劉 洋， 劉 競(jìng)， 孫 寧， 魏 娜， 董 川， 宋勝梅*

(山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所，化學(xué)化工學(xué)院，山西太原 030006)

銅是除Fe2+和Zn2+以外人體所必需的第三種微量元素，也是機(jī)體還原酶的重要組成元素，參與人體內(nèi)各項(xiàng)氧化還原反應(yīng)，對(duì)人體有重要的生理功能[1]。適量的Cu2+可以促進(jìn)血紅蛋白的生成，促進(jìn)機(jī)體造血功能，維持骨骼、血管、皮膚的正常生理功能，促進(jìn)新陳代謝和提高細(xì)胞免疫力等。Cu2+缺乏會(huì)導(dǎo)致貧血等癥狀，過(guò)量的Cu2+則會(huì)導(dǎo)致肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂[2]。我國(guó)《地下水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T14848-2017)規(guī)定Ⅰ類(lèi)水Cu2+含量不得超過(guò)0.01 mg/L，Ⅱ～Ⅴ類(lèi)不得超過(guò)1.0 mg/L，飲用水中Cu2+的含量不得高于20 μmol/L。因此，對(duì)Cu2+的快速準(zhǔn)確檢測(cè)是非常必要的。Cu2+常用的檢測(cè)方法有半導(dǎo)體量子點(diǎn)[3]、原子吸收光譜法[4]、質(zhì)譜法[5]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[6]、電化學(xué)分析法[7]、分光光度法[8]、液相色譜法[9]等。以碳點(diǎn)(Carbon Dots，CDs)作為熒光探針的熒光分析方法因CDs良好的熒光穩(wěn)定性和熒光分析方法的簡(jiǎn)便性而受到關(guān)注，對(duì)環(huán)境水樣中Cu2+的檢測(cè)有重要意義。

目前，已經(jīng)有不少CDs熒光探針成功應(yīng)用到環(huán)境水樣中Cu2+的測(cè)定，如三色比率熒光探針試紙對(duì)尿液中Cu2+的可視化檢測(cè)[10]、N-CDs基于熒光猝滅法檢測(cè)水樣銅離子[11]、以高溫裂解法合成CDs并成功地用于Cu2+檢測(cè)[12]。本文以對(duì)苯二異氰酸酯為碳源，N,N-二甲基甲酰胺為溶劑，采用溶劑熱法，在200 ℃的高溫下炭化8 h，制備了一種對(duì)Cu2+有響應(yīng)的氮摻雜橙紅色熒光碳量子點(diǎn)(N-CDs)。并對(duì)其結(jié)構(gòu)和性能進(jìn)行了詳細(xì)的表征，該N-CDs的最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為483 nm和586 nm，具有良好的水溶性和對(duì)Cu2+的選擇性。Cu2+可以特異性地猝滅N-CDs的熒光，所建立分析方法的檢出限為68 nmol/L，可用于實(shí)際水樣中微量Cu2+的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器與試劑

JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社JEOL)；AXIS ULTRA DLD X射線光電子能譜儀(日本Kratos公司)；TensorⅡ傅立葉變換紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)；vario ELCUBE元素分析儀(德國(guó)Elementar公司)；FP-8300 FDP熒光分光光度計(jì)(日本分光株式會(huì)社JASCO)；Lambda365紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀(美國(guó)PerKinElmer公司)；ZF-6紫外觀察燈(上海嘉鵬科技有限公司)；1820c超純水機(jī)(上海摩勒科學(xué)儀器有限公司)。

分析純對(duì)苯二異氰酸酯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇、金屬氯鹽和氨水均購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司；阿奇霉素(AZM)、克拉霉素(CLA)、卡那霉素(Kana)、萬(wàn)古霉素(VAN)、甲砜霉素(THI)、慶大霉素(GEN)、四環(huán)素(TCY)、頭孢拉定(CH)、青霉素G(PG)、氟加喹(UB)、奧硝唑(ORN)、奧索利酸(OA)、替硝唑(TIN)、甲氧西林(MET)，以及丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、組氨酸(His)、賴(lài)氨酸(Lys、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glutamic Glu)，均購(gòu)自美國(guó)Aldrich化學(xué)試劑公司；其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)所用超純水為實(shí)驗(yàn)室自制(≥18.25 MΩ·cm)。

1.2 N-CDs制備方法

采用一步溶劑熱法制備N(xiāo)-CDs。準(zhǔn)確稱(chēng)量0.16 g對(duì)苯二異氰酸酯溶于20 mL中，加入1 mL氨水調(diào)節(jié)溶液pH為堿性，于超聲儀中超聲20 min直至固體小顆粒完全分散溶解，將該溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜內(nèi)襯中，于200 ℃高溫下碳化8 h，待溶液冷卻后，將其通過(guò)0.45 μm濾膜過(guò)濾，再將濾液轉(zhuǎn)移至500～1 000 Da的透析袋中透析8 h，最后將透析后的橙紅色液體冷凍干燥，得棕色固體粉末，即為所制備N(xiāo)-CDs。

1.3 N-CDs對(duì)于Cu2+的熒光檢測(cè)

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg N-CDs粉末溶解于10 mL超純水中，配制濃度為10 mg/mL N-CDs儲(chǔ)備液。所制備的N-CDs的最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的λex=483 nm，λem=587 nm。通過(guò)調(diào)節(jié)10 mm比色皿中N-CDs溶液的濃度，確定其最佳濃度為5 mg/mL。在該濃度下，N-CDs溶液的熒光強(qiáng)度最大。

2 結(jié)果與討論

2.1 N-CDs的結(jié)構(gòu)表征

所制備N(xiāo)-CDs由C、H、N和O組成，各個(gè)元素分別占總質(zhì)量的60.34%、6.19%、21.63%和11.84%(計(jì)算)，計(jì)算的碳點(diǎn)的經(jīng)驗(yàn)式為C20H25O3N6。

以透射電子顯微鏡(TEM)觀察N-CDs的形貌和粒徑，如圖1A所示，N-CDs呈均勻分散的類(lèi)球形顆粒，粒徑大致分布在6～11.00 nm范圍內(nèi)，平均粒徑約為8.77 nm(圖1B)。在2 nm的高分辨視野下可以清楚地看到N-CDs的晶格間距大致為0.22 nm，對(duì)應(yīng)于石墨烯結(jié)構(gòu)的(100)面。

圖1 N-CDs的(A)透射電鏡圖像(插圖顯示高分辨率透射電鏡圖像);(B)粒徑分布圖Fig.1 (A) TEM image(Inset showing the HR-TEM image) of N-CDs;(B) Size distribution histogram of N-CDs

圖2 FT-IR光譜圖對(duì)N-CDs進(jìn)行官能團(tuán)表征Fig.2 Functional groups characterization of N-CDs with FT-IR spectroscopy

以傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和X射線光電子能譜(XPS)進(jìn)一步表征N-CDs的化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)。由圖2的FT-IR圖可知，在3 405～3 210 cm-1的寬吸收峰屬于O-H/N-H的伸展振動(dòng)[13]；3 100～3 000 cm-1的寬吸收峰是由于不飽合=C-H的伸展振動(dòng)引起的；1 650 cm-1處的尖銳吸收峰歸因于C=O伸展振動(dòng)[14]；1511cm-1和1392cm-1處的吸收峰為碳點(diǎn)六元環(huán)C-C的骨架振動(dòng)；1 253～1 260 cm-1的寬吸收峰和1 134 cm-1的尖峰分別是C-O的不對(duì)稱(chēng)和對(duì)稱(chēng)伸展振動(dòng)[15]；820 cm-1和700 cm-1的峰均屬于不飽合=C-H的彎曲振動(dòng)[16]。從FT-IR譜圖中可以發(fā)現(xiàn)，N-CDs 表面含有一些氨基、羧基等親水性的官能團(tuán)，這些親水官能團(tuán)的存在，賦予N-CDs 良好的水溶性。圖3A是N-CDs的XPS總譜，總譜中285.0 eV、399.5 eV和531.9 eV處的峰分別對(duì)應(yīng)于C1s，N1s和O1s[17]，表明N-CDs由C、H、O和N四種元素組成，這與元素分析結(jié)果一致。圖3B的高分辨率C1s譜可擬合為4個(gè)峰，284.4 eV、285.1 eV、285.8 eV和288.8 eV的峰分別對(duì)應(yīng)于-C-N、C=C、C-C和C=O[18]。高分辨率N1s譜(圖3C)的峰在398.8 eV(C-N，pyridinic N)、399.4 eV(C-N，pyridinic N)、400.1(C-N，pyridone N)和400.6 eV(N-H)[19]。高分辨率O1s譜(圖3D)表現(xiàn)出4個(gè)特征峰，分別是530.9 eV(O-H)、531.6 eV(C=O)、532.2(C-O)和532.3 eV(N-O)[20]。

圖3 (A)N-CDs的XPS全譜；(B)碳譜;(C)氮譜；(D)氧譜Fig.3 (A) XPS survey scan of N-CDs;(B) C1s XPS;(C) N1s XPS;(D) O1s XPS

2.2 N-CDs的光譜性能研究

N-CDs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜(圖4A)有3個(gè)吸收峰，分別位于245、280和525 nm處。245 nm處的紫外吸收峰是由于N-CDs碳核內(nèi)C=C鍵的π→π*躍遷引起的，N-CDs在280 nm附近的吸收峰主要是由于C=O鍵的n-π*躍遷引起的[21,22]。N-CDs在500～550 nm之間的較寬吸收峰可能是由于N-CDs表面的化學(xué)官能團(tuán)產(chǎn)生的[23]。所制備N(xiāo)-CDs的最佳激發(fā)和發(fā)射峰分別位于483和587 nm處。N-CDs在365 nm紫外燈照射下呈現(xiàn)橙紅色熒光(圖4A插圖)。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)從483 nm增大到533 nm時(shí)，發(fā)射波長(zhǎng)紅移；而當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)從483 nm減小到433 nm時(shí)，發(fā)射波藍(lán)移，結(jié)果如圖4B所示。表明該N-CDs具有激發(fā)波長(zhǎng)依賴(lài)性。

圖4 (A) N-CDs的紫外可見(jiàn)吸收(a)，熒光激發(fā)(b)和發(fā)射(c)光譜。插圖：N-CDs在自然光(左)和紫外線(右)下的拍攝圖。(B) N-CDs在不同激發(fā)波長(zhǎng)(433～533nm)下的發(fā)射光譜圖。Fig.4 (A) UV-Vis absorption(a),fluorescence excitation(b) and emission(c) of the N-CDs.Inset:shooting figures of the N-CDs under natural light(lef) and ultraviolet light(right).(B) Emission spectra of the N-CDs at different excitation wavelengths(433 - 533 nm).

2.3 N-CDs對(duì)Cu2+的特異性檢測(cè)及干擾性能

圖5 N-CDs響應(yīng)圖譜：(A)金屬離子響應(yīng)；(B)陰離子響應(yīng)；(C)氨基酸響應(yīng)和(D)藥物響應(yīng)Fig.5 N-CDs response to different substances:(A) metal response;(B) anion response;(C) amino acid response and(D) drugs response

考察了N-CDs的抗干擾能力。在N-CDs溶液中加入10倍于Cu2+濃度(0.5 mmol/L)的其他離子時(shí)，N-CDs的熒光強(qiáng)度沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯改變，表明N-CDs對(duì)其它離子沒(méi)有熒光響應(yīng)；再加入0.5 mmol/L Cu2+時(shí)仍然可以猝滅N-CDs約60%的熒光強(qiáng)度，表明N-CDs具有優(yōu)異的抗干擾能力(圖6)。

圖6 N-CDs對(duì)(A)金屬離子和(B)陰離子的抗干擾性能Fig.6 Anti-interference performance to (A) metal ions and(B) anions of N-CDs

2.4 方法的分析性能

配制系列含有不同濃度(0～544 μmol/L)的Cu2+和5 mg/mL的N-CDs的溶液，充分搖勻并記錄熒光強(qiáng)度，確定分析方法的線性范圍并繪制工作曲線，結(jié)果如圖7所示。由圖7A可知，當(dāng)Cu2+濃度從0到544 μmol/L依次遞加時(shí)，N-CDs熒光強(qiáng)度逐漸減小。由圖7B可見(jiàn)，當(dāng)Cu2+濃度從20 μmol/L到250 μmol/L依次遞加時(shí)，N-CDs的F0/F值呈線性遞增，以F0/F為縱坐標(biāo)(Y),Cu2+濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性擬合，線性方程為Y= 0.0028X+0.9511(R2=0.998)(圖7C)。Cu2+的檢出限以3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差除以斜率(3σ/k)計(jì)算，結(jié)果為68 nmol/L。

圖7 (A)不同濃度(0～544 μmol/L)的Cu2+對(duì)N-CDs的熒光光譜的影響；(B)F0/F與Cu2+濃度的關(guān)系圖；(C)N-CDs 與Cu2+之間的線性關(guān)系在20～250μmol/L范圍內(nèi)Fig.7 (A)The effect of different concentrations of Cu2+(0 - 544 μmol/L) on the fluorescence spectra of N-CDs.(B) The relation ship of F0/F and Cu2+.(C) The linear relation between F0/F and Cu2+ in the range of 20 - 250 μmol/L

2.5 Cu2+檢測(cè)方法的性能比較

將所構(gòu)建的Cu2+熒光探針N-CDs與其他CDs探針進(jìn)行檢測(cè)限及熒光性能等方面的比較，結(jié)果如表1所示。所制備具有橙紅色熒光的N-CDs比文獻(xiàn)報(bào)道的CDs發(fā)射波長(zhǎng)更長(zhǎng)，長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射可以有效減少很多短波長(zhǎng)發(fā)射物質(zhì)的干擾；具有較寬的線性范圍(20～250 μmol/L)；且檢出限(68 nmol/L)遠(yuǎn)低于GB/T14848-2017所規(guī)定的飲用水中Cu2+的安全限度0.01 mg/L(即156 nmol/L)。

表1 基于CDs熒光探針檢測(cè)Cu2+的方法比較

2.6 檢測(cè)機(jī)理的研究

為了進(jìn)一步探究Cu2+對(duì)N-CDs的熒光猝滅機(jī)理，對(duì)N-CDs進(jìn)行了紫外-可見(jiàn)吸收滴定試驗(yàn)(圖8A)。在吸收光譜中，隨著Cu2+的增加，220～280 nm之間紫外吸收峰顯著升高，220～700 nm之間沒(méi)有新的吸收峰出現(xiàn)，說(shuō)明沒(méi)有新的化合物生成。對(duì)比圖8B與圖4A可見(jiàn)，Cu2+的紫外-可見(jiàn)吸收光譜從500 nm開(kāi)始吸收增強(qiáng)，與N-CDs在587 nm的發(fā)射峰有重合，所以Cu2+可以吸收N-CDs的發(fā)射，導(dǎo)致熒光降低，因此二者之間存在內(nèi)濾效應(yīng)。另由紅外和XPS的表征可知，N-CDs表面具有豐富的N元素，N上含有孤對(duì)電子，Cu2+具有空的d軌道，可能是Cu2+與N-CDs表面氨基的孤對(duì)電子之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，d→d躍遷吸收了熒光激發(fā)和發(fā)射的能量，阻礙了N-CDs的熒光發(fā)射，導(dǎo)致N-CDs的熒光強(qiáng)度減弱[28 - 33]。且隨著Cu2+濃度的升高，這種抑制作用越來(lái)越強(qiáng)，導(dǎo)致了N-CDs熒光猝滅。

圖8 (A)在不同濃度Cu2+(0～244.8 μmol/L)存在下N-CDs的紫外吸收光譜。插圖；加入244.8 μmol/L Cu2+的N-CDs溶液(左上)與N-CDs(左下)在日光和紫外燈下的拍攝圖以及200～300 nm范圍內(nèi)放大的UV-Vis吸收?qǐng)D(右)。(B)Cu2+的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.8 (A) The UV-Vis absorption spectra of N-CDs in the presence of various concentrations Cu2+from bottom to top (0～224.8 μmol/L).Inset:the figures of the N-CDs solution with 244.8 μmol/L Cr6+(upper left) and the N-CDs(lower left) in natural light and ultraviolet light and the enlarged UV-Vis absorption spectra in the range of 200 nm and 300 nm(right).(B) UV-Vis Absorption Spectra of Cu2+

2.7 實(shí)際樣品中Cu2+的檢測(cè)

通過(guò)測(cè)定實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水和令德湖水中的Cu2+驗(yàn)證方法檢測(cè)實(shí)際水樣的準(zhǔn)確性。兩種水樣均未測(cè)出Cu2+，以加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)確定分析方法的可信度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，實(shí)際水樣中Cu2+的加標(biāo)回收率為96.4%～104.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤8.08%。所合成的新型熒光探針N-CDs可以實(shí)現(xiàn)環(huán)境水樣中Cu2+的免標(biāo)記檢測(cè)。

表2 實(shí)際水樣中的Cu2+測(cè)定RSD(n=5)

3 結(jié)論

以對(duì)苯二異氰酸酯和N,N-二甲基甲酰胺為原料，通過(guò)一步溶劑熱法，在200 ℃的高溫下碳化8 h，制備了一種對(duì)Cu2+有響應(yīng)的橙紅色熒光N-CDs。N-CDs的最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為483 nm和586 nm，N-CDs具有較好的水溶性和對(duì)Cu2+的熒光選擇性，基于Cu2+與N-CDs之間的內(nèi)濾效應(yīng)建立了免標(biāo)記測(cè)定Cu2+的熒光分析方法。該分析方法在藥物、食品及環(huán)境分析領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用。