馮彥釗，朱慶鋒，薛 皦，陳 沛，于 洋

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】隨著人口的迅速增長與全球氣候變化，植物的生長、抗性和品質(zhì)等受到嚴峻挑戰(zhàn)。分子育種是改良目標性狀、獲得更加優(yōu)質(zhì)作物的強力手段。基因編輯是一種利用核酸酶對目標基因進行堿基定點刪除、插入、替換或修飾的技術(shù)，利用該技術(shù)對特定的基因進行改造可以創(chuàng)制新的種質(zhì)［1-2］。水稻中花11 號是由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所育成的優(yōu)質(zhì)水稻品種，不僅具有良好的產(chǎn)量和抗逆性，同時也是植物分子生物學基礎(chǔ)研究領(lǐng)域最具代表性、使用最廣泛的模式品種之一。DWARF1（D1）是編碼水稻三聚體G 蛋白α 亞基的基因，調(diào)控水稻多種生命活動過程［2-3］。然而，在中花11 號中仍缺少對應(yīng)的d1缺失突變體，給G 蛋白相關(guān)通路的遺傳學研究帶來諸多不便。

【前人研究進展】早期的基因編輯技術(shù)利用大范圍核酸內(nèi)切酶誘發(fā)雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生隨機的堿基插入/缺失或同源重組。然而這種內(nèi)切酶切割效率較低，且需要長片段的識別序列［4-5］。隨后出現(xiàn)的鋅指核酸內(nèi)切酶（Zinc Finger Nucleases,ZFN）利用氨基酸模塊與DNA 三連續(xù)堿基一一對應(yīng)的關(guān)系進行靶向的DNA 切割，基因編輯效率大大提高［6-8］。不久，人們從侵染植物的黃單孢菌中獲得啟發(fā)，利用類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶（Transcription Activator-like Effector Nucleases,TALEN）作為內(nèi)切酶進行堿基編輯［9-10］。與之前的ZFN 相比，TALEN 中一個氨基酸模塊只對應(yīng)一個堿基對，使設(shè)計更加簡易［11］。盡管如此，ZFN 和TALEN 均需要針對不同的靶點序列設(shè)計合成相應(yīng)的蛋白，較耗時耗精力。CRISPR/Cas9 則是新一代基因編輯技術(shù)，最突出的優(yōu)點是不依賴于蛋白質(zhì)識別靶點DNA 序列，而是通過引導RNA（single guide RNA,sgRNA）與靶點DNA 互補配對，Cas9 識別前間隔序列鄰近基序（Protospacer Adjacent Motif,PAM）并行使核酸酶活性對靶基因進行切割［12-14］。至今，基于Cas9 的技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出多種形式，可以實現(xiàn)基因激活、熒光定位、單堿基編輯、定向編輯等［15-18］。Cas9 的同家族蛋白Cas12 和Cas13 也相繼被開發(fā)用作編輯DNA 和RNA［19-20］。由于該技術(shù)的簡易性，CRISPR/Cas9 已成為應(yīng)用最廣的基因編輯技術(shù)，在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域創(chuàng)制了大量寶貴材料［21-25］，在改良農(nóng)藝性狀上有廣闊的應(yīng)用前景［26-27］。

異源三聚體G 蛋白是定位于動植物細胞膜表面的重要信號轉(zhuǎn)導因子，作用于受體下游。它由α、β 和γ 共3 個亞基組成，在植物中參與激素信號轉(zhuǎn)導、離子通道調(diào)控、免疫應(yīng)答、細胞分裂等關(guān)鍵生理進程。與動物不同的是，植物基因組G 蛋白α 亞基拷貝數(shù)非常少，水稻只有一個編碼G 蛋白α 亞基的基因D1。D1基因有許多重要功能，與Gβ 和Gγ 組成復(fù)合體，調(diào)控水稻對氮素的利用和種子大?。?4-38］。此外，D1在稻瘟病的抗性中，與OsRac1共同調(diào)控OsMAPK6的蛋白水平，影響下游防御基因的表達［39］。在淹水脅迫環(huán)境中，D1在乙烯誘導缺氧薄壁細胞程序性死亡的過程中是必需的［40-42］。同時，D1也是油菜素內(nèi)酯和赤霉素中信號轉(zhuǎn)導通路中的一員［43］。運用突變體對D1進行研究已有相當長的歷史，但其突變體遺傳背景局限于日本晴、Taichung65（T65）和Kinmaze 中［2,44］。日本晴背景的d1突變體DK22 第5 個外顯子G1721T 的點突變產(chǎn)生終止密碼，導致較短和較圓的籽粒以及對赤霉素和油菜素內(nèi)酯的敏感性降低［45］。同為日本晴背景的HO541 有833 bp 缺失，出現(xiàn)短且深綠的葉片，花序變得更緊湊［2］。Kinmaze 背景下的CM1361-1 在D1的第5 個外顯子中發(fā)生19 bp 插入，導致節(jié)間變短［3,45］。T65 背景d1突變體中的D1基因最后一個外顯子發(fā)生2 個堿基缺失，對稻瘟病更易感［3］。中花11 號作為我國水稻基礎(chǔ)研究常用的品種之一，遺傳轉(zhuǎn)化體系非常成熟，許多基因在此背景中都有相應(yīng)的突變體，極大促進了水稻基因功能研究。

【本研究切入點】構(gòu)建有效的中花11 號背景下的d1突變植株，將為水稻基因功能研究提供便利。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對中花11 號野生型植株D1基因位點進行編輯，可以在中花11號背景中產(chǎn)生新的D1等位突變，豐富現(xiàn)有的d1突變體種質(zhì)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)編輯水稻中花11 號的D1基因，篩選及鑒定無抗、有效移碼突變的d1突變植株，并分析d1突變體的表型，以期為進一步研究D1的未知功能提供寶貴材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用水稻材料為中花11 號，為廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心分子育種技術(shù)研究室保存；所用大腸桿菌感受態(tài)為Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；所用農(nóng)桿菌感受態(tài)為EHA105，購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。試驗地點為廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，試驗時間為2021 年3 月至2022 年9 月。

1.2 靶向D1 的CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

利用He 等［46］報道的pEntry A 與pRHCas9載體進行構(gòu)建?；蚓庉嫲悬c用CRISPR-P 2.0 進行篩選（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/），選擇的靶點為5'GCTTTGATGAGGCAGAACTT3'，靶點在基因組中的位置為625～644（圖1B），合成引物（表1）。以pEntry A 為模板，用ENTRY-F/D1-gRNA-41R、D1-gRNA-41F/ENTRY-R 擴增成兩個片段。將這兩個片段以摩爾比1∶1 混合，再以ENTRY-F/ENTRY-R 引物進行第二輪擴增。反應(yīng)程序為98 ℃ 3 min；98 ℃10 s、60 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；68 ℃終延伸5 min。第二輪擴增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后，按照He 等［46］方法連接至pRHCas9 中。構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)，提取質(zhì)粒，測序比對后再轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)，參照崔瑩等［47］方法侵染水稻胚愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)化植株。

1.3 DNA 提取及PCR 檢測

DNA 提取參考王齊紅等［48］方法進行。基因型檢測的引物為D1-CRISPR-926F71/D1-CRISPR-926R69，利用KOD FX 聚合酶擴增，反應(yīng)程序為98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s、68 ℃ 60 s，35 個循環(huán)；68 ℃終延伸5 min。潮霉素、載體骨架和ACTIN基因檢測引物分別為HPT-F/HPT-R、VEC39-315F74/VEC39-315R75、ACTIN-F/ACTIN-R，序列如表1 所示。反應(yīng)程序為 98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，35 個循環(huán)；68 ℃終延伸5 min。

1.4 RNA 提取與qRT-PCR 檢測

按照Simms 等［49］方法進行RNA 提取，利用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（RR047）進行反轉(zhuǎn)錄，以TB Green?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）（RR820）進行熒光定量PCR，D1的qRT-PCR引物為D1-qF/D1-qR，內(nèi)參基因引物為UBQ5-qF/UBQ5-qR，序列如表1 所示。反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。相對表達量用2-〔d1(CtD1-CtUBQ5)-WT(CtD1-CtUBQ5)〕計算。顯著性分析采用Student’st-test。

表1 供試引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used in this study

1.5 表型測量與統(tǒng)計

株高用自地面到主穗頂長度的平均值表示，n=10。穗長用穗頸節(jié)到穗頂?shù)拈L度平均值表示，n=15。粒長、粒寬分別為飽滿種子的長度和寬度平均值n=12。千粒重用1000 粒飽滿種子的質(zhì)量平均值換算而成，n=20。顯著性分析采用Student’st-test。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻中花11 號d1 突變體的創(chuàng)制

為創(chuàng)制中花11 號背景下的d1突變體，我們采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對D1基因進行突變。首先選取位于第二個外顯子上的一段序列為靶點序列（見1.2）作為靶點，此位置與已報道的D1突變位點均不相同。將靶點序列正向引物與下游gRNA 的5'端序列融合，sgRNA 反向引物與上游U6 啟動子的3'端融合，再與pEntry A載體上的引物進行融合PCR，得到U6 啟動子-靶點-gRNA 表達盒。將擴增產(chǎn)物與pRHCas9 載體用PstI 和SpeI 雙酶切，再進行連接得到D1-Cas9 載體（圖1A）。將D1-Cas9 載體導入農(nóng)桿菌EHA105 中，侵染ZH11 愈傷組織，隨后通過共培養(yǎng)、篩選、分化等步驟得到d1突變體幼苗。

2.2 突變體基因型分析及表達水平檢測

為分析Cas9 是否對D1基因位點進行編輯，我們對d1突變體T1代植株進行DNA 提取，以其為模板，在編輯位點上下游400～500 bp 處設(shè)計引物進行PCR 擴增（圖1B），對產(chǎn)物進行Sanger測序，將測序結(jié)果與WT 進行比對。發(fā)現(xiàn)突變體的D1基因位點發(fā)生編輯，3 個株系均為純合移碼突變，其中d1-#1為-17+7 bp，d1-#2為+2 bp，d1-#3為+1 bp（圖2A）。為了解突變株中D1的表達水平，我們對T2代純合突變植株的幼苗進行RNA 提取并采用熒光定量PCR 檢測D1的mRNA水平。結(jié)果顯示，3 個突變株系D1的mRNA 水平均顯著下調(diào)，下調(diào)幅度高達80%～90%（圖2B）。這說明d1突變株在mRNA 和蛋白兩個水平上抑制D1的功能，成功獲得有效的d1突變植株。

圖2 d1 突變株的基因型鑒定及D1 表達量檢測Fig.2 Genotyping of d1 mutants and detection of expression level of D1

2.3 無潮霉素抗性突變體篩選

轉(zhuǎn)基因標記是作物向農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的障礙，易引發(fā)公眾對轉(zhuǎn)基因安全性的憂慮。同時，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生抗性標記的存在可能為以后基礎(chǔ)研究所需的雜交帶來不便。如兩親本抗性相同，難以用抗性準確篩選雜交成功的后代植株。因此，篩選無潮霉素抗性的d1突變株具有重要意義。農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)基因通常以單拷貝形式隨機插入到基因組中，通過 自交產(chǎn)生T1代時，抗性基因可通過同源重組或自由組合分離，得到無抗性的突變體。利用該原理，我們對T2代植株葉片的DNA進行提取，并且通過PCR 擴增HPT外源基因片段，同時擴增了ACTIN啟動子片段作為內(nèi)源基因的參照。結(jié)果顯示，每個株系隨機選取的若干植株中，均分離出不含外源基因的突變株（圖3），為后續(xù)研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖3 d1 各突變株系不同植株DNA 中轉(zhuǎn)基因標記的PCR 檢測Fig.3 Detection of transgenes in genomic DNA of d1 mutants by PCR

2.4 d1 突變體表型分析

以往研究表明，d1突變體的株型、穗型、籽粒形態(tài)與大小等與野生型有明顯差異。為全面了解中花11 號背景下d1突變體的表型，我們對植株形態(tài)、穗形和種子大小進行觀察（圖4）與統(tǒng)計（圖5）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，3 個d1突變株系均顯著矮化，株高僅有野生型的約50 %。此外，穗長只占野生型的約60%。d1突變體的種子大小、形態(tài)同樣發(fā)生明顯變化，其中粒長變得更短，野生型平均粒長為0.74（±0.05）cm，而3 個d1突變株系分別為0.55（±0.06）、0.62（±0.03）、0.55（±0.04）cm。然而，粒寬在d1突變體中無明顯變化，因此，d1突變體種子變得更圓，長寬比為1.29（±0.16）、1.46（±0.12）、1.34（±0.15），中花11 號的種子長寬比則為1.85（±0.10）。同時，d1植株千粒重顯著降低，約為野生型的60 %（圖5F），可見中花11 號背景下d1突變體產(chǎn)生嚴重的生長缺陷。

圖4 d1 突變株的形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of d1 mutants

圖5 d1 突變株的表型統(tǒng)計Fig.5 Phenotype statistics of d1 mutants

3 討論

D1是植物生長發(fā)育過程中一個重要的調(diào)控基因，日本在20 世紀初期已有該基因的水稻突變體。D1基因功能具有多效性，近年陸續(xù)出現(xiàn)其他背景下的D1等位突變體，如T65、Shiokari、Kinmaze。這些突變體突變形式各異，包括點突變、堿基插入/缺失導致蛋白翻譯提前終止、結(jié)構(gòu)域失活等，也有剪接位點改變和反義轉(zhuǎn)錄本導致的RNA 水平降低［44］。此外，科學家還發(fā)現(xiàn)了天然的表觀遺傳d1突變體，其DNA 序列并沒有發(fā)生變化，然而矮化的d1表觀突變體轉(zhuǎn)錄起始位點附近DNA 發(fā)生甲基化，同時，在D1基因座內(nèi)，組蛋白H3K9 乙?；浇档投鳫3K9 二甲基化水平升高，表明d1表觀突變體D1的表達被沉默［50］。在雙子葉模式植物擬南芥中，D1同源基因的缺失突變體已有4 個株系被報道，它們屬于Ws和Col背景［51-52］。其他植物種類如大豆、煙草、西紅柿等的D1同源基因功能研究并不深入，多數(shù)僅停留在基因的克隆、鑒定階段，缺乏相應(yīng)的功能缺失突變體［53］。本研究采用CRISPR/Cas9 介導的基因編輯技術(shù)對中花11 號的D1基因目標位置進行編輯，鑒定出3 個等位突變株系，豐富了現(xiàn)有的d1突變體類型。

現(xiàn)有研究表明，水稻d1突變體會導致植株矮小、直立，葉長變短且深綠、谷粒變短變圓、節(jié)間變短、對GA 和BR 敏感性降低、免疫應(yīng)答改變等多效表型［44］。我們創(chuàng)制的中花11 號背景下的d1突變體也出現(xiàn)植株矮小、穗小、籽粒變短、籽粒變薄等表型，與前人報道的其他背景下的d1突變體表型相吻合，表明D1在不同水稻品種中的功能高度保守，也證明本研究所得到的材料可有效應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域研究。

CRISP R/Cas9 基因編輯產(chǎn)生的移碼插入或缺失突變通常引起翻譯提前終止，導致無義RNA降解（Nonsense mRNA Decay,NMD）［54］。本研究所創(chuàng)制的d1突變體材料中，D1基因的mRNA水平下調(diào)約80%，我們分析d1突變體的編輯情況發(fā)現(xiàn)，d1-#1和d1-#2突變體均使D1 蛋白在第94 位氨基酸位置處提前終止，而d1-#3突變體會使D1 蛋白翻譯在第35 氨基酸處提前終止，這些因素很可能觸發(fā)mRNA 質(zhì)量監(jiān)控機制，導致D1mRNA 經(jīng)歷NMD 而下調(diào)，這些結(jié)果與我們之前在其他基因的CRISPR 敲除植株上觀察到的相似［55］。然而，CRISPR/Cas9 導致NMD 并不是絕對的，與sgRNA 到下游外顯子或終止子的距離遠近有關(guān)［56］。可見，CRISPR/Cas9 介導的基因編輯有可能從mRNA 水平和蛋白水平兩方面導致基因功能失活。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)在中花11 號背景中創(chuàng)制出3 個移碼突變的d1突變株系，qRT-PCR 結(jié)果顯示，D1mRNA 水平顯著下調(diào)。中花11 號背景的d1敲除植株出現(xiàn)植株矮小、穗小、籽粒變小、變圓等表型，千粒重也顯著減少，株高、穗長、粒長、長寬比和千粒重均下降40%～50%，而粒寬無明顯變化，這些表型與其他背景中現(xiàn)有的d1突變體相似，說明D1基因功能已經(jīng)失活。我們還從T2代植株篩選出不含轉(zhuǎn)基因標記的植株。鑒于中花1 1 號基因組已被研究得非常透徹，被廣泛用于基因功能研究，現(xiàn)有的突變體庫也以它為背景創(chuàng)制［22,23］，擁有中花11 背景的d1突變株對創(chuàng)制D1與其他基因的多重突變株更加便利。因此，本研究結(jié)果可以為后續(xù)的水稻基礎(chǔ)研究與育種應(yīng)用提供安全、有效的遺傳材料。