楊海樂，張 輝，杜 浩

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223)

1 eDNA及其應(yīng)用領(lǐng)域

eDNA (environmental DNA)是指從環(huán)境樣品(水體、土壤、沉積物、空氣、混合物等)中提取的DNA，是各種生物的DNA混合物，區(qū)別于傳統(tǒng)從單物種樣品中提取的DNA[1-2]。eDNA包括來自活的細(xì)胞和生物的胞內(nèi)DNA，以及來自自然死亡細(xì)胞及細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎后所釋放出來的胞外DNA[1]。

eDNA的應(yīng)用最早可追溯到1987年對沉積物中微生物的研究[3]，但正式興起則要到2000年之后[1]。應(yīng)用eDNA的研究早期主要針對微生物類群，擴(kuò)展到其它生物類群(比如動物)則要略晚幾年[4]，隨著二代測序(next-generation sequencing)和DNA (meta)barcoding技術(shù)的發(fā)展，生態(tài)學(xué)中應(yīng)用eDNA的研究逐漸增多[1,5]，近年來eDNA的應(yīng)用更是在微生物生態(tài)學(xué)[6-8]、生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)學(xué)[9]、古生態(tài)學(xué)[10-11]、保護(hù)生物學(xué)[12]、入侵生物學(xué)[13]、特定類群監(jiān)測[14-15]、生物多樣性監(jiān)測[16-19]等各個研究領(lǐng)域中快速發(fā)展[20-21]，樣品類型覆蓋土壤[8,22]、水體[6,22]、沉積物[10-11]、氣溶膠及碎屑浮塵[23-24]、動物糞便[25-26]、動物腸道[27-30]、動植物體表[27-28,30]等，目標(biāo)類群涉及微生物[6-8,27,29]、浮游生物[31-32]、真菌[33-34]、植物[35]、低等無脊椎動物[14,19]、軟體動物[36-37]、節(jié)肢動物[38]、魚類[39-41]、兩棲爬行類[41-42]、鳥類[23-24]、哺乳類[15,18]等幾乎所有生物類群(表1)。

表1 eDNA應(yīng)用概述Tab.1 Summary of the eDNA usage in different study fields, samples and taxonomies

eDNA在各研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，核心一環(huán)是利用eDNA對相關(guān)生物類群實(shí)現(xiàn)信息監(jiān)測檢出及其相對豐度的定量[12-13,16,43-44]。eDNA作為標(biāo)識特定生物存在與否及其相對豐度的指征信號，可以在兩個維度發(fā)揮功能：1)指征DNA來源物種本身的存在及其相對豐度，2)指征DNA來源物種緊密相關(guān)的其它物種或生態(tài)環(huán)境狀況[45]。

2 eDNA監(jiān)測技術(shù)發(fā)展的4個階段

eDNA監(jiān)測技術(shù)的發(fā)展可劃分為技術(shù)探索、技術(shù)驗(yàn)證、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化、技術(shù)常態(tài)化應(yīng)用4個階段(圖1)。第一次利用沉積物中的eDNA開展微生物研究[3]，開啟了eDNA監(jiān)測的技術(shù)探索階段；二代測序和DNA (meta)barcoding技術(shù)的成熟實(shí)現(xiàn)了eDNA監(jiān)測技術(shù)可用[5]，開啟了eDNA監(jiān)測的技術(shù)驗(yàn)證階段，推動了eDNA監(jiān)測在各領(lǐng)域研究中驗(yàn)證性應(yīng)用(表2)[18-19,23,43,46-47]；隨著eDNA監(jiān)測可行性在各領(lǐng)域研究中獲得驗(yàn)證，同時也認(rèn)識到eDNA監(jiān)測結(jié)果受各種因素影響[48-50]，為了夯實(shí)基于eDNA監(jiān)測的研究結(jié)果的有效性，開始研究eDNA監(jiān)測的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[22,40,51]、呼吁eDNA監(jiān)測的規(guī)范化[52-53]、嘗試為eDNA監(jiān)測制定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[54-55]，開啟了eDNA監(jiān)測的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化階段；經(jīng)過技術(shù)發(fā)展和知識積累，在eDNA監(jiān)測完成技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后，eDNA監(jiān)測將進(jìn)入諸多學(xué)者所預(yù)期的技術(shù)常態(tài)化應(yīng)用階段[10,13,16-17]。

圖1 eDNA監(jiān)測的4個發(fā)展階段Fig.1 Four development stages of eDNA monitoring

表2 eDNA監(jiān)測在各領(lǐng)域研究中的驗(yàn)證性應(yīng)用Tab.2 The test of eDNA monitoring in different study fields

就當(dāng)前來看，基于eDNA監(jiān)測的研究整體上處于技術(shù)驗(yàn)證向技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化過渡的階段。當(dāng)前基于eDNA監(jiān)測的研究多屬于技術(shù)驗(yàn)證的研究[18,56-59]，只有少部分可歸類為技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)積累的研究[22,40,60]。鑒于eDNA監(jiān)測技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)非接觸、無損傷、高靈敏度、低人力物力時間成本消耗的多物種(或高級分類單元)監(jiān)測的應(yīng)用優(yōu)勢[47,61-63]，可以預(yù)見未來數(shù)年內(nèi)，在一些當(dāng)前大家比較關(guān)注的問題上，技術(shù)和數(shù)據(jù)積累可能很快就能完成。近年來，國外[54-55]和國內(nèi)(1)http://www.chinacses.org/xw/gsgg/202205/t20220516_982140.shtml.陸續(xù)有eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化文件/手冊推出，其已經(jīng)集中關(guān)注了采樣點(diǎn)(河流、湖泊、庫塘等)選擇、樣品(水、沉積物、生物膜、混合生物樣等)采集與處理、eDNA提取、eDNA分析(擴(kuò)增、測序、注釋、統(tǒng)計(jì))等內(nèi)容。這些努力推動了eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)步，但在其所關(guān)注的內(nèi)容中還依然存在不少問題有待解決[51]，并且還有一部分問題未受到應(yīng)有的關(guān)注。也就是說，在一些未被關(guān)注問題的標(biāo)準(zhǔn)化研究和數(shù)據(jù)積累上，或有可能掉隊(duì)，進(jìn)而延誤整個技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)展。因此，構(gòu)建一個針對eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的系統(tǒng)性整體框架是非常必要的，將有助于推動eDNA監(jiān)測技術(shù)盡快發(fā)展到技術(shù)常態(tài)化應(yīng)用階段。

3 eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的系統(tǒng)性整體框架

針對eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的系統(tǒng)性整體框架的需求，本文借鑒文獻(xiàn)中所指出的eDNA監(jiān)測技術(shù)中可能面臨的一系列問題[12,17,48-50,52]，并對eDNA監(jiān)測技術(shù)流程進(jìn)行系統(tǒng)化梳理(圖2)，提出eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化中所需重點(diǎn)關(guān)注和解決的10個環(huán)節(jié)(圖1)：樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計(jì)、采樣時間設(shè)計(jì)、采樣點(diǎn)設(shè)計(jì)、采樣方法設(shè)計(jì)、樣品前處理、樣品保存、擴(kuò)增引物選擇、樣品提取-擴(kuò)增-測序-分析程序、序列比對注釋、監(jiān)測結(jié)果后評估，并就此進(jìn)行簡要說明和分析。

圖2 eDNA監(jiān)測技術(shù)流程Fig.2 Technological process of eDNA monitoring

該系統(tǒng)性整體框架主要針對基于eDNA metabarcoding技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測方法?；趀DNA監(jiān)測技術(shù)發(fā)展歷程和未來應(yīng)用圖景，我們判斷未來eDNA監(jiān)測技術(shù)發(fā)展應(yīng)用將是以基于eDNA metabarcoding的技術(shù)路徑為主，以非基于eDNA metabarcoding的技術(shù)路徑為輔，同時考慮到非基于eDNA metabarcoding的技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測技術(shù)流程比基于eDNA metabarcoding的技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測技術(shù)流程只在“擴(kuò)增引物選擇、樣品提取-擴(kuò)增-測序-分析程序、序列比對注釋”3個環(huán)節(jié)有差異或省略，所以本文著重闡述基于eDNA metabarcoding技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測方法的標(biāo)準(zhǔn)化框架，兼顧非基于eDNA metabarcoding技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測方法的標(biāo)準(zhǔn)化框架。

3.1 樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計(jì)

eDNA監(jiān)測樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計(jì)的核心是樣品重復(fù)數(shù)與目標(biāo)檢出度之間關(guān)系的測算。eDNA監(jiān)測屬于抽樣調(diào)查，抽樣重復(fù)數(shù)越多檢出的信息種類數(shù)也越多(同時，檢出的信息相對豐度結(jié)構(gòu)也越穩(wěn)定)，這種增加遵循物種積累曲線的對數(shù)增長基本規(guī)則，所以會存在一個樣品重復(fù)數(shù)和目標(biāo)檢出度之間的相對優(yōu)化的投入產(chǎn)出點(diǎn)[40]。比如，在長江武漢江段開展的魚類eDNA監(jiān)測中，10個重復(fù)可以實(shí)現(xiàn)近80%的魚類物種檢出度目標(biāo)，13個重復(fù)可以實(shí)現(xiàn)近90%的魚類物種檢出度目標(biāo)，17個重復(fù)可以實(shí)現(xiàn)近95%的魚類物種檢出度目標(biāo)[40]。在長江武漢江段開展的環(huán)境微生物eDNA監(jiān)測中，8個重復(fù)可以實(shí)現(xiàn)近80%的細(xì)菌物種檢出度目標(biāo)，17個重復(fù)可以實(shí)現(xiàn)近90%的細(xì)菌物種檢出度目標(biāo)，28個重復(fù)可以實(shí)現(xiàn)近95%的細(xì)菌物種檢出度目標(biāo)[29]。

樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計(jì)，主要是在一個相對狹小的時間和空間內(nèi)，通過對采樣時間和采樣空間的離散設(shè)計(jì)，以隨機(jī)抽樣假重復(fù)的方式采集一系列樣品，通過樣品的處理、測序、分析、注釋、物種積累曲線分析，計(jì)算最大可檢出物種數(shù)(operational taxonomic units，OTUs)的最優(yōu)估值，獲得樣品重復(fù)數(shù)和目標(biāo)檢出度之間的量化關(guān)系，然后根據(jù)一定的檢出度目標(biāo)，確定eDNA監(jiān)測所需的樣品重復(fù)數(shù)[40]。針對單物種監(jiān)測的樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計(jì)，可以根據(jù)一系列重復(fù)抽樣監(jiān)測中目標(biāo)物種群體的檢出頻次，進(jìn)行基于0/1隨機(jī)抽樣模型的概率計(jì)算來確定樣品重復(fù)數(shù)與目標(biāo)檢出度的關(guān)系。

樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)化原理簡單，只需要在各具體區(qū)域針對各具體目標(biāo)類群在各具體環(huán)境條件范圍內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)積累數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)參考庫，然后根據(jù)特定目標(biāo)檢出度確定樣品重復(fù)數(shù)，或者根據(jù)樣品重復(fù)數(shù)與目標(biāo)檢出度關(guān)系選取具有最優(yōu)投入產(chǎn)出的樣品重復(fù)數(shù)。

3.2 采樣時間設(shè)計(jì)

eDNA監(jiān)測采樣時間設(shè)計(jì)的核心是監(jiān)測時間有效度測算。因?yàn)閑DNA在環(huán)境中存在一定的持留時間[60,64]，所以eDNA監(jiān)測的采樣時間設(shè)計(jì)需要解決兩個問題：1)怎么避免前后兩次采樣監(jiān)測到的是同一批信號源，2)怎么避免出現(xiàn)大的監(jiān)測時域空缺，這需要對eDNA的監(jiān)測時間有效度進(jìn)行量化測算。

監(jiān)測時間有效度，指在監(jiān)測區(qū)域內(nèi)監(jiān)測目標(biāo)群體的eDNA降解至不可檢出的時間。不可檢出取決于兩個層面的因素：eDNA片段降解至短于監(jiān)測擴(kuò)增片段長度[65]，可檢出eDNA片段的濃度降解或稀釋至低于檢出限[66]。由于監(jiān)測時間有效度受eDNA初始片段長度、初始濃度、降解速率等的影響[60,64]，eDNA的釋放形態(tài)和釋放率存在較強(qiáng)的類群差異性[67]，eDNA降解速率受來源(生物類群)[67]、形式(胞內(nèi)胞外)[68]、初始濃度[69]、溫度[70-72]、賦存介質(zhì)[73]、BOD[69]、營養(yǎng)鹽組成與濃度[68,70]、pH[72,74]、紫外線[72]、葉綠素[69]、環(huán)境微生物[65]及胞外酶等因素影響[20,75]，監(jiān)測時間有效度呈現(xiàn)出物種差異性、類群差異性、季節(jié)差異性、環(huán)境特征差異性等特征[60,76]。

在陸地上和靜水水體中(以及其它的一些類似情況，比如附著于器物表面)，采樣時間設(shè)計(jì)主要是在一個具體環(huán)境條件下，對實(shí)際目標(biāo)生物類群密度條件下所產(chǎn)生的eDNA的降解過程進(jìn)行定量。因?yàn)閑DNA的降解存在指數(shù)降解的規(guī)律[20,69-70,77]，所以可以用半衰期來進(jìn)行定義[65]。因?yàn)樯飩€體所釋放的eDNA都是從大片段降解為小片段再降解為更小的片段，因而eDNA長片段的半衰期比短片段的半衰期更短[64-65,78]，用長片段引物比用短片段引物進(jìn)行eDNA監(jiān)測時的時間窗口更小。

在流水水體中和強(qiáng)烈受流域過程影響的陸地上(以及其它的一些類似情況，比如受空氣流動而傳播的氣溶膠和碎屑浮塵)，采樣時間的設(shè)計(jì)不僅僅需要考慮eDNA降解過程，還要考慮eDNA在水體、沉積物、土壤、空氣等采樣目標(biāo)介質(zhì)中的持留時間。在徑流、氣流的侵蝕、搬運(yùn)過程影響下，eDNA會在尚未完全降解的情況下被輸移到其它地方[79-82]，進(jìn)而導(dǎo)致原位事實(shí)上的eDNA不可檢出，因而這種情況下的采樣時間設(shè)計(jì)就要考慮eDNA持留時間這一參數(shù)，而非單純的降解過程。

采樣時間設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)化影響因素復(fù)雜，但針對常規(guī)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化方法簡單，只需要在各具體區(qū)域針對各具體目標(biāo)類群在各具體環(huán)境條件范圍內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)積累數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)參考庫，然后根據(jù)相應(yīng)監(jiān)測時間有效度確定監(jiān)測采樣時間間隔。

3.3 采樣點(diǎn)設(shè)計(jì)

eDNA監(jiān)測采樣點(diǎn)設(shè)計(jì)的核心是監(jiān)測空間有效度測算。因?yàn)閑DNA在環(huán)境中存在一定的持留時間[60,64]，受徑流、氣流、擴(kuò)散等的驅(qū)動以及動物攜帶傳播而存在一定的空間遷移[9,75,83]，所以eDNA監(jiān)測的采樣點(diǎn)設(shè)計(jì)需要解決兩個問題：1)怎么避免兩個采樣點(diǎn)監(jiān)測到的是同一個信號源，2)怎么避免出現(xiàn)監(jiān)測區(qū)域大的空間空缺，這需要對eDNA的監(jiān)測空間有效度進(jìn)行量化測算。

針對流水系統(tǒng)中的eDNA監(jiān)測，有學(xué)者提出用基于水文學(xué)模型，考慮eDNA降解速率以及各環(huán)境因子，通過模型模擬計(jì)算來設(shè)計(jì)eDNA監(jiān)測的最適采樣方案[84]。這屬于通過受控實(shí)驗(yàn)明晰環(huán)境因子對eDNA輸移、降解過程中各環(huán)節(jié)的影響[85-86]，再通過各環(huán)境因子的參數(shù)化、eDNA輸移降解過程各環(huán)境的模型化來實(shí)現(xiàn)對eDNA監(jiān)測的最適采樣方案設(shè)計(jì)的思路[75]。另外一個思路，即暫時先把eDNA產(chǎn)生、輸移、降解等的復(fù)雜過程(各物種的eDNA形成參數(shù)、各物種eDNA的降解速率參數(shù)、各環(huán)境要素對eDNA降解的影響參數(shù))打包成黑箱，接受不確定性、控制不確定性、量化不確定性，通過對eDNA輸入端和輸出端關(guān)聯(lián)性的量化分析，實(shí)現(xiàn)對eDNA監(jiān)測的最適采樣方案設(shè)計(jì)，這是我們所提出的流域生物信息流分析框架的處理問題方式[9,22]。由于該思路所需確定的背景變量少、所需預(yù)先開展的計(jì)算簡單，雖然精確度有所折損，但更適合大范圍推廣使用。

因?yàn)閑DNA的降解存在指數(shù)降解的規(guī)律[20,69-70,77]，在流水水體中eDNA的監(jiān)測空間有效度可以用無效生物信息流(用來標(biāo)記沒有生命活性的生物物質(zhì)，即來自自然死亡細(xì)胞及細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎后所釋放出來的胞外DNA)的半衰距離來量化[22]。因?yàn)橐蕾囉趀DNA的降解速率以及由徑流驅(qū)動的運(yùn)輸、吸附與沉積、再懸浮等過程[75,79-82]，其中eDNA的降解速率受來源(生物類群)[67]、形式(胞內(nèi)胞外)[68]、初始濃度[69]、溫度[70-72]、賦存介質(zhì)[73]、BOD[69]、營養(yǎng)鹽組成與濃度[68,70]、pH[72,74]、紫外線[72]、葉綠素[69]、環(huán)境微生物[65]及胞外酶等因素影響[20,75]，無效生物信息流半衰距離會呈現(xiàn)出物種差異性、類群差異性、季節(jié)差異性[22]，以及基于河流特征的區(qū)域性差異。比如，在青藏高原一個小型河流中，春季封凍期的細(xì)菌無效生物信息流半衰距離為1.5 km左右，秋季多云天的細(xì)菌無效生物信息流半衰距離為10.5 km左右，夏季降雨天的細(xì)菌無效生物信息流半衰距離為14.5 km左右，而夏季降雨天的真核生物無效生物信息流半衰距離為4.5 km左右[22]。因?yàn)闃悠分貜?fù)數(shù)對流域生物信息流的估算準(zhǔn)確度和精密度有影響[87]，所以采樣點(diǎn)設(shè)計(jì)需要基于具體樣品重復(fù)數(shù)所指向的目標(biāo)檢出度進(jìn)行，并通過后驗(yàn)概率檢驗(yàn)來對eDNA監(jiān)測空間有效度進(jìn)行評估。

在靜水水體中eDNA的監(jiān)測空間有效度往往依賴于水體內(nèi)監(jiān)測目標(biāo)類群的空間分布以及eDNA在水體中的擴(kuò)散方向和范圍，監(jiān)測空間有效度可以用eDNA空間分布差異度和eDNA矢量化有效擴(kuò)散距離來量化。比如，在不同規(guī)模(面積分別為3、122和4343 hm2)的湖泊中的eDNA監(jiān)測研究顯示，近岸水體eDNA樣品檢出的魚類物種數(shù)比湖中水體eDNA樣品檢出的魚類物種數(shù)和多樣性高，且大多數(shù)物種相同[88]。在海洋中的eDNA監(jiān)測研究顯示，受水體垂直分層和水生生物群落結(jié)構(gòu)的垂直分層影響，采樣點(diǎn)也需根據(jù)需要進(jìn)行分層設(shè)置[89]。

對陸地生物的eDNA監(jiān)測的采樣點(diǎn)設(shè)置，可以基于由陸地到水體的流域生物信息流的框架通過河流水體eDNA來監(jiān)測[9]，也可以比照靜水水體中eDNA監(jiān)測框架來開展，只是需要將eDNA在水體中的擴(kuò)散過程替換成陸地動物移動/攜帶擴(kuò)散和風(fēng)力驅(qū)動擴(kuò)散過程。比如，在青藏高原一個小流域中，離岸5 m內(nèi)的陸地土壤eDNA中檢出的細(xì)菌可以在河流水體中檢出的比例，在春季封凍期為16.6%，秋季多云天為48.1%，夏季降雨天為62.8%，真核生物的檢出普遍要低一些，夏季降雨天的真菌檢出比例為44.7%，后生動物的檢出比例為22.6%[22]。

對附著于器物或者生物個體(內(nèi))表面的eDNA監(jiān)測的采樣點(diǎn)設(shè)置，主要依賴于對所監(jiān)測目標(biāo)eDNA分布的預(yù)判，而這個目標(biāo)eDNA由監(jiān)測或研究目的所決定。比如監(jiān)測動物的腸道微生物，采樣點(diǎn)為動物腸道(有的會區(qū)分前腸、中腸、后腸)或者其所延伸的排泄物[25,27-30]；監(jiān)測動物的體表共生微生物，采樣點(diǎn)為動物皮膚或者特定器官/區(qū)域的外表皮[27-28]。

采樣點(diǎn)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化的影響因素復(fù)雜，對于存在明確eDNA空間輸移的情況，可以選擇黑箱處理方法，基于流域生物信息流分析框架，計(jì)算eDNA監(jiān)測的空間有效度，并對其進(jìn)行概率檢驗(yàn)；對于不存在明確eDNA空間輸移的情況，可以借鑒生態(tài)學(xué)中經(jīng)典的種-面積曲線思路，基于均勻采樣設(shè)計(jì)來量化采樣點(diǎn)間距或采樣數(shù)量與目標(biāo)檢出能力的關(guān)系。具體標(biāo)準(zhǔn)化工作只需要在各具體區(qū)域針對各具體目標(biāo)類群在各具體環(huán)境條件范圍內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)積累數(shù)據(jù)，建立標(biāo)準(zhǔn)參考庫，然后根據(jù)相應(yīng)監(jiān)測空間有效度確定監(jiān)測樣點(diǎn)。

3.4 采樣方法設(shè)計(jì)

對不同地區(qū)、對象、目的，eDNA監(jiān)測需要選取不同的樣品類型(水體、沉積物、土壤、動物糞便、大型昆蟲、物體表面附著物)或樣品類型組合。因?yàn)樯镌诜植紖^(qū)域內(nèi)不同樣品介質(zhì)中的eDNA存留會存在明顯差異，不同樣品介質(zhì)對不同的生物eDNA的持留方式、持留能力和持留時間也會存在明顯差異，環(huán)境條件也會對這兩類差異產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而導(dǎo)致不同樣品類型所保存的類群不一樣，或?qū)Ω黝惾旱母采w度不一樣，所以在相關(guān)監(jiān)測工作中，要注意選擇最適樣品類型(組合)進(jìn)行采樣。比如，一個對澳大利亞(印度洋和南大洋)和哈薩克斯坦(里海)港口的eDNA監(jiān)測研究顯示，來自表層水、沉積物、沉降盤、浮游拖網(wǎng)的eDNA樣品檢出的真核生物類群具有明顯分異，不同類型樣品eDNA監(jiān)測到的真核生物類群存在系統(tǒng)性互補(bǔ)[90]。在對西澳大利亞的高溫荒漠氣候的Pilbara和高溫地中海氣候的Swan海岸平原的陸生生物eDNA調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，食肉動物糞便eDNA樣品比土壤eDNA樣品能夠檢出更多的植物和無脊椎動物類群(科級別)[91]。沉積物中的eDNA降解速率比水體中的eDNA降解速率要慢、持留時間要長，同樣體積的樣品，沉積物中累積的eDNA濃度比水體的要高、時間跨度比水體的要長[73,92]，這可為不同監(jiān)測目標(biāo)下的樣品類型選擇提供參考。因?yàn)榈厣瞎?jié)肢動物留在植物葉面的eDNA容易受雨霧沖刷而下落[93]，所以林間節(jié)肢動物eDNA監(jiān)測建議采集植物冠/葉下的露水、雨水或者表層土壤樣品。

野外采樣量一方面取決于樣品類型和eDNA監(jiān)測目標(biāo)，另一方面取決于eDNA提取過程中樣品的最大使用量。當(dāng)前eDNA提取最常用的試劑盒法中，eDNA提取所使用的樣品量通常不超過1.5 mL。所以對于不需要預(yù)處理且能夠大量采集的沉積物樣品、土壤樣品等，可以用5 mL無菌離心管采集3～5 mL樣品[22]，根據(jù)需求可增加樣品重復(fù)數(shù)；對于不需要預(yù)處理但樣品較不易采集的生物腸道樣品、生物體表黏膜樣品、物體表面附著物樣品、氣體懸浮物沉降樣品等，可以用2 mL無菌離心管采集0.5～2 mL樣品[27,29]，根據(jù)需求可增加樣品重復(fù)數(shù)；對于需要通過抽濾來富集eDNA的水體樣品，目前多以1.5 L為量(不同研究不同標(biāo)準(zhǔn)對這一量的要求有所差異)，在不同水體狀況和孔徑濾膜條件下，抽濾完所有水樣可能需要使用多張(1～5)濾膜，多張濾膜在eDNA提取時可以作為一份樣品一次性提取[22,29]，根據(jù)需求可增加樣品重復(fù)數(shù)；對于需要通過抽濾來富集eDNA的氣溶膠及碎屑浮塵樣品，可以基于研究區(qū)域的空氣懸浮物狀況來確定抽濾空氣的時間(0.5～2 h)[23-24]，根據(jù)需求可增加樣品重復(fù)數(shù)。

不同樣品(樣品重復(fù))不要混樣。因?yàn)閑DNA監(jiān)測采樣的隨機(jī)抽樣特性以及eDNA在介質(zhì)中非均一分布特性，各樣品中所包含的各物種的eDNA豐度不一，豐度超過檢出閾值的物種大概率會被檢出，低于檢出閾值的大概率不會被檢出，所以各樣品中所檢出的群落結(jié)構(gòu)也不一，一個樣點(diǎn)所有樣品的檢出結(jié)果(在分析過程中)合并在一起可以更貼近事實(shí)地反映其群落結(jié)構(gòu)狀況；而不同樣品進(jìn)行混樣(但不進(jìn)行eDNA富集操作)會稀釋某個樣品所偶然抓住的某低資源量物種超過檢出閾值的eDNA豐度，導(dǎo)致一系列低資源量物種的eDNA豐度低于檢出閾值，進(jìn)而導(dǎo)致檢出結(jié)果的系統(tǒng)性誤差。綜合分析已有的qPCR實(shí)驗(yàn)研究，不同實(shí)驗(yàn)室不同研究條件下的eDNA檢出限(limits of detection)在4～250個拷貝每個反應(yīng)(擬合結(jié)果范圍略有擴(kuò)張，2.19～260)，eDNA量化限(limits of quantification)在10～1920個拷貝每個反應(yīng)(擬合結(jié)果范圍略有左偏，6～839)[66]。有案例研究也證實(shí)，基于各樣點(diǎn)樣品單獨(dú)測序結(jié)果的物種累計(jì)曲線比基于各樣點(diǎn)樣品混合樣重復(fù)測序的物種累計(jì)曲線所獲得的物種數(shù)和多樣性要高[88]。

3.5 樣品前處理

樣品前處理主要是指對水樣的處理以獲得富集的eDNA樣品，因?yàn)橥ǔＧ闆r下土壤、沉積物、固體混合物、痕跡樣品采集后直接密封冷凍即可。最高效的水樣預(yù)處理方式是過濾，不同的過濾方式所得到的結(jié)果差異不大，但過濾用的濾膜孔徑規(guī)格和濾膜材質(zhì)對結(jié)果有明顯影響：孔徑越小所捕捉到的eDNA類群越多，其代價是過濾時間越長，在實(shí)踐中需要根據(jù)監(jiān)測目標(biāo)的形態(tài)(病毒、細(xì)菌、浮游生物、宏體生物碎片、游離DNA)進(jìn)行權(quán)衡；對于濾膜材質(zhì)，有研究顯示用河流和湖泊水體eDNA監(jiān)測真核生物，玻璃纖維濾膜比樹脂濾膜的過濾效果好，纖維素酯濾膜比聚醚砜濾膜的過濾效果好[94-96]。

不建議對水樣進(jìn)行預(yù)先過濾(除了為富集某特定類群eDNA而進(jìn)行的篩分)。一些研究對較渾濁水樣進(jìn)行預(yù)先過濾以去除大顆粒雜質(zhì)，然后用微孔濾膜過濾獲得細(xì)顆粒的eDNA樣品，但考慮到大顆粒雜質(zhì)對于用微孔濾膜進(jìn)行過濾不會產(chǎn)生特別大的影響，以及預(yù)處理在除去大顆粒雜質(zhì)時也會去除相當(dāng)一部分被大顆粒雜質(zhì)吸附的目標(biāo)eDNA，所以對懸浮顆粒較多、泥沙含量較高或富營養(yǎng)化的水體可進(jìn)行分樣處理(通過靜置或離心將顆粒物進(jìn)行富集形成沉淀物樣品，按照沉積物樣品的處理方式進(jìn)行eDNA提取，上清液進(jìn)行抽濾形成濾膜上的樣品，進(jìn)行eDNA提取)，也可以延長抽濾時間、壓縮抽濾水體體積、增加樣品的重復(fù)數(shù)，但不建議對水樣進(jìn)行預(yù)先過濾。一項(xiàng)對海洋浮游動物群落結(jié)構(gòu)的案例研究確證了經(jīng)過預(yù)先過濾的eDNA樣品中所檢出的生物類群顯著少于未經(jīng)預(yù)先過濾的eDNA樣品中所檢出的[97]。因?yàn)轭A(yù)先過濾并不降低樣品污染、測序錯誤的可能性，所以減少的生物類群大概率是稀有物種/類群。eDNA監(jiān)測的主要目的和優(yōu)勢之一是對稀有物種的檢出，而非對傳統(tǒng)方法能夠輕易得出的結(jié)果進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，所以不進(jìn)行水樣預(yù)先過濾的代價是值得的。

對于部分特定目的或針對特定類群的非水體eDNA監(jiān)測，也可以通過樣品前處理來提高監(jiān)測效率。比如，對在兩個鮭魚養(yǎng)殖場采集的84個底泥樣品分組進(jìn)行篩分對比實(shí)驗(yàn)，非篩分樣品中后生動物序列(metazoan reads)的平均百分比分別為19.53%和17.10%；篩分樣品中后生動物序列的平均百分比分別為81.03% 和89.92%[98]。篩分有效地清除了硅藻門類群(如海藻和浮游植物)，富集了后生動物。篩分樣品中eDNA測序中底棲動物平均占比在一個樣點(diǎn)是未篩分樣品的4.1倍(47.29% vs 11.46%)，在另一個樣點(diǎn)是未篩分樣品的5.7倍(20.03% vs 3.52%)[98]。

3.6 樣品保存

樣品保存主要指樣品從被采集到DNA提取之間的這段時間的保存。對于不需要預(yù)處理的樣品(比如土壤、沉積物、固體混合物、痕跡等)最有效且便捷的方法即-80℃、-20℃或干冰浴冷凍保存。對于水樣，冰浴保存可以降低eDNA在水中的降解速率[99]，也有用陽離子表面活性劑來抑制水體中eDNA降解[100]，但是不如低溫保存有效[101]。當(dāng)然，最有效的還是盡快進(jìn)行過濾，把eDNA富集在濾膜上，然后干燥冷凍(-80℃、-20℃)保存[96]。

3.7 擴(kuò)增引物選擇

擴(kuò)增引物，根據(jù)eDNA監(jiān)測的對象和目的選擇用物種特異性引物或者metabarcoding通用引物。物種特異性引物主要針對特定物種的eDNA(快速)監(jiān)測檢出與定量(比如病源監(jiān)測、入侵物種監(jiān)測、瀕危物種監(jiān)測等)，metabarcoding通用引物主要針對目標(biāo)生物類群的eDNA監(jiān)測檢出(比如對細(xì)菌、魚類、植物、真核生物等的物種組成監(jiān)測)[49]。不同類群往往有不同的常用通用引物(比如真菌常用ITS、18S rRNA基因的通用引物，細(xì)菌、古菌常用16S rRNA基因的通用引物，后生動物常用COI、線粒體12S rRNA、Cytb基因的通用引物)。不同通用引物之間，有一定的擴(kuò)增類群范圍、類群內(nèi)擴(kuò)增比例、物種/遺傳辨識度差異[102-104]。傳統(tǒng)通用引物在越來越多的使用中逐漸形成大勢并不斷積累數(shù)據(jù)，同時也有不少新的通用引物被開發(fā)出來[35,105-106]，但新開發(fā)通用引物是否真的好用，是否有足夠的優(yōu)勢替代已塑造了一定程度路徑依賴的傳統(tǒng)通用引物，還有待實(shí)踐和時間檢驗(yàn)。

對于魚類，針對線粒體12S rRNA基因的通用引物比針對COI基因的通用引物有更好的檢出效果[104,107]。當(dāng)前的狀況是，針對線粒體12S rRNA基因的通用引物檢出結(jié)果可重復(fù)性高，但數(shù)據(jù)庫不全；針對COI基因的通用引物檢出結(jié)果可重復(fù)性低，但數(shù)據(jù)庫全[107]，因而當(dāng)前用COI的通用引物還是更普遍一些。隨著線粒體12S rRNA數(shù)據(jù)庫的完善，線粒體12S rRNA的通用引物之后或?qū)⑹且粋€重要的可選項(xiàng)。由于當(dāng)前各metabarcoding通用引物對目標(biāo)類群的擴(kuò)增都存在一定的效率缺陷，使用多個通用引物分別進(jìn)行擴(kuò)增測序分析，并對結(jié)果進(jìn)行并聯(lián)分析能夠一定程度上緩解部分覆蓋缺陷問題，但是否能夠徹底解決覆蓋缺陷問題、是否能夠準(zhǔn)確反映群落結(jié)構(gòu)尚未確定。

對樣品進(jìn)行環(huán)境宏基因組(metagenome)測序并系統(tǒng)注釋，也是一種檢出方式[108]。宏基因組測序能夠覆蓋各生物類群，所得的數(shù)據(jù)量大得多，但成本卻高得多，結(jié)果的精確度和覆蓋度也未確定，目前在微生物上用得多，在其它類群中用得非常少，需要根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行選擇，并對類群覆蓋度和注釋效率進(jìn)行相應(yīng)定量評估。

3.8 樣品提取-擴(kuò)增-測序-分析程序

對每一類樣品，應(yīng)該有標(biāo)準(zhǔn)化的eDNA提取-擴(kuò)增-測序-分析程序。因?yàn)閑DNA提取方法和具體操作程序、PCR擴(kuò)增的退火溫度和循環(huán)數(shù)、測序平臺和測序技術(shù)、分析流程和具體參數(shù)都會對最后所解析出來的OTUs豐度評估產(chǎn)生一定影響，所以只有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的eDNA提取-擴(kuò)增-測序-分析程序，其最后所得的結(jié)果之間才具有完全的可比性[109]。對于具體的eDNA提取方法，有學(xué)者提出特定改進(jìn)方案[110]，但用商業(yè)試劑盒是越來越普遍的方式[111]。從現(xiàn)狀來看，從eDNA商業(yè)試劑盒提取、eDNA樣品質(zhì)量檢測，到PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物質(zhì)量檢測、PCR產(chǎn)物提取與純化、PCR產(chǎn)物定量，再到DNA文庫構(gòu)建、測序、序列數(shù)據(jù)質(zhì)控、OTU聚類、OTU豐度統(tǒng)計(jì)[22]，包括其中各個步驟的污染控制、參數(shù)設(shè)置及調(diào)優(yōu)，商業(yè)生物技術(shù)公司都有一整套標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)流程及數(shù)據(jù)處理軟件，并在為非常多的eDNA相關(guān)研究提供技術(shù)服務(wù)支持。從目前趨勢可以預(yù)見，樣品提取-擴(kuò)增-測序-分析一整套都委托給商業(yè)生物技術(shù)公司也將是未來的一個重要選項(xiàng)和趨勢[112]。

雖然由商業(yè)生物技術(shù)公司執(zhí)行的eDNA樣品提取-擴(kuò)增-測序-分析程序在執(zhí)行過程中由公司技術(shù)人員不斷技術(shù)參數(shù)調(diào)優(yōu)進(jìn)而逐漸趨于標(biāo)準(zhǔn)化，但還存在兩個細(xì)節(jié)問題尚待解決并值得注意：1)擴(kuò)增當(dāng)中的引物偏好問題。該問題的存在比較普遍，并且是對群落結(jié)構(gòu)定量產(chǎn)生重要影響的技術(shù)誤差來源[113]，這個問題的解決一方面需要開發(fā)更好的偏好性更小的通用引物來緩解，另一方面也可以通過定量引物偏好，對整體結(jié)果進(jìn)行模擬和逆向校正。2)分析當(dāng)中的OTU聚類的參數(shù)設(shè)置問題。該問題是一個比較直觀的問題，OTU聚類時序列相似度設(shè)置越高，聚類形成的OTU數(shù)目就越多，進(jìn)而可能影響到后續(xù)的序列比對和分類學(xué)注釋。這是一個計(jì)算量和結(jié)果精確度的權(quán)衡，可以在算力允許的情況下自行調(diào)試合適的參數(shù)，比如97%、99%、99.9%。

對序列的分析，除了OTU聚類分析路徑之外，ASV(amplicon sequence variant)降噪分析路徑也在逐漸獲得相關(guān)研究者的關(guān)注。從OTU聚類分析路徑和ASV降噪分析路徑單獨(dú)使用比較來看，聚類及注釋結(jié)果各有優(yōu)缺點(diǎn)，比如針對COI基因所得聚類OTUs和降噪所得ASVs差不多，并且注釋所得分類單元也差不多，而針對18S 基因所得聚類OTUs明顯比降噪所得ASVs要多，并且注釋所得分類單元也要多[103]。有研究提出OTU聚類分析路徑和ASV降噪分析路徑不應(yīng)該是相互替代的，而是相互補(bǔ)充的，建議用ASV來指示單倍型，用OTU來指示物種，避免相關(guān)信息丟失，進(jìn)而提高不同研究間的可加性和可比性[114]。聚類分析路徑和降噪分析路徑都有不止一種算法[115-116]，相應(yīng)類別之內(nèi)的算法在使用中或多或少可互相混合、折中和交換[114]，在標(biāo)準(zhǔn)化過程中建議選定一種或幾種簡易有效的算法進(jìn)行計(jì)算和結(jié)果展示。

對于針對特定物種的eDNA(快速)監(jiān)測檢出與定量，往往只需要使用物種特異性引物進(jìn)行PCR定性檢出和qPCR或ddPCR定量分析[49]，不需要進(jìn)行測序、序列分析、序列比對注釋等步驟環(huán)節(jié)。使用物種特異性引物進(jìn)行qPCR或ddPCR定量分析，主要是進(jìn)行eDNA相對豐度的定量，因?yàn)閑DNA相對豐度在一定條件下和目標(biāo)物種的個體數(shù)量呈線性正相關(guān)[117-118]，進(jìn)而可被用來開展魚類自然繁殖監(jiān)測[59]。通過eDNA定量分析可以為各物種/類群的eDNA釋放速率、eDNA降解速率、eDNA濃度與個體數(shù)量關(guān)系等進(jìn)行數(shù)據(jù)積累，進(jìn)而為未來用模型根據(jù)eDNA濃度模擬計(jì)算目標(biāo)類群個體數(shù)量或資源量提供數(shù)據(jù)庫支持。

3.9 序列比對注釋

序列比對注釋的關(guān)鍵在于參考數(shù)據(jù)庫的建立與完善。對于特定目標(biāo)物種的監(jiān)測(比如特定珍稀瀕危物種監(jiān)測、入侵種監(jiān)測、寄生蟲監(jiān)測等)只需要通過物種特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測確認(rèn)即可，無需進(jìn)行測序和序列比對[13]；如果需要對特定目標(biāo)進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，則需要進(jìn)行測序和相關(guān)序列分析。對于大類群目標(biāo)的監(jiān)測則需要特定的序列參考數(shù)據(jù)庫，比如真菌的ITS基因Unite數(shù)據(jù)庫、18S rRNA基因Silva數(shù)據(jù)庫，細(xì)菌和古菌的16S rRNA基因Silva或Greengene數(shù)據(jù)庫，后生動物的線粒體COI基因用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫等。對于具體區(qū)域的具體類群的eDNA監(jiān)測往往會因?yàn)槟繕?biāo)數(shù)據(jù)的有限性使得常用參考數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列存儲不全所造成的結(jié)果遺漏顯得不可接受，所以參考數(shù)據(jù)庫的完善對于eDNA監(jiān)測的應(yīng)用非常必要[40]。在公共參考數(shù)據(jù)庫不能滿足特定區(qū)域特定類群的研究需求時，可以根據(jù)已有材料、已知信息建立本地參考數(shù)據(jù)庫[119-120]。

序列比對注釋中另一個需要特別注意的問題是分類置信度的設(shè)置。在參考數(shù)據(jù)庫中參考序列對物種覆蓋不是十分完全的情況下，如果序列比對注釋的分類置信度設(shè)置得較低，往往會出現(xiàn)一些錯誤注釋，即把某一物種的序列錯誤匹配到序列相似的另一物種上，或者把缺少參考序列的某一物種的序列強(qiáng)行匹配到序列相似的另一物種上[40]，在當(dāng)前參考數(shù)據(jù)庫建設(shè)條件下，后一種情況更為普遍。在參考數(shù)據(jù)庫中參考序列對遺傳多樣性覆蓋不是十分完全的情況下，如果序列比對注釋的分類置信度設(shè)置得很高，往往會出現(xiàn)一些沒有注釋的OTU，即該OTU序列通過比對無法與參考數(shù)據(jù)庫中的任一序列形成匹配，這種問題在基于不完備的本地?cái)?shù)據(jù)庫的比對注釋中較為常見。這是一個參考數(shù)據(jù)庫完備程度和結(jié)果匹配精確度之間的適配，可以自行調(diào)試合適的參數(shù)，比如97%、99%、99.9%。比對注釋所使用的算法差異(比如BLAST、RDP classifier、Bayesian Lowest Common Ancestor)和軟件差異(比如Qiime2、Usearch)對結(jié)果也會產(chǎn)生一定影響，其結(jié)果的準(zhǔn)確度需要相應(yīng)的比較研究來確定，在對不同研究的注釋結(jié)果進(jìn)行橫向比較時應(yīng)對算法和軟件進(jìn)行統(tǒng)一。

3.10 監(jiān)測結(jié)果后評估

監(jiān)測結(jié)果后評估主要是對監(jiān)測結(jié)果的樣品重復(fù)數(shù)的后評估、時間有效度的后評估、空間有效度的后評估、注釋有效度的后評估，是利用當(dāng)次監(jiān)測結(jié)果和歷史參考數(shù)據(jù)對當(dāng)次監(jiān)測過程中相關(guān)環(huán)節(jié)的評估，其它內(nèi)容不是不需要評估，而只是因?yàn)闊o法根據(jù)當(dāng)次監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行后評估。樣品重復(fù)數(shù)的后評估，即以當(dāng)次監(jiān)測所采樣品的檢出結(jié)果分析樣品重復(fù)數(shù)和目標(biāo)檢出度(或特定目標(biāo)檢出概率)之間的關(guān)系，計(jì)算當(dāng)次監(jiān)測所采樣品重復(fù)數(shù)所能達(dá)到的檢出度水平，是對樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計(jì)的校驗(yàn)。時間有效度的后評估，即以當(dāng)次監(jiān)測相鄰采樣時間各相應(yīng)采樣點(diǎn)所獲得的監(jiān)測結(jié)果差異度(組成差異度或豐度差異度)，結(jié)合可確認(rèn)的物種差異或群落結(jié)構(gòu)差異，分析eDNA的半衰期，評估當(dāng)次監(jiān)測的時間有效度，是對采樣時間設(shè)計(jì)的校驗(yàn)?？臻g有效度的后評估，即以當(dāng)次監(jiān)測各樣點(diǎn)所獲得的監(jiān)測結(jié)果計(jì)算eDNA輸移或擴(kuò)散的半衰距離，評估當(dāng)次監(jiān)測的空間有效度，是對采樣點(diǎn)設(shè)計(jì)的校驗(yàn)。注釋有效度的后評估，即以當(dāng)次監(jiān)測所測定序列注釋結(jié)果與傳統(tǒng)調(diào)查結(jié)果相比較，以及與其它參考數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果相比較，評估當(dāng)次監(jiān)測中參考數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果的有效度，是對參考數(shù)據(jù)庫及分類學(xué)注釋的校驗(yàn)。比如在長江武漢江段開展的魚類eDNA監(jiān)測中，用線粒體COI基因宏條形碼(引物mlCOIintF/jgHCO2198R)共檢出89種魚類，其中有30種由歷史捕撈調(diào)查結(jié)果所確認(rèn)，而與之平行開展的捕撈調(diào)查監(jiān)測記錄到35種魚類，其中24種在eDNA監(jiān)測中被檢出[40]。

示例化說明，假如有針對某一小流域的動物多樣性監(jiān)測方案，每個采樣點(diǎn)位設(shè)計(jì)5個樣品重復(fù)，每2個月開展1次監(jiān)測，整個樣點(diǎn)沿水系及其岸帶分布且樣點(diǎn)間徑流距離10 km，樣品采集以溪流水體和岸帶土壤為對象，水樣通過抽濾獲得富集eDNA濾膜，干燥冷凍保存運(yùn)輸，土樣直接冷凍保存運(yùn)輸，測序引物選擇針對真核生物的COI基因通用引物，樣品委托商業(yè)生物科技公司進(jìn)行提取、擴(kuò)增、測序、分析，將已聚類OTU序列比對公共參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類學(xué)注釋，獲得目標(biāo)類群基礎(chǔ)生物組成及相對豐度信息。樣品重復(fù)數(shù)的后評估，即對每個采樣點(diǎn)位5個樣品重復(fù)的結(jié)果進(jìn)行物種積累曲線分析，估算理論可檢出物種數(shù)，并根據(jù)物種積累曲線模擬獲得樣品重復(fù)數(shù)和物種檢出度間的量化關(guān)系，給出當(dāng)前監(jiān)測方案的檢出度。時間有效度的后評估，即對每個采樣點(diǎn)位的相鄰2次監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行縱向比較，分析其相似度(重復(fù)度)及其變化規(guī)律，獲得其動物活動時間差異性和eDNA半衰期，給出當(dāng)前監(jiān)測方案的時間有效度?？臻g有效度的后評估，即對系列采樣點(diǎn)每次的監(jiān)測結(jié)果進(jìn)行橫向比較，分析在每次采樣時段樣點(diǎn)間eDNA輸移的半衰距離，給出當(dāng)前監(jiān)測方案的空間有效度。注釋有效度的后評估，即將分類學(xué)注釋結(jié)果(或結(jié)果中某特定類群)與傳統(tǒng)分類學(xué)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行對比，評估注釋結(jié)果的有效度(正確注釋的比例、注釋結(jié)果對傳統(tǒng)分類學(xué)調(diào)查結(jié)果的覆蓋度等)。

監(jiān)測結(jié)果后評估并不困難，不需要另外投入物力去補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，只需要根據(jù)已獲得結(jié)果對相關(guān)問題進(jìn)行后驗(yàn)的分析評估即可。當(dāng)前的研究絕大多數(shù)沒有開展監(jiān)測結(jié)果后評估，只是因?yàn)闆]有注意到其必要性。希望這個內(nèi)容在之后的eDNA監(jiān)測分析評估工作中能夠得到踐行。

4 eDNA監(jiān)測技術(shù)應(yīng)用圖景

4.1 未來的eDNA監(jiān)測應(yīng)用場景

隨著生態(tài)文明建設(shè)的推進(jìn)，更為系統(tǒng)化精細(xì)化的生物監(jiān)測評估將是未來生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性管理的基礎(chǔ)需求，eDNA監(jiān)測在未來可憑借其檢出率高、所需樣品重復(fù)數(shù)少、所需付出的人力物力時間成本低[121-122]的優(yōu)勢成為傳統(tǒng)監(jiān)測方案的便捷高效的補(bǔ)充方案。比如在加拿大魁北克地區(qū)對3種兩棲類開展的監(jiān)測中，用傳統(tǒng)主動搜索方法觀察到目標(biāo)物種的溪流中都監(jiān)測到了相應(yīng)的eDNA信號，主動搜索沒有觀察到目標(biāo)物種的9條溪流中也監(jiān)測到了相關(guān)eDNA信號[121]。在美國新澤西州12個葡萄園的48個地塊內(nèi)開展的入侵生物監(jiān)測中，eDNA監(jiān)測的檢出率比傳統(tǒng)目視查找的檢出率高一倍多，要達(dá)到95%的檢出度，僅需要開展5個次葡萄園和12個次地塊eDNA監(jiān)測，但對應(yīng)的需要開展14個次葡萄園和29個次地塊獨(dú)立目視監(jiān)測[122]。因此，eDNA監(jiān)測完全可以作為一個補(bǔ)充方案或者延伸方案來應(yīng)用，以發(fā)現(xiàn)那些難以被記錄到或者容易被忽略的生物信息。

隨著開放科學(xué)的推進(jìn)，更為標(biāo)準(zhǔn)化系列化的生物監(jiān)測結(jié)果將是未來生態(tài)環(huán)境基礎(chǔ)數(shù)據(jù)透明開放共享的基礎(chǔ)需求，對長期定期監(jiān)測區(qū)域或?qū)ο蟮募夹g(shù)標(biāo)準(zhǔn)化eDNA監(jiān)測作為常規(guī)生物監(jiān)測工具之一，其所獲得的標(biāo)準(zhǔn)化系列化監(jiān)測記錄和數(shù)據(jù)可以為研究者、產(chǎn)業(yè)界和政府部門的研究和決策提供通用的科學(xué)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)(表3)。研究者、產(chǎn)業(yè)界和政府部門可以把eDNA監(jiān)測納入其生物監(jiān)測工具包中，按標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)的樣點(diǎn)和頻度進(jìn)行長期性周期性監(jiān)測，生成標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)文本和結(jié)果文件，形成相關(guān)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化系列化積累，并通過推進(jìn)數(shù)據(jù)的通用、集成、開放獲取為后續(xù)的大尺度、長序列研究及相關(guān)決策提供具有重要意義的數(shù)據(jù)包[123-124]。比如水生動物共生微生物影響著宿主的健康[124-126]，同時又受環(huán)境微生物的顯著影響[29,127-130]，因而對環(huán)境微生物進(jìn)行eDNA監(jiān)測，不僅可用以評估水體微生態(tài)健康狀況，也可用以預(yù)警水生動物健康狀況[29,124]，進(jìn)而為水生態(tài)系統(tǒng)管理提供支持，為水生野生動物保護(hù)提供支撐。長序列的eDNA監(jiān)測結(jié)果文件，也可以為全球變化的生態(tài)系統(tǒng)響應(yīng)、生態(tài)環(huán)境保護(hù)的生態(tài)恢復(fù)效果等的深入研究提供數(shù)據(jù)源支撐，并為后續(xù)的管理決策和應(yīng)對政策提供科學(xué)支持。

表3 未來的eDNA監(jiān)測應(yīng)用場景概述*Tab.3 Summary of the scopes of the eDNA monitoring in future

4.2 未來的eDNA監(jiān)測技術(shù)狀況

未來5～10年或?qū)⑹莈DNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化急速發(fā)展的時期，到2030年前后，預(yù)期將基本完成采樣方案、樣品處理方法、分子實(shí)驗(yàn)方案、監(jiān)測結(jié)果后評估方法的標(biāo)準(zhǔn)化。屆時，熱點(diǎn)區(qū)域特定研究對象eDNA監(jiān)測的樣品重復(fù)數(shù)檢出度、eDNA的降解時間周期、eDNA空間輸移的有效距離、eDNA賦存形態(tài)和效率等eDNA生態(tài)學(xué)過程的關(guān)鍵參數(shù)將完成相應(yīng)積累，eDNA監(jiān)測方案中的樣品重復(fù)數(shù)設(shè)置、時間設(shè)置、空間設(shè)置、樣品介質(zhì)選擇或組合將形成一套比較確定的參數(shù)，指導(dǎo)和支撐相關(guān)長期定期監(jiān)測，進(jìn)而為相關(guān)研究提供開放、穩(wěn)定的系列化數(shù)據(jù)源。非熱點(diǎn)區(qū)域的eDNA監(jiān)測方案中的樣品重復(fù)數(shù)設(shè)置、時間設(shè)置、空間設(shè)置、樣品介質(zhì)選擇或組合也可以通過本框架所示的采樣方案制定方法而進(jìn)行確定。

樣品處理(樣品前處理、樣品保存方法)也將通過對各種方法和處理效果的對比，選定可以滿足要求的一整套優(yōu)化處理方法。當(dāng)前國外[54-55]和國內(nèi)(2)http://www.chinacses.org/xw/gsgg/202205/t20220516_982140.shtml.已經(jīng)有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)制定，雖然離完全達(dá)成共識成為通用執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)還有一段距離，但可以預(yù)見，在有組織地推動下，有望在領(lǐng)域內(nèi)達(dá)成共識并形成統(tǒng)一規(guī)范。分子實(shí)驗(yàn)將更多地實(shí)現(xiàn)引物選擇趨同，室內(nèi)實(shí)驗(yàn)由商業(yè)生物科技公司來完成，數(shù)據(jù)分析依托商業(yè)生物科技公司所提供的分析軟件分析平臺來完成。當(dāng)前eDNA監(jiān)測的引物選擇已形成部分共識；室內(nèi)實(shí)驗(yàn)大多由商業(yè)生物科技公司來完成，而商業(yè)生物科技公司所采用的程序基本一致，只是個別細(xì)節(jié)參數(shù)可能需要進(jìn)一步統(tǒng)一；基礎(chǔ)生物信息分析軟件的開源獲取和廣泛使用已實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)構(gòu)架的初步標(biāo)準(zhǔn)化，只是在結(jié)果的展示上需要達(dá)成統(tǒng)一，即在結(jié)果的展示中哪些結(jié)果必須提供。

監(jiān)測結(jié)果后評估(包括對樣品重復(fù)數(shù)、樣點(diǎn)空間布設(shè)、采樣時間設(shè)定、注釋有效度等的評估)也將隨著研究者們逐漸意識到其必要性和重要性，而獲得方法標(biāo)準(zhǔn)化上的共識，并隨著相關(guān)通用計(jì)算方法、計(jì)算代碼、計(jì)算程序的發(fā)布而得以實(shí)現(xiàn)。已有組織提出對研究團(tuán)隊(duì)eDNA監(jiān)測能力進(jìn)行評估，以適應(yīng)未來常態(tài)化監(jiān)測[131]，當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)化整體框架或可為研究團(tuán)隊(duì)eDNA監(jiān)測能力建設(shè)提供指引。

更進(jìn)一步來講，隨著社會需求擴(kuò)張和科學(xué)技術(shù)發(fā)展之間的循環(huán)聯(lián)動，eDNA監(jiān)測必然向更快速、便捷、全面、準(zhǔn)確、智能、便宜、透明、可得等方向發(fā)展，由于eDNA的生態(tài)學(xué)特性，樣品重復(fù)數(shù)、樣點(diǎn)空間布設(shè)、采樣時間設(shè)定等所依賴的科學(xué)基礎(chǔ)不會發(fā)生明顯改變，所以eDNA監(jiān)測未來進(jìn)一步發(fā)展的壓力基本在技術(shù)進(jìn)步和管理進(jìn)步上。技術(shù)進(jìn)步，主要是針對固定監(jiān)測站點(diǎn)的在線自動化實(shí)時監(jiān)測實(shí)時分析實(shí)時上報、針對非固定站點(diǎn)的流動便攜監(jiān)測設(shè)備的一體化采樣分析和數(shù)據(jù)結(jié)果上傳以及監(jiān)測結(jié)果的提質(zhì)和監(jiān)測成本的壓縮。管理進(jìn)步，主要是多部門多數(shù)據(jù)源(比如水文數(shù)據(jù)、水環(huán)境數(shù)據(jù)、氣象數(shù)據(jù)、人類活動數(shù)據(jù)、生物數(shù)據(jù)等)的實(shí)時集總實(shí)時關(guān)聯(lián)分析實(shí)時預(yù)警，以及周期性數(shù)據(jù)包的發(fā)布等。

4.3 eDNA監(jiān)測技術(shù)亟需解決的幾個參數(shù)和問題

就當(dāng)前的eDNA監(jiān)測技術(shù)應(yīng)用來看，有幾個技術(shù)參數(shù)和問題亟需解決，因?yàn)檫@幾個技術(shù)參數(shù)和問題在理論上并不存在困難，只是需要一批相對細(xì)致的實(shí)驗(yàn)研究來進(jìn)行數(shù)據(jù)積累，所以比較容易解決。1)eDNA監(jiān)測需要設(shè)置的樣品重復(fù)數(shù)，即需要盡快積累各個監(jiān)測區(qū)域/監(jiān)測點(diǎn)不同環(huán)境條件下的樣品重復(fù)數(shù)-檢出度曲線，給出合適的檢出度目標(biāo)下所需的樣品重復(fù)數(shù)。2)eDNA監(jiān)測兩次采樣間的時間間隔，即盡快積累各個監(jiān)測區(qū)域各個季節(jié)各個目標(biāo)生物類群的eDNA半衰時間，給出合適的監(jiān)測辨別度目標(biāo)下最小的時間間隔。3)eDNA監(jiān)測樣點(diǎn)的間距設(shè)置，即需要對于靜水水體和陸地(以及其它無明確eDNA輸移的對象)，盡快積累各監(jiān)測區(qū)域監(jiān)測點(diǎn)不同環(huán)境條件下的樣點(diǎn)-物種差異度曲線，對于流水水體(以及其它存在明確eDNA輸移的對象，比如氣溶膠和碎屑浮塵)，盡快積累各監(jiān)測河段監(jiān)測點(diǎn)不同環(huán)境條件下的eDNA隨徑流(氣流)輸移的半衰距離，給出合適的監(jiān)測精度目標(biāo)下所需的樣點(diǎn)間距。4)eDNA監(jiān)測的擴(kuò)增引物和參考數(shù)據(jù)庫，即盡快完善各個類群的公共參考數(shù)據(jù)庫建設(shè)，在公共參考數(shù)據(jù)庫短時間內(nèi)無法完成的情況下，盡快建立各自的本地參考數(shù)據(jù)庫，并針對各特定目標(biāo)類群和參考數(shù)據(jù)庫確定合適的OTU聚類序列相似度值和序列比對注釋分類置信度。5)eDNA監(jiān)測結(jié)果的定量模型，因?yàn)橛懈鞣N因素引起結(jié)果系統(tǒng)性偏移，所以在完全弄清楚各個影響因素和影響過程之前，針對生物類群的eDNA監(jiān)測，盡快積累各個類群實(shí)際群落結(jié)構(gòu)和eDNA監(jiān)測結(jié)果的擬合關(guān)系，建立通過eDNA監(jiān)測結(jié)果獲得實(shí)際群落結(jié)構(gòu)信息的映射模型；針對具體目標(biāo)物種的eDNA監(jiān)測，盡快積累種群資源數(shù)量/重量和eDNA監(jiān)測檢出概率的量化關(guān)系，建立通過eDNA監(jiān)測檢出概率反推種群資源數(shù)量/重量信息的映射模型。

4.4 eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)性整體框架的說明

考慮到無法對多種多樣的eDNA監(jiān)測相關(guān)工作給出一個確切的標(biāo)準(zhǔn)化方案，也無意對每種eDNA監(jiān)測工作分別給出一個確切的標(biāo)準(zhǔn)化方案，所以本文未對具體的標(biāo)準(zhǔn)化參數(shù)進(jìn)行綜述和論證，只集中于eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)性整體框架的構(gòu)建和說明。本文所提出的eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)性整體框架(圖1，表4)

表4 eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化系統(tǒng)性整體框架的適用概述*Tab.4 Summary of the eDNA monitoring standardizing framework suitability in different sample types

5 總結(jié)與展望

目前，eDNA監(jiān)測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化10個環(huán)節(jié)中的部分技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化問題已在一定程度上得到解決，剩下的問題在具體的目標(biāo)指引下，也有望在短期內(nèi)獲得一定程度的解決。在當(dāng)前技術(shù)快速進(jìn)步知識快速積累的時代，只要是通過技術(shù)進(jìn)步和知識積累能夠解決的問題，就一定能夠解決，技術(shù)路徑就一定能夠走通。期待未來5～10年內(nèi)，eDNA監(jiān)測在一些熱點(diǎn)區(qū)域(比如長江)成為一個長期性周期性的常規(guī)監(jiān)測內(nèi)容，并建立嚴(yán)謹(jǐn)、透明、開放、可用的高質(zhì)量eDNA監(jiān)測系列數(shù)據(jù)集，推動生物多樣性(及隱藏生物多樣性(hidden biodiversity))研究的開放參與[132]，為第四范式的(生態(tài)學(xué))科學(xué)研究提供數(shù)據(jù)驅(qū)動支撐[133]，為生態(tài)系統(tǒng)功能及健康管理的系統(tǒng)設(shè)計(jì)和快速反應(yīng)提供深度理解和及時預(yù)警。