鐘榮生, 饒小勇,3，房元英,3，何 雁, 陸浩偉，劉 微,3*，羅曉健,3*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006；3.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，南昌 330006

姜黃素(curcumin, Cur)是從中藥姜黃中提取的一種黃色多酚化合物，是一種強天然抗氧化劑，可預(yù)防多種疾病，通過抗氧化、抗炎等作用治療動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病及腦梗死等疾病[1-3]。但Cur的水溶性較差，生物利用度低，進入體內(nèi)后很快轉(zhuǎn)化成葡萄糖醛酸結(jié)合物而快速排出體外，限制了其應(yīng)用[4-7]。因此，在治療腦梗死時，改善Cur溶解度低、透過血腦屏障差等問題，是提高其腦內(nèi)轉(zhuǎn)移率的重點。

聚合物膠束是由雙親聚合物在選擇性溶劑中發(fā)生微相分離形成的具有疏水性核與溶劑化殼的一種自組裝結(jié)構(gòu)，能增加藥物溶解度，借助自身粒徑小的優(yōu)勢，協(xié)助藥物透過血腦屏障，且成本較低，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[8-12]，已經(jīng)成為近年來研究及應(yīng)用的熱點。

在前期實驗基礎(chǔ)上，確定的關(guān)鍵因素有膠束比例、表面活性劑比例、藥物輔料比例、制備溫度等。為了滿足應(yīng)用要求，提高膠束對Cur的載藥率，本研究用星點設(shè)計效應(yīng)面法對Cur-PLA-NO的制備處方及工藝進行優(yōu)化，以期利用膠束載藥系統(tǒng)的制劑特性提高Cur的溶解度和血腦屏障透過率。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；METTLER TOLEDO MS205DU十萬分之一天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司]；CO2細胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技公司)；Zetasizer Nano ZS90型納米粒度儀(英國馬爾文公司)；ZNCL-GS型磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；GZLY-1型冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；Millicell ERS-2、MillicellTranswell Inserts均購自Millipore公司。

1.2 試藥

姜黃素原料藥(質(zhì)量分數(shù)為98%，南京春秋生物工程有限公司)；mPEG-PLA-NO為自制(專利號：CN107998405A)；叔丁醇(分析純，上海麥克林有限公司)；吐溫80(質(zhì)量分數(shù)為98%，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；L-半胱氨酸(質(zhì)量分數(shù)為98%，日本東京化成工業(yè)株式會社)；胎牛血清(fatal bovine serum, FBS，美國Gemini公司)；DMEM(高)，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)均購自美國Hyclone公司；聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯(polyoxyl 15 hydroxystearate, HS15，北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司)；bEnd.3 細胞完全培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.3 細胞

bEnd.3細胞來源于美國ATCC細胞庫。

2 方法

2.1 Cur-PLA-NO的制備

用溶劑蒸發(fā)法制備Cur-PLA-NO[13]。精密稱取姜黃素、mPEG-PLA-NO和聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯(polyoxyl 15 hydroxystearate, HS15)，加入溶劑叔丁醇，60 ℃磁力攪拌1 h，加入純化水，攪拌20 min，靜置至室溫，加入質(zhì)量濃度1 mg·mL-1甘露醇攪拌至溶解，過0.22 μm濾膜后，-20 ℃預(yù)凍7 h，緩慢降溫抽真空凍干，即得Cur-PLA-NO。

2.2 姜黃素的含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱為Diamonsil 5 μm C18(250 mm×4.6 mm)；流動相為冰醋酸水溶液(40 mL·L-1)-乙腈(52∶48)；檢測波長為430 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1；進樣量為10 μL。

2.2.2主要溶液的配制 對照品溶液：精密稱定姜黃素對照品20.00 mg，置于25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品儲備液。取上述儲備液12.5 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容，搖勻即得質(zhì)量濃度為0.40 mg·mL-1的對照品溶液，備用。

供試品溶液：用純化水復(fù)溶Cur-PLA-NO，得質(zhì)量濃度為0.702 mg·mL-1的膠束溶液，精密量取膠束溶液0.1 mL，置于1 mL量瓶中，用甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，靜置，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得Cur-PLA-NO供試品溶液。

2.2.3線性關(guān)系與范圍 精密量取10 mL對照品溶液，依次用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg·mL-1的系列溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，按色譜條件依次進樣，記錄色譜峰面積。以峰面積(A)為縱坐標，對照品質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸。

2.3 星點設(shè)計優(yōu)化Cur-PLA-NO處方工藝及驗證

根據(jù)前期單因素實驗結(jié)果，選擇聚合物mPEG-PLA-NO投入量(x1, g)、乳化劑HS15投入量(x2, g)和制備溫度(x3, ℃)3個對膠束質(zhì)量濃度影響較大的因素，設(shè)計三因素三水平實驗方案，共進行17 次實驗。其中聚合物投入量、乳化劑投入量、制備溫度的優(yōu)化范圍分別為0.04～0.10 g、0.04～0.08 g、40～70 ℃。通過星點設(shè)計效應(yīng)面法篩選出最佳聚合物膠束的制備工藝，并按照最優(yōu)處方工藝條件制備Cur-PLA-NO，測定姜黃素質(zhì)量濃度，將實測值與預(yù)測值平行對比，計算兩者間的誤差。

2.4 包封率與載藥率的測定

用高效液相色譜法測定并計算Cur的包封率與載藥率。精密吸取膠束溶液400 μL，置于超濾離心管(相對分子質(zhì)量為3 kDa)中，4 ℃以14 000 r·min-1離心15 min，吸取離心液及未離心膠束，按照2.2.1項下色譜條件進行含量測定，計算Cur-PLA-NO的包封率(encapsulation efficiency, EE)與載藥率(drug loading, DL)。

DL=W負載÷(W負載+W膠束)×100%；

EE=W負載÷W總×100%。

W負載表示負載在膠束中姜黃素的質(zhì)量，W總表示未離心膠束姜黃素的質(zhì)量，W膠束表示膠束中聚合物的質(zhì)量。

2.5 平均粒徑和Zeta電位的測定

取適量2.2.2項下制備的Cur-PLA-NO溶液，用純化水稀釋至適宜質(zhì)量濃度，室溫下用粒徑分析儀測定粒徑及Zeta電位，每份樣品測定3次。

2.6 姜黃素體外釋放行為的研究

用PBS(pH 7.4)復(fù)溶Cur-PLA-NO至姜黃素質(zhì)量濃度為0.75 mg·mL-1，取1 mL置于透析袋(醋酸纖維素酯，相對分子質(zhì)量為300 kDa)中，以100 mL的1×PBS(室溫條件下質(zhì)量濃度10.5～11 mg·mL-1吐溫80和3.5 mmol·L-1的L-半胱氨酸)為溶出介質(zhì)[14]，通過流池法溶出度儀收集溶出液，用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定姜黃素含量，計算不同時間點Cur-PLA-NO中姜黃素的溶出百分率。

2.7 Cur-PLA-NO體外透過血腦屏障行為的研究

將bEnd.3細胞(2.25×105個·孔-1)接種于24孔Transwell 膜(0.4 μm，透孔聚酯膜)上，建立血腦屏障模型[15-16]。再用bEnd.3專用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，置于顯微鏡下觀察，待細胞呈鋪路石狀態(tài)后，用Millicell ERS-2伏特歐姆測定跨內(nèi)皮細胞電阻(TEER)，評價血腦屏障體外細胞模型的完整性。TEER大于200 Ω·cm2則認為細胞具有完整性，可用于進一步的滲透性測試[17]。

在Transwell 上室分別加入含有Cur溶液(質(zhì)量濃度30 μg·mL-1)、Cur-PLA-NO(質(zhì)量濃度30 μg·mL-1)的培養(yǎng)基，見圖1。下室加入新鮮培養(yǎng)基，孵育5 h 后，收集上層、細胞層和過濾層的溶液，用HPLC法測定3層中的含量。以此來判斷2種溶液的滲透性。

透過率=過濾層質(zhì)量濃度÷總質(zhì)量濃度×100%?？傎|(zhì)量濃度為上層溶液、細胞層溶液、過濾層溶液的總質(zhì)量濃度。

圖1 體外血腦屏障模型的構(gòu)建

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系與范圍

經(jīng)回歸得姜黃素的線性回歸方程為A=8×107C-181 908，R2=0.999 4。結(jié)果表明，姜黃素質(zhì)量濃度在0.012 5～0.8 mg·mL-1范圍內(nèi)時線性關(guān)系良好。

3.2 星點設(shè)計優(yōu)化Cur-PLA-NO處方工藝及驗證結(jié)果

3.2.1星點設(shè)計優(yōu)化Cur-PLA-NO處方 選擇中心點為5的Box-Behnken設(shè)計，共進行17次實驗，具體實驗安排及結(jié)果見表1。

表1 星點設(shè)計效應(yīng)面響應(yīng)法實驗安排及結(jié)果

3.2.3最佳工藝驗證 根據(jù)前期單因素考察結(jié)果，溫度設(shè)置在40～60 ℃，響應(yīng)值質(zhì)量濃度穩(wěn)定在0.18～0.79 mg·mL-1范圍內(nèi)有利于保持制劑的穩(wěn)定性。根據(jù)星點設(shè)計效應(yīng)面法得到Cur-PLA-NO最優(yōu)處方工藝：姜黃素、mPEG-PLA-NO及HS15的投入質(zhì)量比例為1∶20∶15，叔丁醇加入量為20%，以500 r·min-1，55 ℃恒溫磁力攪拌1 h，即得。在所選最佳處方工藝下，Cur-PLA-NO的載藥量為(0.702±0.08) mg·mL-1；平均粒徑為(26.41±0.35) nm，PDI為0.231±0.005，Zeta電位為(-13.25±0.35) mV。見表3和圖3。實驗結(jié)果表明，預(yù)測值與實測值的相對偏差為1.00%，表明該工藝準確可靠，重復(fù)性良好，經(jīng)星點設(shè)計實驗建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好。

表2 回歸模型的方差分析

圖2 3個因素對Cur-PLA-NO質(zhì)量濃度(y)的響應(yīng)面圖

表3 驗證及重復(fù)性結(jié)果

3.3 Cur-PLA-NO體外釋放行為的研究結(jié)果

實驗結(jié)果表明，Cur-PLA-NO溶液在60 h內(nèi)總釋放量僅為55.43%±0.006%，見圖4，表現(xiàn)出膠束的緩釋特性。采用OriginPro 2018C 軟件，對姜黃素體外釋放曲線進行擬合得方程，見表4。由表4可見，Cur-PLA-NO姜黃素體外釋放過程較符合一級動力學(xué)方程。

圖3 最優(yōu)處方驗證粒徑分布

圖4 在pH7.4條件下Cur-PLA-NO中姜黃素的釋放曲線 (n=3)

表4 姜黃素膠束的不同體外釋藥模型擬合方程

3.4 Cur-PLA-NO體外透過血腦屏障行為的結(jié)果

Cur-PLA-NO體外跨血腦屏障行為的結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，Cur-PLA-NO中Cur的血腦屏障透過率較Cur溶液更高，分別為42.2%±0.003%、27.5%±0.003%，表明水溶性差的藥物通過兩親性嵌段制備成小分子膠束后，能夠協(xié)助藥物透過血腦屏障。

注：與Cur組比較，**P<0.01。

4 討論

本實驗采用星點設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化Cur-PLA-NO膠束的處方及工藝，得到回歸模型，比較各因素的顯著性和各因素之間的交互作用，優(yōu)選出Cur-PLA-NO膠束制備處方工藝的最佳條件：姜黃素、mPEG-PLA-NO及HS15的投入質(zhì)量比為1∶20∶15，叔丁醇加入比例為20%，以500 r·min-1、55 ℃恒溫磁力攪拌1 h。在所選最佳處方、工藝下，Cur-PLA-NO的粒徑均勻、可控，為(26.41±0.35) nm，電位準確、穩(wěn)定，為(-13.25±0.35) mV，包封率和載藥量較高，分別為97.23%±0.17%、3.38%±0.05%，表明所建立的模型及所選工藝參數(shù)可靠，具有良好的預(yù)測性。

為了盡可能接近體內(nèi)生理條件，選用pH為7.4的PBS為溶出介質(zhì)，但Cur在弱堿性條件下易變性，導(dǎo)致溶解度降低[18]，在PBS中無法被檢測出來。研究表明，采用含吐溫80的PBS，能明顯改善Cur的溶解性與穩(wěn)定性[19-21]。Cur-PLA-NO累積釋放結(jié)果亦表明，Cur在40 h前釋放較快，此后釋放速率減慢直至60 h后基本保持不變，整個過程中未發(fā)生突釋現(xiàn)象，可能歸因于聚合物膠束的核殼結(jié)構(gòu)。表明Cur-PLA-NO雖然不能保持恒定的釋放速率，但符合一級動力學(xué)模型的要求，以相關(guān)系數(shù)為判斷依據(jù)，具有從快速到緩慢釋放的變化[22]。

血腦屏障是主要由腦微血管內(nèi)皮細胞構(gòu)建的屏障，可防止大分子進入大腦[23]。2種溶液的血腦屏障透過率結(jié)果表明，Cur溶液能夠透過體外血腦屏障，這可以解釋為Cur本身是脂溶性很強的小分子(油水分配系數(shù)lgP4.16[24]，lgP越高，血腦屏障滲透率越高)。而將其封裝在mPEG-PLA-NO中后，Cur-PLA-NO中Cur的血腦屏障透過率更高，約是Cur溶液的1.5倍，可能是由于分子體積占據(jù)主導(dǎo)作用，顯著增加了Cur的血腦屏障透過率，且mPEG-PLA嵌段上增加的呋咱環(huán)型NO供體化合物，改變了共聚物嵌段的化學(xué)組成、長度與親脂性，表現(xiàn)為與小鼠腦內(nèi)皮細胞更加活躍的積極作用，同時Cur-PLA-NO表面帶有的負電荷與血清蛋白互相排斥，這都有利于Cur-PLA-NO透過血腦屏障進入腦部發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本實驗采用星點設(shè)計效應(yīng)面法對Cur-PLA-NO的制備處方工藝進行了優(yōu)化，最終確定的最佳制備條件具有耗時短、包封率高及易產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點。同時通過體外血腦屏障模型證明了Cur-PLA-NO的構(gòu)建能顯著提高Cur的血腦屏障透過率，為深入研究Cur-PLA-NO的體內(nèi)生物性能奠定了基礎(chǔ)。