閔珺，程清鳳，章橋，袁真

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌 330006）

女性在絕經(jīng)期后，由于體內(nèi)雌性激素的缺乏，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)激活，炎癥因子慢性持續(xù)增高，最終造成骨量的丟失，骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞。臨床上治療骨質(zhì)疏松所采用的激素替代療法，由于在宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌等方面的副作用而令人擔(dān)憂。因此，尋求一種有效且副作用輕的藥物是目前國際醫(yī)療界治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要課題。

大量研究已經(jīng)證實(shí)，杜仲黃酮作為杜仲葉中的有效成分，具有抗骨質(zhì)疏松的療效[1-2]。槲皮素作為杜仲黃酮類有效成分具有類雌激素作用，能夠通過抑制骨質(zhì)的吸收促進(jìn)成骨，從而抗骨質(zhì)疏松的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)擬通過研究槲皮素對(duì)卵巢去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的影響，為臨床治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供有效的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源8周齡SPF級(jí)雌性SD大鼠30只，體重（265.70±7.89）g，購自湖南斯萊克景達(dá)試驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（湘）2016-2002。實(shí)驗(yàn)期間保持良好的通風(fēng)，室溫在22～26℃，保持40%～60%的相對(duì)濕度。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及配制 實(shí)驗(yàn)藥品：槲皮素、羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）由Sigma公司提供，產(chǎn)品批號(hào)：XSD201510008。槲皮素由sigma公司提供，0.5%羧甲基纖維素鈉溶劑助溶，4℃冰箱避光保存。

1.1.3 主要儀器 （1）離心機(jī)：賽默飛世爾科技公司。（2）Mirco-CT檢測(cè)儀：（上海懷宇生物有限公司）對(duì)大鼠股骨進(jìn)行掃描并行數(shù)據(jù)分析。（3）全自動(dòng)生化分析儀：Roche Diagno’stics。（4）骨密度測(cè)量儀：GE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）取8周SD大鼠30只，體重（265.70±7.89）g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分成3組，假手術(shù)組（Sham組），模型組（OVX組），槲皮素組（Quercetin+OVX組），各10只。（2）OVX組和Quercetin+OVX組：1%的戊巴比妥鈉對(duì)SD大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后，超凈臺(tái)內(nèi)從大鼠下腹部做縱行切口，切開腹直肌，結(jié)扎雙側(cè)輸卵管，并切除雙側(cè)卵巢，隨后縫合肌層及皮膚；Sham組：切除卵巢附近與卵巢質(zhì)量大致相等的脂肪組織，不對(duì)卵巢做任何處理。術(shù)后自由飲水，攝食。（3）術(shù)后第3天開始，Sham組、OVX組均每天給予3 mL羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)灌胃，Quercetin+OVX組給予槲皮素溶劑按照50 mg／（kg·d）灌胃。槲皮素給藥劑量根據(jù)人鼠等效劑量轉(zhuǎn)換表進(jìn)行換算[4-5]。（4）連續(xù)灌胃8周后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，經(jīng)膀胱收集大鼠尿液，檢測(cè)尿液中鈣離子（U－Ca）和磷離子（U-P）的濃度水平；同時(shí)收集SD大鼠股動(dòng)脈血液進(jìn)行離心（3000 r／min），選取上層血清進(jìn)行鈣離子（S-Ca）及磷離子（S-P）濃度測(cè)定。（5）通過剪破心臟處死大鼠，分離SD大鼠一側(cè)股骨，置于Mirco-CT線圈進(jìn)行CT螺旋掃描，計(jì)算機(jī)測(cè)定骨礦物質(zhì)含量（Bone Mineral Density，BMD）、骨小梁數(shù)量（Trabecula,Tb.N）、骨小梁厚度(Trabecula Thickness,Tb.Th)、相對(duì)骨體積（Bone Volume,BV/TV）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（Structure Model Index,SMI），取大鼠另外一側(cè)股骨，進(jìn)行骨力學(xué)性能分析，測(cè)定彈性載荷、彈性橈度、最大載荷和最大橈度。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)卵巢去勢(shì)大鼠體重的影響 與Sham組比較，OVX組和Quercetin+OVX組的大鼠體重逐漸升高。8周后，兩組大鼠體重與Sham組開始出現(xiàn)差異（P＜0.01），并且OVX組和Quercetin+OVX組兩組大鼠之間體重增長差異不明顯（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠體重測(cè)定結(jié)果

2.2 槲皮素在血清和尿液中鈣、磷的影響 各組間S-Ca和S-P平均濃度無明顯差異（P＞0.05）。與Sham組相比，OVX組大鼠U-Ca、U-P濃度水平顯著升高（P＜0.05）；Quercetin+OVX組的U-Ca、U-P濃度水平顯著低于OVX組(P＜0.05)；而三組間血鈣與血磷水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，槲皮素能在不同程度上抑制去卵巢大鼠UCa、U-P的丟失。見圖2。

圖2 各組大鼠血鈣、血磷、尿鈣、尿磷測(cè)定結(jié)果

2.3 槲皮素增加卵巢去勢(shì)大鼠股骨干骺端骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度 從Micro-CT三維重建圖可以看出，與Sham組比較，OVX組大鼠股骨干骺端骨小梁數(shù)量顯著減少，骨小梁厚度變薄；經(jīng)槲皮素干預(yù)后的大鼠股骨干骺端的骨小梁和厚度均增加，見圖3。

圖3 各組大鼠mirco-CT結(jié)果測(cè)定

2.4 槲皮素增加卵巢去勢(shì)大鼠的BMD值和結(jié)構(gòu)生物力學(xué)性能 大鼠在去除卵巢后，由于缺乏雌激素，導(dǎo)致骨量減少，表現(xiàn)為OVX組大鼠的BMD值顯著低于Sham組大鼠（P＜0.01）；在給去卵巢大鼠口服槲皮素后，骨丟失減少，表現(xiàn)為Quercetin+OVX組 大鼠 的BMD值 高 于OVX組 大 鼠（P＜0.05）（見圖4A），且與Sham組相比也存在一定的差異（P＜0.05），結(jié)果表明槲皮素可以提高BMD值，但不能逆轉(zhuǎn)骨丟失。彈性橈度、最大橈度、彈性載荷作為生物力學(xué)相關(guān)指標(biāo)，能夠反應(yīng)骨的力學(xué)性能。與Sham組相比，OVX組股骨彈性橈度、最大橈度、彈性載荷及最大載荷均顯著降低（P＜0.05）。經(jīng)槲皮素干預(yù)后，Quercetin+OVX組以上各項(xiàng)指標(biāo)均高于OVX組（P＜0.05），見圖4B和C。

圖4 B和C示 通過三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，觀察各組大鼠股骨彈性橈度、最大橈度、彈性載荷及最大載荷值

2.5 槲皮素改善骨形態(tài)學(xué)參數(shù) 通過Micro-CT進(jìn)行三維立體掃描，結(jié)果顯示：與Sham組相比，OVX組 的Tb.N、Tb.Th、BV/TV均 顯 著 降 低(P＜0.05)。OVX組的SMI值高于Sham組大鼠(P＜0.05)；與OVX組相比，槲皮素能顯著提高Tb.N、Tb.Th、BV/TV，改善股骨微結(jié)構(gòu)(P＜0.05)，見圖5。

圖5 各組大鼠骨相關(guān)參數(shù)測(cè)定

3 討論

骨質(zhì)疏松的治療一直以來都是一個(gè)難題，臨床上常使用雌激素補(bǔ)充療法來治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，但雌激素的副作用，在一定程度上限制了它的用途。有證實(shí)杜仲黃酮能夠影響骨代謝，并發(fā)揮著積極的作用。槲皮素是杜仲黃酮亞類的主要單體成分，已有的研究發(fā)現(xiàn)其具有抗骨質(zhì)疏松的作用，但其機(jī)制不明。研究者Kim YJ采用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明槲皮素能夠誘導(dǎo)骨橋蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和Runx2的表達(dá)增加，小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了槲皮素能夠通過激活雌激素受體依賴機(jī)制增強(qiáng)細(xì)胞成骨分化，從而增加骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)[6-8]。

本研究選取8周齡的SD大鼠，去勢(shì)后結(jié)果顯示假手術(shù)組（Sham組）的骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量等指標(biāo)均顯著高于OVX組，表明造模成功。骨的構(gòu)成主要是分為骨礦物質(zhì)與骨基質(zhì)兩部分。在骨微環(huán)境中，存在著破骨與成骨的一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，絕經(jīng)后的大鼠，這個(gè)平衡系統(tǒng)被打破，破骨占據(jù)優(yōu)勢(shì)時(shí)，骨的吸收增加[9]。通過檢測(cè)血液和尿液中的鈣離子、磷離子水平，可以間接反映骨的代謝情況。研究顯示，卵巢去勢(shì)大鼠與正常健康大鼠相比，血清鈣、磷離子濃度水平之間無明顯差異性，尿液中鈣離子與磷離子的濃度顯著升高，說明尿鈣與尿磷的排泄，可能與骨密度的下降有一定相關(guān)性[10]。而本研究也發(fā)現(xiàn)，OVX組大鼠尿鈣和磷的水平明顯較Sham組升高，槲皮素能夠顯著降低OVX大鼠尿鈣和磷的水平，其結(jié)果與以往研究一致。

我們通過觀察槲皮素治療卵巢去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的療效，發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠在不影響大鼠體重的前提下增加去卵巢大鼠的骨小梁數(shù)量（Tb.N）及骨小梁厚度(Tb.Th)，增加骨礦物質(zhì)含量(BMD)，即槲皮素能夠改善骨的微結(jié)構(gòu)，提高骨的質(zhì)量，我們的研究結(jié)果與以往的研究一致[11]。實(shí)驗(yàn)使用Micro-CT對(duì)大鼠股骨的干骺端進(jìn)行掃描，對(duì)股骨結(jié)構(gòu)的骨形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。BV/TV、TB.N、Tb.Th作為骨結(jié)構(gòu)的正向指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示去除卵巢的大鼠，將會(huì)導(dǎo)致骨小梁結(jié)構(gòu)生長不良，BV/TV、TB.N、Tb.Th均下降，骨小梁出現(xiàn)斷裂甚至消失。而SMI是骨形態(tài)參數(shù)的一個(gè)負(fù)性指標(biāo)，理想狀態(tài)下，標(biāo)準(zhǔn)桿狀骨和板狀骨的SMI值分別為3和0。去除卵巢的大鼠較正常大鼠的SMI值高。實(shí)驗(yàn)證實(shí)槲皮素可降低SMI值，改善骨的微結(jié)構(gòu)環(huán)境，減少骨質(zhì)丟失，盡管如此，但卻不能逆轉(zhuǎn)骨的丟失。這也提示我們，盡早開展絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松治療可以有效的降低骨丟失，女性絕經(jīng)期間骨質(zhì)疏松的預(yù)防尤為重要。

此外本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定骨力學(xué)性能分析，其結(jié)果顯示槲皮素能夠提高骨的載荷和橈度，說明槲皮素能夠改善骨的功能。因此槲皮素能夠從結(jié)構(gòu)和功能兩方面治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。

有研究表明增加血鈣的吸收，減少尿鈣的排泄，對(duì)防止骨密度的降低能夠起到一定的幫助作用[12]，這與研究結(jié)果中槲皮素干預(yù)組OVX大鼠尿鈣、尿磷減低的結(jié)果一致。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明槲皮素能夠增加骨礦物質(zhì)含量，減少鈣磷丟失，來保持骨的形成與吸收平衡不被打破。

已有綜述報(bào)道，槲皮素具有類雌激素作用，能夠通過抑制骨質(zhì)的吸收達(dá)到促進(jìn)成骨的作用[13]。有研究表明[14]，在刺激骨祖細(xì)胞向成熟的成骨細(xì)胞分化過程中，雌激素扮演著重要角色。去除卵巢后的大鼠由于雌激素的缺乏能顯著增加大鼠體重，而本研究結(jié)果顯示Quercetin+OVX組與OVX組大鼠體重?zé)o明顯差異，表明槲皮素不能抑制雌激素缺乏所致的大鼠體重增加，但另一方面也證實(shí)該藥物在體重方面無不良影響。目前應(yīng)用雌激素治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松在宮頸癌及子宮內(nèi)膜癌等方面的副作用令人擔(dān)憂，上述研究結(jié)果使我們減輕了該成分在子宮相關(guān)并發(fā)癥方面的顧慮[15-16]，為今后運(yùn)用槲皮素等杜仲黃酮類治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松以及其他疾病提供理論疾病。

綜上所述，槲皮素作為杜仲黃酮類單體對(duì)去卵巢大鼠具有抗骨質(zhì)疏松的作用。槲皮素是通過改善骨代謝，增加BMD，提高骨形態(tài)學(xué)參數(shù)達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的作用。在此部分研究中，我們已成功分離并培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們將從細(xì)胞層面研究其具體抗骨質(zhì)疏松機(jī)制。