袁兵杰，張奕菲，劉 佩，王 娜，鄭騰飛，祁艷霞,2*

（1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471003；2.洛陽市動物遺傳育重點實驗室，河南洛陽 471003）

小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Microphthalmia-Associtated Transcription Factor，MITF)最早由德國科學(xué)家Hertwig 于1942 年在突變小鼠后代中發(fā)現(xiàn)，并將該突變位點命名為mi，突變個體表現(xiàn)為毛色、虹膜色素退減、小眼畸形和耳聾。在1993 年，最先由Hodgkinso從小鼠中克隆得到對應(yīng)的mi 位點基因MITF[1]。MITF屬于MITF 轉(zhuǎn)錄因子家族，該基因編碼區(qū)有9 個外顯子，編碼419 個氨基酸，MITF 基因編碼的蛋白具有基本-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（basic-Helix-Loop-Helix-LeucineZip-per，bHLHZip)結(jié)構(gòu)[2]，該結(jié)構(gòu)橫跨90 個氨基酸，基礎(chǔ)部分由11 個氨基酸組成，是MITF 蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)功能區(qū)，另外在N-末端和C-末端分別具有一個強轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)功能區(qū)和一個富含絲氨酸的激活域[3]。本實驗的目的是通過PCR-SSCP 方法尋找多態(tài)性位點，探索MITF 基因與朝鮮鵪鶉羽色之間的關(guān)聯(lián)性。

MITF 蛋白是一種核蛋白，參與并調(diào)節(jié)成黑色素細胞和黑色素細胞的生長發(fā)育。試驗證明，MITF 基因突變使得黑色素合成受阻，小鼠毛色表型呈現(xiàn)為白色皮毛[4]。本實驗選取北京白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉，提取DNA 后對目的基因進行擴增并檢測，利用不對稱PCR-SSCP 聚丙烯酰胺凝膠電泳對比分析以確定突變位點，分析各SNP 位點與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性，用以后續(xù)總結(jié)分析，得到此項內(nèi)容具有一定的研究價值。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

北京白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉取自河科大鵪鶉種業(yè)有限公司。隨機選取300 枚北京白羽鵪鶉和朝鮮鵪鶉（栗羽)受精蛋，于2020 年9 月份進行孵化，在孵化10d 時[5]采其翅組織樣品，迅速投入液氮中保存用于提取DNA。

1.2 朝鮮鵪鶉基因組DNA 提取

DNA 提取采用上海生工生物工程有限公司的試劑盒，進行室溫離心后收集DNA 溶液，可立即進行下一步試驗或置于冰箱-20℃保存。

1.3 朝鮮鵪鶉MITF 基因不對稱PCR-SSCP 分析

PCR 擴增分兩次進行，第一次擴增反應(yīng)體系：2×Taq Master-Mix 10μL，上下游引物各0.7μL，DNA 模板1μL 和ddH2O 7.6μL，總體積20μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min；95℃變性30s，退火30s，72℃延伸1min，36 個循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)所需的引物分別為MF3S、MF4S、MF5S（表1)。將目的基因PCR 擴增產(chǎn)物于110V 電壓下，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳對其進行檢測，隨后將所得的產(chǎn)物置于冰箱保存?zhèn)溆?。第二次PCR 反應(yīng)體系：第一次PCR 擴增產(chǎn)物1μL，上游引物或下游引物0.7μL，2×Taq Master-Mix10μL，最后加水至20μL。反應(yīng)條件同第一次PCR，20 個循環(huán)。對目的基因PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 朝鮮鵪鶉MITF 基因引物信息

1.4 不對稱PCR-SSCP 聚丙烯酰胺凝膠電泳及分析

取8μL 第二次擴增產(chǎn)物和2μL 6×loading buffer混合均勻，4℃下在12%的聚丙烯酰胺凝膠[V（丙烯酰胺)∶V（亞甲雙丙烯酰胺)=29∶1]上200V 電泳15min 后，調(diào)整電壓至100V，電泳10h，（具體電泳時間根據(jù)片段大小不同可進行調(diào)整)。電泳完畢后，取下玻璃板，進行染色，拍照保存，進行分析。每個基因型個體分別選取3 份PCR 擴增產(chǎn)物，送去測序，對比分析以確定突變位點。

1.5 SNP 位點與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性分析

計算基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC)，并運用皮爾遜卡方檢驗檢測朝鮮鵪鶉群體是否處于Hardy-Weinberg 平衡。利用SPSS13.0 進行χ2獨立性檢驗，分析各SNP 位點與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增結(jié)果

圖1 為北京白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉MITF 基因外顯子4、外顯子5 和3′UTR 的PCR 擴增結(jié)果，其片段長度分別為199、191 和185bp。產(chǎn)物條帶清晰、無雜帶，可以用于后續(xù)測序分析。

圖1 鵪鶉MITF 基因PCR 產(chǎn)物的電泳檢測

2.2 MITF 基因不對稱PCR-SSCP 電泳分析

經(jīng)不對稱PCR-SSCP 分析，MITF 基因擴增片段中均有2 個等位基因：A 和B，有3 種基因型：AA、BB 和AB，如圖2 所示。

圖2 鵪鶉MITF 基因擴增產(chǎn)物不對稱PCR-SSCP 分析

2.3 不對稱PCR-SSCP 測序結(jié)果分析

選取AA 型、AB 型和BB 型個體PCR 產(chǎn)物各3份進行測序，結(jié)果顯示有3 個突變位點，如圖3 所示，分別為c.589A＞G、c.761A＞G 和位于3′UTR 的c.2275C＞T，其中c.589A＞G 堿基的突變使得賴氨酸變?yōu)楣劝彼幔鐖D4 所示，且在3′UTR C＞T 的突變可能改變MicroRNA 結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性改變，具有一定的研究價值。

圖3 鵪鶉MITF 基因3 個突變位點的序列比對分析

圖4 MITF 基因c.589A＞G 突變導(dǎo)致編碼蛋白氨基酸的改變

2.4 鵪鶉MITF 基因突變位點的遺傳信息分析

在鵪鶉群體中MITF 基因的3 個SNP 中的優(yōu)勢等位基因頻率分別為0.68、0.68 和0.65，其中c.589A＞G 和c.761G ＞A 位點的優(yōu)勢等位基因為A，c.2275C＞T 位點的優(yōu)勢等位基因為B。對群體多態(tài)信息含量分析發(fā)現(xiàn)，3 個突變位點均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5)（見表2)。對3 個多態(tài)位點進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，鵪鶉群體在c.589A＞G、c.761A ＞G 和 c.2275C ＞T 3 個位點都達到Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05)（見表3)。

表2 MITF 基因不同基因型的群體遺傳學(xué)分析

表3 MITF 基因不同突變位點的Hardy-Weinberg 平衡檢測

2.5 鵪鶉MITF 基因突變位點與羽色的關(guān)聯(lián)性分析

對朝鮮鵪鶉和北京白羽鵪鶉2 個群體的3 個多態(tài)位點進行個體基因分型，計算各個突變位點的基因頻率和等位基因頻率，利用SPSS 13.0 軟件進行顯著性檢驗，并分析兩種羽色群體各突變位點基因型與羽色性狀的關(guān)聯(lián)，結(jié)果見表4。由表4 可知，在c.589A＞G 位點，兩個羽色群體之間基因型分布存在極顯著差異（P＜0.01)。同時，在c.2275C＞T 位點，兩個羽色群體之間基因型分布存在顯著差異（P＜0.05)。由此可以推斷，MITF 基因的c.589A＞G 和c.2275C＞T 突變位點可能與朝鮮鵪鶉羽色性狀具有一定的關(guān)聯(lián)性。

表4 朝鮮鵪鶉MITF 基因多態(tài)性與羽色性狀的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

動物不同的被毛顏色與羽毛顏色一直是育種工作者關(guān)注的主要問題。動物黑色素變異性沉著是肉眼可見的表型性狀[6]，是眾多基因共同作用的結(jié)果。黑色素的合成是酪氨酸酶催化體內(nèi)酪氨酸羥化而啟動的一系列反應(yīng)過程。酪氨酸酶、酪氨酸相關(guān)蛋白1 和多巴色素互變異構(gòu)酶功能紊亂會導(dǎo)致黑色素沉著失調(diào)[7]。本試驗通過設(shè)計3 對引物，分別擴增MITF 基因外顯子4、外顯子5 和3′UTR 的DNA 序列片段，利用不對稱PCR-SSCP 技術(shù)分析，于外顯子4、外顯子5和3′UTR 的DNA 序列片段均發(fā)現(xiàn)三種基因型，即AA、AB 和BB，測序后經(jīng)DNAMAN 軟件比對發(fā)現(xiàn)3 個突變位點，皮爾遜卡方檢驗表明朝鮮白羽鵪鶉群體在c.589A ＞G、c.761G ＞A 和c.2275C ＞T位點均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（P＞0.05)。在c.589A＞G和c.2275C＞T 位點處栗羽朝鮮鵪鶉的3 種基因型（AA、AB 和BB)的頻率分布與北京白羽鵪鶉的3 種基因型頻率分布存在顯著差異（P＜0.01)，說明該突變位點與鵪鶉羽色之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。這與黃晶[8]研究結(jié)果相一致，另有學(xué)者研究表明，純合子日本鵪鶉和雜合子日本鵪鶉羽色性狀的差異是由MITF 基因第11 外顯子的缺失[9]引起的，推測可能是MITF 基因的突變導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄和翻譯效率降低，引起蛋白功能、活性和空間構(gòu)象的改變，另外由于MITF 基因調(diào)控黑色素合成過程[10]，雖然非編碼區(qū)突變不會引起氨基酸的改變，但因改變了堿基組成，有可能影響轉(zhuǎn)錄，也可能存在對基因表達的影響，因此推測朝鮮鵪鶉群體中被毛顏色表現(xiàn)較深可能與群體中等位基因A 或B為優(yōu)勢基因有關(guān)。3′UTR 區(qū)域SNP 位點的同義突變雖未改變氨基酸結(jié)構(gòu)，但可能改變MicroRNA 結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生改變，因此具有進一步的研究價值。

4 結(jié)論

本試驗對朝鮮鵪鶉MITF 基因的部分序列進行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，位于MITF 基因外顯子4 的突變位點（c.589A＞G)使得賴氨酸變?yōu)楣劝彼?，該突變與朝鮮鵪鶉的羽色存在顯著關(guān)聯(lián)性，另外位于3′UTR 處的c.2275C＞T 突變也與朝鮮鵪鶉的羽色存在顯著關(guān)聯(lián)性，但其具體的影響機制需進行下一步深入研究。