仇志強(qiáng)，廖琦，蔡風(fēng)，周斌，王萌

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，南昌 330000）

非創(chuàng)傷無菌性股骨頭壞死可以導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)疼 痛不適，最后股骨頭發(fā)生塌陷，進(jìn)一步可能需要行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)[1]?，F(xiàn)在研究又認(rèn)為股骨頭無菌性壞死是一種骨細(xì)胞或者間充質(zhì)干細(xì)胞的疾病。股骨頭壞死患者骨髓造血及間室中的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量及活力都大為下降[2]。因此有了大量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨壞死的研究，但是對(duì)于其療效尚存在爭(zhēng)議。淫羊藿是傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯陽中草藥，其主要化學(xué)成分是黃酮、苷和多糖。有研究表明，淫羊藿總黃酮具有防治切除卵巢大鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的作用[3]，而單體成分淫羊藿苷不僅促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，還抑制其分化為破骨細(xì)胞和抑制其骨吸收活性[4]。但它對(duì)骨壞死微環(huán)境中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響如何，國內(nèi)外尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以加入了壞死骨培養(yǎng)液的條件培養(yǎng)基來模擬體內(nèi)骨壞死微環(huán)境，探討骨壞死微環(huán)境對(duì)外源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響及淫羊藿苷在骨壞死微環(huán)境中對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響，佐證淫羊藿苷可以增強(qiáng)BMSCs治療股骨頭無菌性壞死的療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器12月齡清潔級(jí)健康雜種犬4只，雌雄不限，體重15~20 kg，由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS（GIBCO公司，美國）；犬單核細(xì)胞分離液（嘉美生物技術(shù)公司）ALP檢測(cè)試劑盒、ALP染液（南京建成生物工程研究所）；MTT試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%，北京華邁科生物技術(shù)公司）；地塞米松、β-磷酸甘油鈉和維生素C（Sigma公司，德國）；茜素紅（北京索萊寶科技公司）恒溫CO2培養(yǎng)箱（SANYO公司，日本）；超凈工作臺(tái)（北京長(zhǎng)城空氣凈化公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標(biāo)儀（Thermo公司 美國）

1.2 犬BMSCs的分離、培養(yǎng) 對(duì)試驗(yàn)狗進(jìn)行速眠新II(0.04～0.08 mL/kg)肌肉注射全身麻醉，以髂后上棘為穿刺點(diǎn)，抽取骨髓約10 mL。與PBS緩沖液1∶1混勻后，小心加于20 mL的狗單核細(xì)胞分離液（1.077 g／mL）的液面上，以2500 r/min離心30分鐘，此時(shí)離心管中由上至下細(xì)胞分四層，收集乳白色的單個(gè)核細(xì)胞層細(xì)胞，反復(fù)PBS洗滌、離心后得狗骨髓單個(gè)核細(xì)胞，接種于含完全培養(yǎng)基(LDMEM、10%FBS、100 U/mL青、鏈霉素)的75 cm2培養(yǎng)瓶，置37℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d全量換液1次，去除未貼壁成分。細(xì)胞80%融合時(shí)，傳代培養(yǎng)。

1.3 壞死骨的培養(yǎng)及培養(yǎng)液的收集 對(duì)試驗(yàn)狗進(jìn)行全身麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上。參照童培建[5]等人的實(shí)驗(yàn)方法以液氮冷凍建立股骨頭壞死模型。造模后2周處死實(shí)驗(yàn)狗，無菌條件下取出壞死的股骨頭，去除周圍軟組織及外層軟骨，將股骨頭切成大小合適的小骨塊，置于含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，同時(shí)行病理切塊證實(shí)股骨頭已壞死。每3 d全量換液1次，收集壞死骨培養(yǎng)液，2500 r/min離心30 min去除其中的細(xì)胞及雜質(zhì)，過濾除菌后分裝，-20℃冰箱冷藏。

1.4 細(xì)胞增殖分析P2代細(xì)胞以2×104cell／mL接種于96孔板中，每孔100 μL。24 h后更換含2.58、4.18、6.77、10.95、17.72 μg/mL淫羊藿苷的條件培養(yǎng)基(L-DMEM、10%FBS、5%壞死骨培養(yǎng)液、100 U/mL青、鏈霉素)。同時(shí)設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組更換不含淫羊藿苷的條件培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組更換普通的完全培養(yǎng)基，且對(duì)照組都應(yīng)加入不含淫羊藿苷的載體溶液(DMSO)1 μL／mL，每組平行做6孔。每2~3天換1次培養(yǎng)液，分別于干預(yù)后3、6、8天棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，換含無血清DMEM后每孔加入10 μL MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入100微升Formanzan溶解液，置搖床上低速振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀630 nm測(cè)定吸光度（OD）值。

1.5 成骨性分化分析P2代細(xì)胞以5×104cell／mL接種于6孔板中，每孔1.5 mL。3 d后更換含2.58、4.18、6.77、10.95、17.72 μg/mL淫羊藿苷的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(條件培養(yǎng)基、10~8 mol/L地塞米松50 umol/L維生素C 10 mmol/L B-甘油磷酸鈉)。同時(shí)設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組更換不含淫羊藿苷的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組更換不含壞死骨培養(yǎng)液的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，同樣對(duì)照組都加入不含淫羊藿苷的載體溶液(DMSO)1 μL／mL，每組平行做3孔。每2~3天換1次培養(yǎng)液。

1.5.1 ALP活性測(cè)定 于成骨誘導(dǎo)后第7、14 d收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)細(xì)胞外ALP活性。分別往96孔板中加入待測(cè)培養(yǎng)液30 μL，逐一加入緩沖液、基質(zhì)液各50 μL/孔，37℃水浴30 min，加入顯色劑150 μL/孔，充分混勻后置于酶標(biāo)儀上測(cè)定492 nm處的吸光度(OD)值。為計(jì)算培養(yǎng)液中ALP濃度及排除壞死骨培養(yǎng)液本身的干擾，特設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔及壞死骨培養(yǎng)液對(duì)照孔。各組ALP活性最后以金氏單位/100 mL表示。

1.5.2 ALP細(xì)胞染色 于成骨誘導(dǎo)后8 d，利用偶氮偶合法進(jìn)ALP組織化學(xué)染色。棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，滴加固定液固定3 min，固定后滴加底物應(yīng)用液蓋滿樣本部分，加蓋疏水膜，放置濕盒中，避光37℃孵育15 min，水洗3遍。 趁濕用蘇木素復(fù)染3 min左右。水洗，鏡檢。

1.5.3 鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色 于成骨誘導(dǎo)后14天進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色。染色方法：細(xì)胞用4℃、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇固定1 h，漂洗后加入0.5%茜素紅(Tris-Hcl，pH 8.3)37℃染色30 min，鈣化結(jié)節(jié)染為紅色。顯微鏡下觀察結(jié)果，并使用氯化十六烷基吡啶（Cetylpyridiniumchloride，CPC）對(duì)茜素紅染色的礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行溶解，靜置10 min后，將溶解后的液體按實(shí)驗(yàn)分組收集入96孔板中，上酶標(biāo)儀，在波長(zhǎng)562 nm的設(shè)定下測(cè)定各孔OD值，收集整理數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 造模后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察 術(shù)后正常圈養(yǎng)實(shí)驗(yàn)狗，2周后處死實(shí)驗(yàn)狗后可見股骨頭表面光滑，關(guān)節(jié)液數(shù)量及顏色未發(fā)現(xiàn)明顯異常，無股骨頭塌陷，股骨頭外形規(guī)則。將股骨頭進(jìn)行X線檢查及病理學(xué)檢查證實(shí)股骨頭壞死（圖1）。

2.2 犬BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)細(xì)胞接種后見大量比較一致的圓形細(xì)胞。8~12 h后開始貼壁，貼壁細(xì)胞多呈多角形、橢圓形或梭形。3 d后貼壁細(xì)胞呈短梭形或星形(圖2a);6 d時(shí)貼壁細(xì)胞大部分呈梭形，少部分細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞接觸緊密，部分區(qū)域融合成片;10~12 d細(xì)胞融合成單層，呈典型細(xì)長(zhǎng)梭形外觀，集束狀排列(圖2b)。犬BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槎噙呅巍⑷切?；胞漿飽滿，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞可復(fù)層生長(zhǎng)至形成密集的細(xì)胞團(tuán)簇，中心出現(xiàn)細(xì)胞基質(zhì)的沉積，培養(yǎng)皿底部可見白色斑塊礦化結(jié)節(jié)（圖2c、圖2d）。

2.3 淫羊藿苷在骨壞死微環(huán)境中對(duì)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響 如表1所示，淫羊藿苷可抑制BMSCs的增殖，淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞量均少于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；其中干預(yù)后第3天17.72 μg/mL組抑制作用最為明顯(P＜0.01)。壞死骨培養(yǎng)液可促進(jìn)BMSCs的增殖，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量均多于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組犬BMSCs增殖情況比較（±s）

表1 各組犬BMSCs增殖情況比較（±s）

注：與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較ΔP＜0.01；與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 n 3 d OD630 6 d 8 d 2.58 μg/mL 4.18 μg/mL 6.77 μg/mL 10.95 μg/mL 17.72 μg/mL實(shí)驗(yàn)對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組6666666 0.1453±0.0032Δ**0.1483±0.0051Δ**0.1493±0.0351Δ**0.1520±0.0200Δ**0.1270±0.0036Δ**0.1753±0.0152**0.1670±0.0026 0.1687±0.0038Δ 0.1690±0.0061Δ 0.1653±0.0038Δ*0.1757±0.0055Δ 0.1770±0.0020Δ 0.2410±0.0118**0.1787±0.0045 0.2200±0.0132Δ 0.2163±0.0146Δ 0.2180±0.0096Δ 0.2263±0.0153Δ 0.2167±0.0186Δ 0.2683±0.0284*0.2320±0.0223

2.4 淫羊藿苷在骨壞死微環(huán)境中對(duì)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外ALP活力的影響 犬BMSCs成骨性誘導(dǎo)第7 d，淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組ALP活性均顯著高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；高藥物濃度組較低濃度組ALP分泌較多,而實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.598)，見表2。

表2 各組細(xì)胞外ALP活性

2.5 淫羊藿苷在骨壞死微環(huán)境中對(duì)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)ALP的影響 細(xì)胞經(jīng)ALP染色后，細(xì)胞核呈藍(lán)色，ALP陽性者胞漿中出現(xiàn)紅至紅棕色顆粒，有些為棕褐色或咖啡色顆粒，各組細(xì)胞ALP染色均可見陽性表現(xiàn)，其中實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組僅可見彌散的紅色，偶見紅色或咖啡色顆粒（圖3a）；淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞可見有中等量的紅棕色顆粒（圖3b），但各藥物濃度組間鏡下未見明顯差異。

2.6 淫羊藿苷在骨壞死微環(huán)境中對(duì)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)形成的影響 茜素紅染色結(jié)果顯示，成骨性誘導(dǎo)14天后，各組細(xì)胞聚集樣生長(zhǎng)，在聚集生長(zhǎng)的中心可見點(diǎn)狀染色陽性的鈣化結(jié)節(jié)；而淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組形成鈣化結(jié)節(jié)的作用更強(qiáng)，形成的鈣化結(jié)節(jié)不但數(shù)量多，且面積(團(tuán)塊狀)也較前兩者大（圖4a、圖4b）；鈣化結(jié)節(jié)濃度（見圖4c）也顯示淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組鈣結(jié)節(jié)濃度均多于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組（P＜0.01），10.95、17.72 μg/mL淫羊藿苷實(shí)驗(yàn)組形成鈣結(jié)節(jié)的濃度更多。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組在形成鈣結(jié)節(jié)濃度上沒有明顯差異。

3 討論

至今為止無菌性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)理和原因并沒有完全搞清楚。但是，隨著干細(xì)胞研究和再生醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死的始動(dòng)因素可能是細(xì)胞起源的，而這也使得細(xì)胞療法治療股骨頭壞死成為可能[6-7]。臨床上也出現(xiàn)了許多關(guān)于骨髓干細(xì)胞移植治療股骨頭壞死的研究，研究表明骨髓干細(xì)胞移植對(duì)于延緩早期股骨頭壞死的進(jìn)展及減少壞死區(qū)域面積具有一定的作用，但還是有許多患者避免不了最終要出現(xiàn)股骨頭的塌陷[8-9]。為何同種分期的股骨頭壞死患者在進(jìn)行骨髓干細(xì)胞移植后會(huì)出現(xiàn)完全相反的結(jié)果，骨壞死區(qū)域的微環(huán)境對(duì)植入的骨髓干細(xì)胞的影響到底如何，目前還不是很清楚。

本實(shí)驗(yàn)以犬BMSCs為研究對(duì)象，利用含有壞死骨培養(yǎng)液的條件培養(yǎng)基在體外模擬骨壞死微環(huán)境對(duì)BMSCs的影響。研究發(fā)現(xiàn)壞死骨培養(yǎng)液可促進(jìn)BMSCs的增殖，但對(duì)其成骨性分化未見明顯影響。說明在BMSCs培養(yǎng)過程中加入壞死骨培養(yǎng)液來模擬骨壞死微環(huán)境是可行的，為BMSCs移植治療股骨頭壞死提供了有力支持，但這一發(fā)現(xiàn)也和先前Hernigou等[2]人研究發(fā)現(xiàn)的激素誘導(dǎo)性股骨頭壞死患者骨髓造血及間室中的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量及活力都大為下降這一結(jié)果相矛盾。其原因可能是本實(shí)驗(yàn)采用的是液氮冷凍法制作股骨頭壞死模型，在造模后的這段時(shí)間機(jī)體會(huì)合成一系列的可溶性調(diào)節(jié)因子來修復(fù)損傷刺激，其中包括TGF、IL-1、IL-6、花生四烯酸代謝產(chǎn)物前列環(huán)素、小分子多肽等，這些分子都具有調(diào)節(jié)細(xì)胞趨化、增殖、分化及生存的功能[10]。當(dāng)然也有可能是壞死骨在培養(yǎng)過程中分泌了一些其它的促進(jìn)BMSCs增殖的物質(zhì)，具體機(jī)制如何還有待進(jìn)一步研究。

淫羊藿苷是傳統(tǒng)中藥淫羊藿的有效藥理成分，近年來已被廣泛用于抗骨質(zhì)疏松治療和成骨、破骨細(xì)胞研究。既往研究表明淫羊藿苷可通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中Cbfa1 mRNA和Osterix mRNA的表達(dá)及促進(jìn)成骨細(xì)胞形態(tài)發(fā)生蛋白2的合成等機(jī)制，加速成骨細(xì)胞的增殖和分化[11-12]。本實(shí)驗(yàn)以骨壞死微環(huán)境中培養(yǎng)的犬BMSCs為靶細(xì)胞，對(duì)淫羊藿苷作為一種骨誘導(dǎo)活性因子的可行性也做了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組濃度的淫羊藿苷在骨壞死微環(huán)境中均可抑制BMSCs增殖,且抑制程度與藥物濃度相關(guān),以17.72 μg/mL淫羊藿苷組抑制最為明顯，其余各相鄰藥物濃度組間未見明顯差異。這可能與此次實(shí)驗(yàn)采用了黃金分割原理來實(shí)現(xiàn)藥物濃度分組有關(guān)，使得各組藥物濃度的作用變化較為緩和，也更容易發(fā)現(xiàn)最適藥物濃度[13]。

雖然淫羊藿苷在骨壞死微環(huán)境中抑制BMSCs的增殖，但其卻提高了細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的表達(dá)及細(xì)胞外堿性磷酸酶活力。因?yàn)閴A性磷酸酶是BMSCs的早期成骨分化指標(biāo)，所以該結(jié)果證明淫羊藿苷在骨壞死微環(huán)境中同樣具有成骨分化活性。由于增殖和分化是細(xì)胞生命活動(dòng)的兩個(gè)方面，增殖中的細(xì)胞其分化功能受到抑制，而分化中的細(xì)胞其增殖能力降低[14]。因此，考慮淫羊藿苷可能因促進(jìn)細(xì)胞分化而抑制了細(xì)胞的增殖效應(yīng)。淫羊藿苷組和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組在培養(yǎng)后第6 d及第8 d時(shí)的細(xì)胞數(shù)目未見明顯差異也可間接說明此范圍濃度的淫羊藿苷對(duì)細(xì)胞并無毒性作用。鈣化結(jié)節(jié)則是成骨細(xì)胞功能活動(dòng)的表現(xiàn)形式，14 d時(shí)的茜素紅染色同樣表明，淫羊藿苷在壞死骨微環(huán)境中可誘導(dǎo)犬BMSCs向成骨分化，同時(shí)還可促進(jìn)細(xì)胞外鈣鹽的沉積，高劑量淫羊藿苷組較低劑量組誘導(dǎo)形成的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量多、面積更大。這也與早期成骨分化時(shí)的堿性磷酸酶結(jié)果是基本一致的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)說明骨壞死微環(huán)境對(duì)BMSCs的增殖是有促進(jìn)作用的，目前暫未發(fā)現(xiàn)其對(duì)BMSCs的成骨性分化有明顯影響。而淫羊藿苷在骨壞死微環(huán)境中具有抑制BMSCs增殖的作用，同時(shí)可以促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。如能在細(xì)胞基因及蛋白層面來充分研究淫羊藿苷的藥理作用及機(jī)制，確定其最適的藥物濃度，那么淫羊藿苷可能成為輔助骨髓干細(xì)胞移植治療股骨頭壞死的一種新藥。當(dāng)然本次試驗(yàn)尚屬初步研究，以壞死骨培養(yǎng)液模擬骨壞死微環(huán)境的可行性及可信度如何還有待進(jìn)一步研究，是否利用Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)體系來模擬骨壞死微環(huán)境更為可行，這將是下一步研究所努力的方向。