至0.2 mol/L時(shí)，萃取率達(dá)到最大，之后基本保持不變。因此實(shí)驗(yàn)選擇無(wú)水Na2SO4最佳濃度為0.2 mol/L。

圖3 20% Tergitol 15-S-7對(duì)4種苯酚類(lèi)化合物萃取率的影響Fig.3 Effect of 20% Tergitol 15-S-7 on the extraction of four phenolic compounds

圖4 溶液pH對(duì)4種苯酚類(lèi)化合物萃取率的影響Fig.4 Effect of solution pH on the extraction of four phenolic compounds

2.6 離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間的優(yōu)化

離心可使分散在溶液中的萃取劑聚集，促進(jìn)萃取劑與水相的分離。但離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度升高，可能會(huì)使表面活性劑熔化而發(fā)生損失[20]，導(dǎo)致萃取率下降；若離心時(shí)間過(guò)短則會(huì)導(dǎo)致相分離不完全。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間對(duì)4種目標(biāo)物萃取率的影響均不大，且離心轉(zhuǎn)速為3 500 r/min，離心時(shí)間為10 min時(shí)，即可獲得澄清的富集相和水相，故選該條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.7 方法評(píng)價(jià)

以4種苯酚類(lèi)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，峰面積的倒數(shù)作權(quán)重，做線性回歸方程，結(jié)果如表1所示。對(duì)苯二酚、間苯二酚、鄰苯二酚和苯酚在0.1～191 μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好線性，線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于等于0.9996。分別以3倍和10倍的信噪比計(jì)算方法的檢出限和定量限，4種目標(biāo)物的檢出限范圍為0.02～0.04 μg/L，定量下限為0.07～0.13 μg/L。同時(shí)，為了考察該方法的精密度，在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)4種苯酚類(lèi)化合物的濃度為25.0 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液平行萃取測(cè)定6次，所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.58%，說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性高，精密度好。此外，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，4種苯酚類(lèi)化合物的富集倍數(shù)為8.68～9.96，萃取率高達(dá)86.8%以上。

表1 4種苯酚類(lèi)化合物乙腈RS-CPE方法的分析特征、萃取率和富集倍數(shù)

2.8 方法的實(shí)際應(yīng)用

為了驗(yàn)證該方法的實(shí)際應(yīng)用性，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)采集的7份工業(yè)廢水和1份實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水水樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。在樣本工業(yè)廢水4、5、6中檢測(cè)到苯酚濃度為1.06～5.04 μg/L，在工業(yè)廢水7中檢測(cè)到鄰苯二酚和苯酚濃度分別為1.52 μg/L和5.37 μg/L，4種目標(biāo)物的樣品加標(biāo)回收率在93.9%～107%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.53%，表明該方法適用于實(shí)際環(huán)境水樣中苯酚類(lèi)化合物的分析檢測(cè)，4種苯酚類(lèi)化合物的空白水樣和加標(biāo)水樣的色譜圖見(jiàn)圖5。

表2 4種苯酚類(lèi)化合物水樣檢測(cè)結(jié)果和加標(biāo)回收率±RSD(%，n=3)

(續(xù)表3)

圖5 經(jīng)RS-CPE(乙腈)后的空白水樣和加標(biāo)水樣色譜圖Fig.5 Chromatograms of blank and spiked sample after acetonitrile RS-CPEA:the addition of 25 μg/L mixed standard solutions,B:the addition of 5 μg/L mixed standard solutions,C:the blank water sample.

2.9 與其他方法的比較

將本方法與其他方法進(jìn)行對(duì)比(表3)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用協(xié)同誘導(dǎo)劑，省去了水浴和稀釋步驟，更為簡(jiǎn)捷，1 min內(nèi)即可同時(shí)完成對(duì)目標(biāo)物的萃取，8 min可完成整個(gè)前處理過(guò)程，相較于On-line FI-ME、UA-CPE，特別是SPE有突出優(yōu)勢(shì)。而且所用的試劑均已商品化，可購(gòu)買(mǎi)且價(jià)格低廉，不需要花費(fèi)長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行前期制備，重復(fù)性好。其次，本實(shí)驗(yàn)盡管獲得的富集倍數(shù)不高，但其檢測(cè)限較低，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選用環(huán)保的表面活性劑作萃取劑，減少了有毒有害有機(jī)溶劑的使用，更符合“綠色化學(xué)”的理念。

表3 不同方法測(cè)定4種苯酚類(lèi)化合物的比較

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)表明，乙腈作為一種新型的協(xié)同誘導(dǎo)劑，不僅可以輔助降低濁點(diǎn)、稀釋富集相，還可以協(xié)同萃取，提高萃取率。本文成功將乙腈RS-CPE方法應(yīng)用于分析測(cè)定環(huán)境水樣中4種苯酚類(lèi)化合物(鄰/間/對(duì)苯二酚和苯酚)，取得了較為滿意的結(jié)果。該方法簡(jiǎn)單、靈敏、成本低、省時(shí)、重現(xiàn)性良好；同時(shí)也符合綠色環(huán)保的要求，因此在分析測(cè)定痕量污染物中有較好的應(yīng)用前景。