張婷婷， 黃 鈺， 丁 艷， 陳 捷， 花鎮(zhèn)東

(公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心,毒品監(jiān)測(cè)管控與禁毒關(guān)鍵技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

近年來(lái)，合成阿片類(lèi)物質(zhì)在世界范圍內(nèi)的濫用呈顯著上升趨勢(shì)[1,2]，與嗎啡、海洛因等天然和半合成阿片類(lèi)物質(zhì)相比，該類(lèi)物質(zhì)不依賴植物種植，制造更為容易，品種層出不窮，為此國(guó)際麻醉品管制局已專(zhuān)門(mén)設(shè)立OPIOIDS Project項(xiàng)目[3]，對(duì)其生產(chǎn)和分銷(xiāo)情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。芬太尼類(lèi)物質(zhì)是合成阿片類(lèi)物質(zhì)中的一個(gè)重要類(lèi)別，作為強(qiáng)效麻醉鎮(zhèn)痛劑在醫(yī)療中發(fā)揮重要作用的同時(shí)，也出現(xiàn)了嚴(yán)重的濫用情況，特別是在阿片類(lèi)物質(zhì)成癮人群比例較高的北美地區(qū)[4,5]，已成為藥物濫用致死的主要因素。為預(yù)防該類(lèi)物質(zhì)可能產(chǎn)生的社會(huì)危害，我國(guó)已于2019年5月1日起將芬太尼類(lèi)物質(zhì)整類(lèi)列入《非藥用類(lèi)麻醉藥品和精神藥品管制品種增補(bǔ)目錄》。

由于吸毒行為的隱蔽性，毒品濫用監(jiān)測(cè)一直是禁毒工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。近期逐步發(fā)展起來(lái)的基于污水流行病學(xué)原理的毒情監(jiān)測(cè)技術(shù)具有客觀、定量、實(shí)時(shí)、快速和簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，我國(guó)[6]及歐洲[7 - 9]、加拿大[10]、澳大利亞[11,12]等國(guó)家和地區(qū)已廣泛采用該方法監(jiān)測(cè)可卡因、大麻、海洛因、冰毒、搖頭丸和氯胺酮等常見(jiàn)毒品的濫用情況。然而，芬太尼及其類(lèi)似物作為新近流行的毒品，污水中相關(guān)原體及代謝物的檢測(cè)方法尚未建立，限制污水檢測(cè)技術(shù)在其濫用情況監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。為此，本研究以芬太尼類(lèi)物質(zhì)中最為常見(jiàn)的芬太尼(Fentanyl)和乙酰芬太尼(Acetyl fentanyl)為對(duì)象，建立了污水中2種物質(zhì)原型及3種主要代謝物去苯乙基芬太尼(Norfentanyl)、去苯乙基乙酰芬太尼(Acetyl norfentanyl)和4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)的離線和在線固相萃取檢測(cè)方法(化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，并將其用于全國(guó)大型城市生活污水樣品的檢測(cè)，為了解芬太尼類(lèi)物質(zhì)的實(shí)際濫用情況提供了新的思路和手段。

圖1 5種目標(biāo)化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Chemical structures of five target compounds

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(ACQUITY UPLC，Waters，美國(guó)；Triple QuadTM6500，SCIEX，美國(guó))；配備在線固相萃取AOE模塊的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(LCMS-8050，SHIMADZU，日本)；全自動(dòng)固相萃取儀(SPE-432，北京普立泰科儀器有限公司)；真空離心濃縮儀(CV200，北京吉艾姆科技有限公司)；超純水裝置(Milli-Q advantage A10，Merck，德國(guó))；固相萃取柱Oasis?PRiME HLB柱和Oasis?PRiME MCX柱(60 mg，3CC，Waters，美國(guó))。

甲醇和乙腈(均為HPLC級(jí))購(gòu)自Fisher Scientific(美國(guó))；氨水(HPLC級(jí)，含量大于25%)購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；芬太尼，去苯乙基芬太尼，乙酰芬太尼，去苯乙基乙酰芬太尼，4-苯胺基-N-苯乙基哌啶(4-ANPP)，芬太尼-D5，去苯乙基芬太尼-D5，乙酰芬太尼-13C6，去苯乙基乙酰芬太尼-13C6，4-苯胺基-N-苯乙基哌啶-D5(4-ANPP-D5)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液(溶劑均為甲醇，濃度100 μg/mL)均購(gòu)自Cerilliant(美國(guó))。

1332份污水樣品來(lái)自國(guó)家禁毒辦污水監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，于2020年第2季度采集自全國(guó)125個(gè)城市的生活污水處理廠，混合空白污水基質(zhì)使用10份來(lái)自不同城市的空白污水樣品混合制成。

1.2 離線固相萃取分析方法

1.2.1 樣品處理污水樣品用濃HCl調(diào)節(jié)pH至小于2，加入混合內(nèi)標(biāo)溶液使各同位素內(nèi)標(biāo)濃度為50 ng·L-1，玻璃纖維濾膜過(guò)濾后移取50 mL濾液，以1 mL·min-1流速加載至PRiME MCX固相萃取柱中，甲醇4 mL淋洗后真空抽固相萃取柱至干燥，再用含5%氨水/甲醇溶液(體積比5∶95)4 mL洗脫，洗脫液使用真空濃縮儀于45 ℃濃縮至干，加入0.1%甲酸水溶液250 μL復(fù)溶，0.2 μm濾膜過(guò)濾后供儀器檢測(cè)。使用PRiME HLB固相萃取柱的實(shí)驗(yàn)條件與上述基本相同，不同之處在于污水樣品pH值調(diào)節(jié)至7，上樣后使用純水淋洗，洗脫液為甲醇。

1.2.2 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀分析條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.4 mL·min-1；洗脫梯度程序：0.0～6.0 min(5%～25%B)，6.0～9.0 min(25%～50%B)，9.0～9.2 min(50%B～100%B),9.2～11.0 min(100%B)，11.0～11.2 min(100%～5%B),11.2～14.0 min(5%B)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。質(zhì)譜分析：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細(xì)管電壓：3 kV；離子源溫度：550 ℃；霧化氣壓強(qiáng)：50 psi；輔助加熱氣壓強(qiáng)：50 psi；氣簾氣壓強(qiáng)：35 psi；碰撞氣為氮?dú)?；采集模式為多反?yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

1.3 在線固相萃取分析方法

1.3.1 樣品處理污水樣品加入混合內(nèi)標(biāo)溶液使各同位素內(nèi)標(biāo)濃度為50 ng·L-1，使用甲酸或氨水調(diào)節(jié)pH至7，混勻后用0.2 μm濾膜過(guò)濾后供儀器檢測(cè)。

1.3.2 在線固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀分析條件固相萃取柱：Oasis HLB Direct Connect HP(2.1 mm×30 mm,20 μm)；色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；進(jìn)樣量：3 mL；在線固相萃取采取雙柱模式；固相萃取流速：3 mL·min-1；固相萃取程序：0.0～3.0 min超純水，3.0～5.0 min 50%甲醇水溶液，5.0～7.0 min甲醇/乙腈/異丙醇混合溶液(體積比1∶1∶1)，7.0～16.0 min超純水，其中2.8 min進(jìn)行柱切換，將已加載樣品的固相萃取柱切換至液相色譜流路，同時(shí)將前序完成樣品洗脫的固相萃取柱切換至固相萃取流路進(jìn)行清洗和平衡；液相色譜流動(dòng)相：A為0.1% 甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.4 mL·min-1；洗脫梯度程序：0.0～2.8 min(5%B)，2.8～8.4 min(5%～30%B)，8.4～13.9 min(30%～100%B)，13.9～15.9 min(100%B)，15.9～16.0 min(100%～5%B)；柱溫：40 ℃。質(zhì)譜分析：電噴霧離子源正離子模式(ESI+)；毛細(xì)管電壓：0.5 kV；加熱模塊溫度：400 ℃；DL溫度：250 ℃；霧化氣流速：3 L·min-1；加熱氣流速：10 L·min-1；干燥氣流速：10 L·min-1；碰撞氣為氬氣；采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

1.4 回收率和基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

離線固相萃取法：使用0.1%甲酸水溶液配制濃度分別為0.2、2、20 ng·mL-1的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定6次得到的峰面積平均值為A；混合空白基質(zhì)進(jìn)行固相萃取，洗脫液吹干后分別加入含0.2、2、20 ng·mL-1目標(biāo)物的0.1%甲酸水溶液250 μL復(fù)溶后進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定6次得到的峰面積平均值為B；使用混合空白基質(zhì)配制濃度分別為1、10、100 ng·L-1的基質(zhì)添加樣品后進(jìn)行固相萃取，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定6次得到的峰面積平均值為C；提取回收率=C/B，基質(zhì)效應(yīng)=B/A，整體回收率=C/A。在線固相萃取法：使用純水配制濃度分別為1、10、100 ng·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定6次得到的峰面積平均值為A；使用混合空白基質(zhì)配制濃度分別為1、10、100 ng·L-1的基質(zhì)添加樣品，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定6次得到的峰面積平均值為C；整體回收率=C/A。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

目標(biāo)物使用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(LC-TQ-MS)在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下進(jìn)行檢測(cè)。由于離線和在線固相萃取法使用不同的質(zhì)譜儀，因此分別優(yōu)化了5種目標(biāo)物及相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的母離子、子離子和碰撞能量，結(jié)果見(jiàn)表1。芬太尼、乙酰芬太尼及4-ANPP在兩臺(tái)儀器上響應(yīng)最強(qiáng)的兩個(gè)子離子均為188.1和105.1，前者由氨基與哌啶環(huán)之間的C-N斷裂生成，后者由哌啶環(huán)氮原子與苯乙基之間的C-N斷裂生成(圖2A)。去苯乙基芬太尼在使用碰撞氣為氮?dú)獾腡riple Quad 6500時(shí)響應(yīng)最強(qiáng)的兩個(gè)子離子為150.1和84.1，二者均由氨基與哌啶環(huán)之間的C-N斷裂生成；使用碰撞氣為氬氣的LCMS-8050時(shí)響應(yīng)最強(qiáng)的兩個(gè)子離子為84.1和56.0，前者由氨基與哌啶環(huán)之間的C-N斷裂生成，后者由哌啶環(huán)碎裂生成(圖2B)。去苯乙基乙酰芬太尼的情況與去苯乙基芬太尼類(lèi)似。

表1 5種目標(biāo)化合物及其同位素內(nèi)標(biāo)MRM質(zhì)譜采集參數(shù)

續(xù)表1

圖2 5種目標(biāo)化合物子離子裂解途徑Fig.2 Proposed fragmentation pathways of product ions for five target compounds

2.2 色譜條件的優(yōu)化

鑒于目標(biāo)物使用電噴霧離子源在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè)，色譜梯度洗脫的水相選擇0.1%甲酸水溶液以提高離子化效率，有機(jī)相經(jīng)測(cè)試乙腈較甲醇響應(yīng)更強(qiáng)且柱壓更低，因而使用前者。色譜分離嘗試了ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)兩種色譜柱，使用離線固相萃取法時(shí)前者峰形更佳，使用在線固相萃取法時(shí)由于目標(biāo)物在固相萃取柱上洗脫后直接進(jìn)入色譜柱，后者對(duì)極性化合物保留更強(qiáng)，能在初始流動(dòng)相下更好進(jìn)行柱頭富集從而獲得更好的峰形。最終離線固相萃取法和在線固相萃取法優(yōu)化條件下的色譜圖見(jiàn)圖3，5種目標(biāo)物均得到有效分離。

圖3 5種目標(biāo)化合物TIC色譜圖Fig.3 TIC chromatograms of five target compounds

2.3 前處理方法的比較

固相萃取是分析污水中痕量有機(jī)物質(zhì)最常用的前處理方法。由于污水樣品基質(zhì)差異較大，本研究使用來(lái)自不同城市且經(jīng)測(cè)試不含5種目標(biāo)物的10份污水樣品，等比例混合制成混合空白污水基質(zhì)，并分別添加了1、10、100 ng·L-1的目標(biāo)物，考察了離線和在線兩種不同固相萃取模式的提取和凈化效果。

離線固相萃取使用全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行，50 mL污水樣品經(jīng)上樣、淋洗和洗脫后，洗脫液濃縮至干再加入250 μL溶劑復(fù)溶，LC-TQ-MS進(jìn)樣5 μL檢測(cè)，實(shí)際進(jìn)樣量相當(dāng)于1 mL污水樣品。鑒于5種目標(biāo)物全部為堿性有機(jī)物，固相萃取柱選擇了PRiME MCX和PRiME HLB進(jìn)行測(cè)試，該系列固相萃取柱不需活化和平衡步驟，能節(jié)省時(shí)間和溶劑消耗。PRiME MCX基于陽(yáng)離子交換模式，上樣時(shí)將污水樣品pH調(diào)節(jié)至小于2以保證目標(biāo)物充分質(zhì)子化，洗脫時(shí)則使用5%氨水甲醇溶液將目標(biāo)物去質(zhì)子化；PRiME HLB基于反相保留模式，上樣時(shí)將污水樣品pH調(diào)節(jié)至中性，洗脫時(shí)使用純甲醇。根據(jù)表2結(jié)果，PRiME MCX對(duì)于5種目標(biāo)物的提取回收率均大于80%，而PRiME HLB對(duì)于強(qiáng)極性的去苯乙基乙酰芬太尼的提取回收率僅有約40%，對(duì)去苯乙基芬太尼和4-ANPP的提取回收率也低于80%，且重復(fù)性較差。同時(shí)，由于污水中存在大量干擾物，所有目標(biāo)物均存在較為嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)，但除去苯乙基乙酰芬太尼外的4種目標(biāo)物使用PRiME MCX時(shí)基質(zhì)干擾更弱。綜合提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)可見(jiàn)，PRiME MCX對(duì)于所有目標(biāo)物的整體回收率均優(yōu)于PRiME HLB，這與以往相關(guān)研究結(jié)論一致[13]，即提取污水中堿性化合物時(shí)陽(yáng)離子交換模式的選擇性更好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中離線固相萃取均使用PRiME MCX柱。

在線固相萃取使用帶有固相萃取模塊的LC-TQ-MS進(jìn)行，首先由固相萃取流路加載3 mL污水樣品至在線固相萃取柱并淋洗，再將在線固相萃取柱切換至分析流路，由流動(dòng)相將其洗脫至色譜柱進(jìn)行分離和檢測(cè)。該模式下洗脫液直接進(jìn)入色譜柱，限制了需要強(qiáng)堿或強(qiáng)酸性洗脫條件的離子交換固相萃取柱的使用，因而只選擇了反相保留機(jī)理的HLB Direct Connect HP，上樣時(shí)將污水樣品調(diào)節(jié)至中性；同時(shí)由于提取和分析步驟同時(shí)在線進(jìn)行，無(wú)法進(jìn)行空白基質(zhì)提取后的添加實(shí)驗(yàn)，未能對(duì)提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行單獨(dú)評(píng)價(jià)。根據(jù)表2結(jié)果，HLB Direct Connect HP的整體回收率高于PRiME HLB而低于PRiME MCX，說(shuō)明其選擇性仍差于陽(yáng)離子交換模式，但與填料成分相同的PRiME HLB相比，在線固相萃取可保證所有被保留的組分均被洗脫進(jìn)入色譜柱，避免了離線固相萃取時(shí)洗脫、濃縮和復(fù)溶步驟可能帶來(lái)的損失，因而能獲得相對(duì)更高的回收率。鑒于在線固相萃取操作簡(jiǎn)便且所需污水樣品體積小，適用于大批量實(shí)際樣品的檢測(cè)，雖然效果較PRiME MCX差，后續(xù)也對(duì)該方法進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)價(jià)。

表2 不同固相萃取條件下的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和整體回收率比較

2.4 離線和在線固相萃取法方法的驗(yàn)證

2.4.1 檢出限、定量限與線性范圍使用混合空白污水基質(zhì)配制范圍為0.1～500 ng·L-1的不同濃度梯度的基質(zhì)添加樣品進(jìn)行測(cè)試，檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以3倍信噪比和10倍信噪比確定。以目標(biāo)物峰面積與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)與目標(biāo)物質(zhì)量濃度(X，ng/L)進(jìn)行線性回歸運(yùn)算(權(quán)重系數(shù)：1/X)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

兩種前處理方法對(duì)所有目標(biāo)物的定量線性范圍均為0.5～200 ng·L-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.995以上，可滿足實(shí)際污水樣品測(cè)定的要求。前處理方法研究中離線固相萃取整體回收率優(yōu)于在線固相萃取，但前者進(jìn)樣量?jī)H相當(dāng)于1 mL污水樣品，而后者進(jìn)樣量為3 mL，實(shí)際檢測(cè)的污水體積更大，因此最終兩種方法的效果相當(dāng)。

表3 方法檢出限、定量限、線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度

2.4.2 準(zhǔn)確度與精密度使用混合空白污水基質(zhì)分別配制濃度為1、10、100 ng·L-1的基質(zhì)添加樣品，每種濃度每天進(jìn)行6次測(cè)試，連續(xù)3天重復(fù)操作評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度和日間精密度，準(zhǔn)確度以測(cè)試結(jié)果平均值與添加值的相對(duì)誤差(RE)表示，精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。結(jié)果見(jiàn)表3。所有目標(biāo)物在3個(gè)添加濃度水平下的定量誤差均小于10%，日內(nèi)和日間RSD均小于6%，表明兩種方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合要求。值得注意的是，無(wú)論是離線還是在線固相萃取中4-ANPP都受到了嚴(yán)重的基質(zhì)干擾，整體回收率僅有20%左右，但通過(guò)同位素內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)后仍可獲得較為滿意的定量結(jié)果。

2.4.3 目標(biāo)物穩(wěn)定性分別將混合空白污水基質(zhì)配制的質(zhì)控樣品調(diào)節(jié)至pH 2和pH 7，考察不同存儲(chǔ)條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示兩種pH條件下，4 ℃冷藏1周以內(nèi)以及-20 ℃冷凍2個(gè)月以內(nèi)，5種目標(biāo)物的濃度變化均小于15%，說(shuō)明穩(wěn)定性良好，污水采樣后無(wú)需進(jìn)行特別的預(yù)處理。

2.5 方法的實(shí)際應(yīng)用

使用本研究建立的離線固相萃取法和在線固相萃取法，對(duì)2020年第二季度采集的1332份污水樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果均未檢出5種目標(biāo)物，且同位素內(nèi)標(biāo)均正常出峰，說(shuō)明樣品前處理及儀器檢測(cè)過(guò)程可靠。與相應(yīng)含量同位素內(nèi)標(biāo)溶液直接進(jìn)樣結(jié)果相比，污水樣品中同位素內(nèi)標(biāo)峰面積受到明顯抑制，二者峰面積比值主要分布于20%至80%區(qū)間(表4)，說(shuō)明實(shí)際污水的基質(zhì)干擾復(fù)雜，不同樣品間存在較大差異，因此必須使用同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正才能獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果。

表4 實(shí)際污水樣品中同位素內(nèi)標(biāo)峰面積抑制情況分布(%)

我國(guó)已于2019年5月1日起將芬太尼類(lèi)物質(zhì)整類(lèi)列入管制，本研究針對(duì)的芬太尼和乙酰芬太尼是最為常見(jiàn)的芬太尼類(lèi)物質(zhì)，去苯乙基芬太尼和去苯乙基乙酰芬太尼是二者的主要代謝產(chǎn)物，4-ANPP是多種芬太尼類(lèi)物質(zhì)的制造原料和代謝產(chǎn)物，本次在來(lái)自125個(gè)主要城市的實(shí)際樣品中均未檢出這5種物質(zhì)，說(shuō)明我國(guó)對(duì)芬太尼類(lèi)物質(zhì)的管控效果較好，不存在規(guī)模性濫用。

3 結(jié)論

本研究建立了兩種同時(shí)測(cè)定污水中5種芬太尼類(lèi)物質(zhì)及其代謝物的分析方法，分別基于離線和在線固相萃取技術(shù)，其中離線固相萃取的整體回收率高于在線固相萃取，但使用后者時(shí)污水樣品僅需過(guò)濾即可上樣，操作更為簡(jiǎn)便。驗(yàn)證結(jié)果顯示，通過(guò)同位素內(nèi)標(biāo)校正后，兩種方法均能對(duì)污水中的5種目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，線性范圍寬，準(zhǔn)確度和精密度較好，可用于實(shí)際污水樣品的檢測(cè)，從而評(píng)估相關(guān)區(qū)域內(nèi)芬太尼類(lèi)物質(zhì)的濫用情況，提升毒情監(jiān)測(cè)預(yù)警能力。