劉 倩 李亞梅 王文第 王燕俠 毛寶宏 （甘肅省婦幼保健院科研中心，蘭州 730050）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠28 周前發(fā)生至少3 次自然流產(chǎn)，發(fā)生于約1%~5%育齡期女性［1］。RSA 發(fā)病除與多種因素（如內(nèi)分泌、染色體、解剖和免疫等異常）有關(guān)外，仍有50%患者發(fā)病原因未知，稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［2］。成功妊娠取決于孕婦免疫狀況和對胎兒的免疫調(diào)節(jié)能力［3］。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 主要由有免疫抑制作用的Treg 表達(dá)，Treg 通過接觸性抑制或產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子在維持母體對胎兒的免疫耐受性中起重要作用，而Treg 的誘導(dǎo)和作用發(fā)揮需要Foxp3基因穩(wěn)定、持續(xù)和高表達(dá)［4］。研究表明，URSA患者蛻膜和外周血中Treg 水平降低，導(dǎo)致Foxp3 表達(dá)減少，并降低Treg 的抑制能力，且Foxp3 基因多態(tài)性可通過影響其功能進(jìn)而影響Treg 形成［5-6］。因此，推測Foxp3 基因的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）可能是URSA的易感基因。鑒于轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 在免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，以及不同種族基因型和等位基因頻率存在差異，本研究評估了甘肅地區(qū)女性Foxp3 基因多態(tài)性及其與URSA的相關(guān)性，以期從分子水平研究URSA的發(fā)病機(jī)制，為其治療提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 收集2019 年1 月至2020 年8 月在甘肅省婦幼保健院就診的至少有過3次流產(chǎn)史的甘肅籍婦女150 例作為URSA 組，URSA 診斷參考2016 年我國“復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識”，且經(jīng)臨床明確診斷［1］。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠28 周前發(fā)生至少3次自然流產(chǎn)；②夫妻雙方染色體正常；③生殖器解剖學(xué)正常；④內(nèi)分泌功能正常；⑤無血栓前狀態(tài)、低纖維蛋白血癥及血小板增多癥；⑥ACA、β2球蛋白、抗甲狀腺抗體等自身抗體陰性；⑦無乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒等傳染性疾病；⑧無宮外孕、生化妊娠、計劃流產(chǎn)、意外流產(chǎn)等妊娠史。對照組為同一時段于甘肅省婦幼保健院健康管理中心進(jìn)行健康體檢的甘肅籍女性150 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往無自然流產(chǎn)、宮內(nèi)生長遲緩及胎兒先天缺陷等不良孕產(chǎn)史；②至少有過1次正常生育史。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有高血壓、糖尿病、內(nèi)分泌、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、免疫異常等全身性或基礎(chǔ)性疾病。所有研究對象知情同意。本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)，并符合《赫爾辛基宣言》。兩組年齡、BMI、民族、吸煙史、飲酒史差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），兩組文化程度和家庭月收入差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，表1）。

表1 URSA組和對照組女性人口學(xué)和臨床特征Tab.1 Demographic and clinical characteristics of URSA group and control group

1.1.2 主要試劑與儀器 血液基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生物有限公司）；HotStarTaq（Qiagen公司）；蝦堿酶（SAP，Promega 公司）；外切酶Ⅰ（EXOⅠ，Epicentre 公司）；SNaPshot Multiplex kit（ABI 公司）；分光光度計Nanodrop ND-2000（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采集研究對象外周靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管，按血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，采用分光光度計檢測DNA濃度和純度。

1.2.2 SNaPshot SNP 分型技術(shù)進(jìn)行基因分型 采用在線Primer3 軟件設(shè)計引物（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）并由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及長度見表2。PCR 反應(yīng)體系（20 μl）：去離子水5 μl、2× GC-Ⅰbuffer 10 μl、

表2 Foxp3基因3個位點相應(yīng)的PCR引物序列和產(chǎn)物長度Tab.2 Primers and PCR products length at three loci of Foxp3 gene

3.0 mmol/L Mg2+0.4 μl、0.3 mmol/L dNTP 2.4 μl、1 U HotStarTaq polymerase 0.2 μl、樣本DNA 1 μl 和多重PCR 引物1μl。PCR 產(chǎn)物采用HotStarTaq 進(jìn)行多重PCR，經(jīng)SAP 和EXOⅠ純化后采用SNaPshot Multiplex kit 進(jìn)行延伸，延伸反應(yīng)體系（10 μl）：5 μl SNaPshot Multiplex Kit、2 μl 純化后多重PCR 產(chǎn)物、1μl 延伸引物混合物、2μl 超純水，延伸產(chǎn)物SAP 純化后采用ABI3730xl 測序儀測序，GeneMapper4.1 軟件分析SNP分型結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 對照組Foxp3 基因rs2232365、rs2280883 和rs3761548 位點基因型分布采用Hardy-Weinberg（HWE）平衡進(jìn)行檢驗。組間基因型和等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗，基因型與RSA 的相關(guān)性采用優(yōu)勢比（odd ratio，OR）及95%CI表示，采用SPSS26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。連鎖程度較高的位點采用SHEsis 軟件進(jìn)行單倍型構(gòu)建和在線分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxp3 基因3 個SNPs 位點基因分型結(jié)果 HWE 平衡分析結(jié)果顯示，對照組Foxp3 基因3 個SNPs 位點的基因型分布符合HWE 平衡（P>0.05），提示研究對象具有群體遺傳代表性。URSA 組Foxp3 基因rs2232365 位點TT 基因型分布頻率為38.0%，TC基因型為48.0%，CC基因型為14.0%，對照組rs2232365 位點TT 基因型分布頻率為35.3%，TC 基因型為49.3%，CC 基因型為15.3%。URSA 組rs2280883 位點TT、TC、CC 基因型分布頻率分別為61.3%、34.0%和4.7%，對照組分布頻率分別為60.7%、34.0%和5.3%。URSA 組rs3761548 位點TT、GT、GG 基因型分布頻率分別為4.0%、34.7%和61.3%，對照組分布頻率分別為5.3%、33.3%和61.3%。URSA 組和對照組Foxp3 基因3 個SNPs 位點基因型分布頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表3）。

表3 Foxp3基因多態(tài)性和URSA發(fā)病的相關(guān)性［例（%），n=150］Tab.3 Association between Foxp3 gene polymorphism and risk of URSA［n（%），n=150］

2.2 不同遺傳模式下Foxp3 基因3 個SNPs 位點基因分型結(jié)果 等位基因、顯性和隱性3 種基因遺傳模式下，兩組Foxp3 基因rs2232365、rs2280883 和rs3761548 位點等位基因和基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表4）。

表4 不同遺傳模式下Foxp3基因多態(tài)性與URSA發(fā)病的相關(guān)性Tab.4 Association between Foxp3 gene polymorphism and risk of URSA under different inheritance models

2.3 單倍型分析 Foxp3基因3個SNP 位點的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）分析結(jié)果如圖1所示，rs2280883 和rs3761548 兩個位點存在連鎖不平衡（r2=0.981，D'=1）。推測最常見的單倍型共3 種：TTG>CCT>CTG，統(tǒng)計分析顯示，URSA 組和對照組3種單倍型分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，表5）。

圖1 甘肅地區(qū)人群中Foxp3基因3個SNPs的LD圖Fig.1 LD of Foxp3 gene 3 SNPs in Gansu population

表5 Foxp3基因單倍型與URSA發(fā)病的相關(guān)性Tab.5 Foxp3 haplotype frequencies and their associa?tions with risk of URSA

3 討論

母體免疫系統(tǒng)在維持整個正常妊娠過程中起重要作用，促炎和抗炎細(xì)胞因子平衡可影響RSA 易感性。成功妊娠由具有免疫抑制作用的Treg 和具有抗炎作用的Th2 型細(xì)胞因子共同主導(dǎo)，而促進(jìn)胚胎著床和維持的Th1 型細(xì)胞因子促炎作用減弱［7］。Foxp3 是Treg 發(fā)育和發(fā)揮功能的重要轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxp3基因缺失或蛋白表達(dá)缺陷可影響Treg功能［8］。既往研究顯示，F(xiàn)oxp3 基因多態(tài)性與多種炎癥和自身免疫性疾病有關(guān)，如多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［9-10］。本研究主要從Foxp3基因多態(tài)性與URSA的相關(guān)性方面展開，以期為臨床從分子學(xué)水平尋找URSA的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

本研究對兩組基本資料統(tǒng)計分析顯示，URSA組和對照組文化程度和家庭月收入差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明文化程度與家庭收入對URSA 發(fā)生有影響，尚需進(jìn)一步研究確定其具體相關(guān)性。HE 等［11］研究顯示，較低的教育水平與較高的抑郁和焦慮風(fēng)險顯著相關(guān)，可能由于文化程度較低的RSA 患者意識不到自己的疾病，難以遵從醫(yī)囑維持治療。同時研究顯示，低收入女性的焦慮和抑郁得分較高，經(jīng)濟(jì)壓力可能通過內(nèi)分泌系統(tǒng)（如促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素）等機(jī)制與不良妊娠結(jié)局相關(guān)［12］。

本研究顯示，URSA 和對照組Foxp3 基因3 個多態(tài)性位點（rs2232365、rs2280883 和rs3761548）等位基因和基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示這3 個位點多態(tài)性可能與甘肅地區(qū)女性URSA 發(fā)病無關(guān)。吳再歸等［13］部分研究結(jié)果與本研究相悖，其研究表明rs3761548 位點攜帶A 等位基因和A/A 基因型的患者比C/C 基因型URSA 發(fā)生風(fēng)險明顯增加（OR=1.73、2.98），且rs2232365 位點G 等位基因明顯增加URSA 發(fā)病風(fēng)險（OR=1.61）。而FAN 等［14］對Foxp3 基因這3 個多態(tài)性位點研究結(jié)果表明，rs2232365 位點攜帶G 等位基因發(fā)病風(fēng)險高于A 等位基因，關(guān)于rs2280883 和rs3761548 多態(tài)性位點與RSA 發(fā)病的相關(guān)性，其結(jié)論與本研究一致，均顯示可能不相關(guān)。提示中國人群存在遺傳異質(zhì)性，可能由于納入人群具有種族差異導(dǎo)致。

Foxp3 基因于2001 年被鑒定為Scurfy 小鼠的致病基因，小鼠X 染色體該基因突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的系統(tǒng)性自身免疫性炎癥性疾病［15］。人類Foxp3 基因突變則引起X 染色體連鎖的先天性免疫缺陷綜合征（簡稱IPEX）［16］。人類Foxp3 基因全長為1 296 bp，且由11 個不同的外顯子組成，位于X 染色體小臂（Xp11.23）［17］。rs2232365 和rs3761548 這兩個多態(tài)性位點位于Foxp3 基因啟動子區(qū)，可通過結(jié)合特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點改變基因表達(dá)并進(jìn)而改變轉(zhuǎn)錄起始動力學(xué)［18］。rs3761548多態(tài)性位點的AA基因型可導(dǎo)致與某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合失活，如E47 和C-Myb，使Foxp3 轉(zhuǎn)錄缺陷表達(dá)降低，功能性CD4+CD25+Tregs 缺乏或功能異常，使母胎免疫耐受失衡而發(fā)生RSA［19］。同時研究顯示，rs2232365 位點A 等位基因可與轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 結(jié)合，促進(jìn)體內(nèi)表達(dá)Foxp3 的T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th2 細(xì)胞，破壞母胎間Th1/Th2平衡導(dǎo)致流產(chǎn)［20］。rs2280883多態(tài)性位點位于Foxp3 基因的9 位內(nèi)含子區(qū)，ANDRé 等［21］分析結(jié)果顯示，rs2280883 基因多態(tài)性與特發(fā)性不孕癥有關(guān)。有研究認(rèn)為位于Foxp3 內(nèi)含子區(qū)的突變SNP（如rs2280883）可通過生成替代剪接位點和改變RNA 加工處理過程影響Foxp3 的作用，進(jìn)一步引發(fā)流產(chǎn)［22］。

Foxp3 基因多態(tài)性可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失衡并在臨床上介導(dǎo)URSA 發(fā)生，對這些多態(tài)性的研究可能有助于更好地了解其發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展。本研究顯示，F(xiàn)oxp3 基因rs2232365、rs2280883 和rs3761548 位點多態(tài)性可能與甘肅人群URSA 發(fā)病無關(guān)，但本研究樣本量較少，且同時納入了漢族和少數(shù)民族人群，有必要擴(kuò)大樣本量針對不同種族開展高質(zhì)量研究進(jìn)一步驗證。