高睿騏，趙鳳瓊，楊莉，龔波

白內(nèi)障是指由各種病因引起的晶狀體混濁，是導(dǎo)致失明的主要原因，患者的視力和生活質(zhì)量可能會(huì)嚴(yán)重受損[1]。目前白內(nèi)障的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是外科手術(shù)，即摘除不透明的晶狀體，代之以人工晶體，但仍有許多患者不適用手術(shù)。因此，需要開發(fā)一種非手術(shù)干預(yù)方法，預(yù)防或延遲白內(nèi)障的發(fā)生。亞硒酸鈉白內(nèi)障模型是研究年齡相關(guān)性核性白內(nèi)障的一種快速、清晰、穩(wěn)定的嚙齒動(dòng)物模型，可模擬人類白內(nèi)障的反應(yīng)[2-3]。因此，亞硒酸鈉誘導(dǎo)的白內(nèi)障動(dòng)物模型廣泛用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中，以篩選和評(píng)估抗白內(nèi)障藥物的治療潛力。雖然白內(nèi)障的形成機(jī)制尚不完全清楚，但年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成與自由基相關(guān)的氧化應(yīng)激有關(guān)[4]。許多研究[5-6]表明，抗氧化劑的補(bǔ)充可以成功預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)的白內(nèi)障形成。芒果苷（mangiferin）是從芒果的葉子、樹皮、果皮和根中提取的天然多酚化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究[7]已發(fā)現(xiàn)，芒果苷具有多種藥理學(xué)作用，主要有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等。根據(jù)芒果苷具有的優(yōu)異生物活性，本研究探討補(bǔ)充芒果苷對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)的大鼠白內(nèi)障的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只新生9 d 齡的Wistar 大鼠購(gòu)自山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司[許可證號(hào)：SCXK（魯）2021-0003]。在實(shí)驗(yàn)期間，將大鼠飼養(yǎng)于室溫下，分別給予光照和黑暗12 h，自由獲得食物和水。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定，由都江堰市人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理審查委員會(huì)獲批（倫理審批號(hào)：JLZYLL201832）。

1.2 藥品、試劑與儀器

芒果苷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，M114062），亞硒酸鈉（美國(guó)Sigma 公司，214485），還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，E-EL-0060c、E-EL-0026c），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，A53225、BMS2279）。

酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek 公司，EON），分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin Elmer 公司，AA-3100），高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司，3K15）。

1.3 建立大鼠亞硒酸鈉白內(nèi)障模型

將30只大鼠以2.46 mg/kg的劑量一次性皮下注射亞硒酸鈉構(gòu)建大鼠白內(nèi)障模型，另將10只大鼠皮下注射等量0.9%氯化鈉注射液。根據(jù)晶狀體混濁程度判斷造模的效果。

1.4 分組與給藥

造模成功的大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組（model group，MG）、芒果苷低劑量組（lowdose mangiferin group，L-MAN）及芒果苷高劑量組（high-dose mangiferin group，H-MAN），每組10 只。另將腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液的10 只大鼠設(shè)置為對(duì)照組（control group，CG）。L-MAN 與HMAN 組大鼠在造模1 h后，進(jìn)行芒果苷腹腔注射，劑量分別為10 mg/kg 與40 mg/kg，CG、MG 組腹腔注射同體積0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)7 d。21 d 后，檢查大鼠白內(nèi)障的發(fā)生情況，并根據(jù)其混濁程度進(jìn)行分級(jí)。

1.5 白內(nèi)障形成評(píng)價(jià)

用0.5%托吡卡胺滴眼液和2.5%去氧腎上腺素注射液散大瞳孔，由眼科醫(yī)生確定白內(nèi)障分級(jí)。白內(nèi)障分為0～6 級(jí)[8]，0級(jí)為正常透明晶狀體；1級(jí)為晶狀體后囊膜下或囊膜混濁的初始征象；2 級(jí)為囊膜混濁，后囊膜下纖維腫脹或散在病灶；3 級(jí)為彌漫性囊膜混濁伴皮質(zhì)散射；4 級(jí)為部分囊膜混濁；5 級(jí)為未累及晶狀體皮質(zhì)的囊膜混濁；6 級(jí)為整個(gè)晶狀體成熟致密混濁。晶狀體混濁評(píng)分（0～6 分）為相對(duì)應(yīng)的等級(jí)，由2 名對(duì)分組不知情的熟練實(shí)驗(yàn)操作者進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6 樣本采集

麻醉后引頸處死大鼠，迅速摘除眼球，取出晶狀體，再次評(píng)估各組大鼠晶狀體混濁程度，于液氮速凍后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 晶狀體總水溶性蛋白濃度測(cè)定

使用玻璃勻漿器處理大鼠晶狀體，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，使用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定晶狀體總水溶性蛋白濃度，酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處吸光度值。

1.8 ELISA法測(cè)定大鼠晶狀體GSH、MDA水平

取冷凍磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶液（PH 7.2）50 mL，稱取晶狀體勻漿，以1∶10 的比例混合，在4℃12,000 rpm 離心15 min。取上清液，使用MDA 試劑盒，ELISA 法測(cè)定MDA、GSH含量，所有操作步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.9 大鼠晶狀體鈣離子濃度測(cè)定

晶狀體樣本在100℃加熱12 h 后，測(cè)量晶狀體的干重。在室溫下用0.2 mL 的36%濃鹽酸消化晶狀體過(guò)夜，加入去離子水至1.0 mL。在12,000 rpm離心12 min 以除去不溶性物質(zhì)。用分光光度計(jì)測(cè)定上清液鈣濃度，設(shè)置狹縫寬度為0.5 nm，波長(zhǎng)為422 nm。使用碳酸鈣和去離子水制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度根據(jù)相應(yīng)數(shù)值進(jìn)行換算校正。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芒果苷對(duì)大鼠白內(nèi)障形成的影響

CG 組中所有大鼠的晶狀體均清晰，MG 組所有大鼠均出現(xiàn)中度至重度白內(nèi)障，分級(jí)為4～6級(jí)，提示成功建立了亞硒酸鈉白內(nèi)障大鼠模型；L-MAN組大鼠有輕度到中度白內(nèi)障，分級(jí)為2～4 級(jí)；H-MAN 組中10 只大鼠中有8 只大鼠晶狀體透明。4 組間大鼠晶狀體混濁評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=255.308，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，MG 組晶狀體混濁評(píng)分升高（t=22.136，P=0.000）；與MG 組比較，L-MAN、H-MAN 大鼠晶狀體混濁評(píng)分降低（tL-MAN=4.833，tH-MAN=7.691，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1、表1）。

圖1 芒果苷對(duì)白內(nèi)障形成的影響

2.2 芒果苷對(duì)大鼠晶狀體鈣離子濃度的影響

4 組間大鼠晶狀體鈣離子濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=187.259，P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG 組大鼠晶狀體鈣離子濃度升高（t=22.046，P=0.000）；與MG 組比較，L-MAN、H-MAN組大鼠晶狀體鈣離子濃度降低（tL-MAN=13.706，tH-MAN=16.982，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.3 芒果苷對(duì)大鼠晶狀體總水溶性蛋白的影響

4 組間大鼠晶狀體總水溶性蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.838，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，MG 組的大鼠晶狀體總水溶性蛋白水平降低（t=8.741，P=0.000）；MG 組比較，L-MAN、HMAN 組大鼠晶狀體總水溶性蛋白水平升高（tL-MAN=3.061，P=0.007；tH-MAN=9.742，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 芒果苷對(duì)大鼠晶狀體白內(nèi)障的影響（±s，n=10）

表1 芒果苷對(duì)大鼠晶狀體白內(nèi)障的影響（±s，n=10）

注：#與CG 組比較，P＜0.05；*與MG 組比較，P＜0.05；CG 對(duì)照組；MG 模型組；L-MAN 芒果苷低劑量組；L-MAN 芒果苷高劑量組；MDA 丙二醛；GSH 還原型谷胱甘肽

2.4 芒果苷對(duì)大鼠晶狀體氧化應(yīng)激的影響

4組間大鼠晶狀體MDA、GSH水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FMDA=593.824，F(xiàn)GSH=271.496，均P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG組大鼠晶狀體MDA 水平升高（t=31.917，P=0.000），GSH 水平降低（t=27.540，P=0.000）；與MG 組比較，L-MAN、HMAN 組大鼠晶狀體MDA 水平降低（tL-MAN=11.988，tH-MAN=20.427，均P=0.000），GSH 升高（tL-MAN=9.229，tH-MAN=33.772，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

3 討論

白內(nèi)障是一種由各種病因引起的晶狀體混濁，是導(dǎo)致失明的主要原因。亞硒酸鈉白內(nèi)障模型是模擬年齡相關(guān)性核性白內(nèi)障最常用的動(dòng)物模型[2-3]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，向出生9 d 的大鼠一次性皮下注射過(guò)量的亞硒酸鈉，在出生第30 d 觀察到MG 組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的雙側(cè)核性白內(nèi)障，而給予芒果苷治療的大鼠白內(nèi)障程度得到了不同程度的改善。

鈣穩(wěn)態(tài)對(duì)晶狀體的維持透明度至關(guān)重要[9]。鈣離子-腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶被認(rèn)為在晶狀體鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用，使鈣水平保持在亞微摩爾范圍內(nèi)，而在白內(nèi)障形成中晶狀體鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生了改變[10]。在本研究可以觀察到，CG 組鈣離子含量極低，而MG 組的晶狀體鈣離子含量增高，與上述觀點(diǎn)相符。在使用芒果苷治療組中，大鼠晶狀體中鈣離子水平下降，結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果，推測(cè)芒果苷可能通過(guò)降低鈣離子水平，抑制白內(nèi)障形成。

晶狀體蛋白是保持晶狀體透明的基礎(chǔ)，根據(jù)溶解性不同，可分為水溶性、不溶性蛋白，其中水溶性蛋白約占90%。水溶性蛋白分子包括α、β、γ的3種類型，分子結(jié)構(gòu)都含有數(shù)目不等的巰基，易被氧化成不溶性蛋白質(zhì)，形成非均勻介質(zhì)的增多。晶狀體中水溶性蛋白減少，不溶性晶狀體蛋白增加，使晶體透光性、折射能力受到影響，是白內(nèi)障發(fā)病的物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。本研究結(jié)果中，使用強(qiáng)氧化劑亞硒酸鈉，觀察到MG 組的晶狀體總水溶性蛋白減少，結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查中觀察到的不溶性蛋白增加，表明結(jié)果與前述觀點(diǎn)保持一致。而使用芒果苷治療后，晶狀體總水溶性蛋白增加，推測(cè)芒果苷可能通過(guò)抑制亞硒酸鈉導(dǎo)致的水溶性蛋白的減少，達(dá)到改善白內(nèi)障的效果。

年齡相關(guān)性白內(nèi)障的形成與自由基相關(guān)的氧化應(yīng)激有關(guān)[4]。健康的晶狀體含有GSH，GSH 通過(guò)直接清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）來(lái)維持蛋白質(zhì)巰基的主要因子，保護(hù)細(xì)胞成分免受氧化應(yīng)激損傷。而老化的晶狀體GSH 減少，抗氧化活性能力下降，ROS 水平升高，過(guò)量的自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，導(dǎo)致晶狀體混濁，最終形成白內(nèi)障[12-13]。本研究結(jié)果顯示，亞硒酸鈉誘導(dǎo)形成的大鼠白內(nèi)障晶狀體中，MDA 水平升高，GSH 減少，與SUN Y 等[4]的結(jié)果一致，表明白內(nèi)障的形成與氧化應(yīng)激相關(guān)。研究[7]表明，芒果苷具有抗氧化應(yīng)激等多種藥理學(xué)作用。DING L 等[14]的研究結(jié)果證明，芒果苷通過(guò)激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP2）/Smad核相互作用蛋白（Smad nuclear interacting protein1，SNIP1）信號(hào)通路來(lái)保護(hù)MC3T3-E1細(xì)胞免受右旋美托咪啶（dexmedetomidine，Dex）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。HUANG J 等[15]的研究表明，芒果苷改善了子癇前期小鼠的胎盤氧化應(yīng)激并激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用芒果苷治療后，大鼠晶狀體中GSH 水平增加，MDA 水平下降。亞硒酸鈉加速了晶狀體GSH 的消耗，進(jìn)而增加了晶狀體損傷，表現(xiàn)為是脂質(zhì)過(guò)氧化速率的增加[16]。而芒果苷抑制了由亞硒酸鈉引起的GSH 消耗以及MDA 產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，芒果苷減少亞硒酸鈉誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而減少晶狀體總水溶性蛋白的氧化，改善白內(nèi)障的形成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了芒果苷對(duì)亞硒酸鈉所致的大鼠白內(nèi)障具有一定的治療作用，其機(jī)制可能是通過(guò)維持鈣穩(wěn)態(tài)、抑制亞硒酸鈉導(dǎo)致的氧化應(yīng)激對(duì)水溶性蛋白的氧化，減少不溶性蛋白的生成，從而實(shí)現(xiàn)改善大鼠白內(nèi)障的療效，本研究可為白內(nèi)障治療提供新思路。