王 蕾，羅帝洲，鄧紫璇,，莫敏瑩,，張健玲，蘇穎輝，房元杰，張曉愛

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心/廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.江門海關(guān)技術(shù)中心，廣東 江門 529085）

流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種單細(xì)胞分析技術(shù)，基于流式細(xì)胞儀通過(guò)檢測(cè)散射或偶聯(lián)熒光信號(hào)快速、準(zhǔn)確、客觀、高通量獲得懸浮微粒（通常是細(xì)胞、細(xì)菌等微小顆粒）一系列重要的生物物理、生物化學(xué)相關(guān)特征參量，并能根據(jù)預(yù)選的參量范圍對(duì)細(xì)胞、細(xì)菌等微小顆粒進(jìn)行自動(dòng)分析和對(duì)特定群體進(jìn)行分選。流式細(xì)胞術(shù)是20 世紀(jì)60 年代后期開始發(fā)展起來(lái)的。20 世紀(jì)50 年代，光電粒子計(jì)數(shù)器被發(fā)明出來(lái)；1967年，Kamemtsky 和Melamed 提出細(xì)胞分選的方法；兩年后Van Dila Fulwyler 及其同事發(fā)明了第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)［1］。從早期使用的顯微鏡技術(shù)、激光共聚焦顯微成像技術(shù)，到現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的計(jì)算機(jī)圖像處理與分析系統(tǒng)，光學(xué)與電子電路等現(xiàn)代儀器已成為科學(xué)研究中必不可少的重要組成部分。國(guó)內(nèi)外專家和學(xué)者在光學(xué)和電子信息技術(shù)研究方面展開了更多的探索，使流式細(xì)胞儀的研究開始朝模塊化方向邁進(jìn)。

流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域，特別是生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近年來(lái)，由于流式細(xì)胞儀性能不斷提高、檢測(cè)快速以及高質(zhì)量試劑不斷開發(fā)，流式細(xì)胞術(shù)在農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。就植物研究而言，由于植物細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)——細(xì)胞壁的作用，使流式細(xì)胞儀在植物中的應(yīng)用受到限制。但是近年隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，流式細(xì)胞學(xué)方法被廣泛應(yīng)用于植物病原菌的分類與定位、基因組測(cè)序以及基因表達(dá)譜分析等諸多方面，如倍型分析、DNA 含量分析、原生質(zhì)體分選、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞融合產(chǎn)物分選等。就畜牧研究而言，流式細(xì)胞儀在疫病檢測(cè)、精子分選和性別控制等方面也有廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)能夠?qū)ι飿悠愤M(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析處理，并實(shí)現(xiàn)高通量篩選。流式細(xì)胞術(shù)雖在微生物研究中應(yīng)用較晚，但是也得到一定程度的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)展了多種基于流式細(xì)胞術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行快速篩查以及分離純化的方法。隨著流式細(xì)胞術(shù)越來(lái)越完善，在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛和深入，該技術(shù)為農(nóng)業(yè)科學(xué)研究提供了更強(qiáng)大的技術(shù)手段。

1 流式細(xì)胞術(shù)原理和功能分類

1.1 流式細(xì)胞術(shù)原理

流式細(xì)胞術(shù)是在流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)上，利用激光作為光源激發(fā)懸浮微細(xì)胞、細(xì)菌等微小顆粒的熒光分子，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。這些信號(hào)被光電二極管或光電倍增管等檢測(cè)器讀取后，聚焦激光和熒光信號(hào)的光學(xué)元件陣列與光散射特征相結(jié)合，從而對(duì)懸浮液中的細(xì)胞或顆粒進(jìn)行詳細(xì)分析［2］。流式細(xì)胞術(shù)可以快速測(cè)量、存貯、顯示在一定壓力下懸浮于液體中呈分散狀的細(xì)胞、細(xì)菌等微小顆粒，利用分析細(xì)胞或顆粒的光散射特性以及靶向抗體或細(xì)胞探針的熒光信號(hào)反映細(xì)胞或顆粒的特性，并且可以同時(shí)測(cè)量多個(gè)參數(shù)，根據(jù)預(yù)先選擇的參數(shù)范圍對(duì)特定亞群的細(xì)胞進(jìn)行分類和分選［3］。

流式細(xì)胞儀主要由激光源和光學(xué)系統(tǒng)、流動(dòng)室和液體流動(dòng)系統(tǒng)、光電管和檢測(cè)系統(tǒng)以及計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)4 個(gè)部件構(gòu)成。流式細(xì)胞儀有3 個(gè)重要的基本常數(shù)，即前向角散射、側(cè)向角散射和其他參數(shù)。其中，前向角散射可用于檢測(cè)不同大小的生物細(xì)胞和微粒；側(cè)向角散射通常用來(lái)反映生物細(xì)胞和微粒的表面形態(tài)、分布形態(tài)以及生物細(xì)胞內(nèi)顆粒的大小，也可精確地了解生物細(xì)胞內(nèi)的微觀結(jié)構(gòu)等參數(shù)［4］；其他參數(shù)通常為利用熒光光源的強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)在生物細(xì)胞內(nèi)的量和位置等。

1.2 流式細(xì)胞儀功能分類

1.2.1 分析型流式細(xì)胞儀 分析型流式細(xì)胞儀只能用于流式分析，細(xì)胞通過(guò)液體流動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)行分析，最后進(jìn)入廢液桶而無(wú)法再循環(huán)使用［5-6］。流式細(xì)胞儀的檢測(cè)和分析能迅速、高通量分析個(gè)體細(xì)胞中是否有大量的熒光和光散射信號(hào)，這些信號(hào)與細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)、基因表達(dá)和細(xì)胞生理有關(guān)，最終得到樣本群中的細(xì)胞理化特性，從而能夠?qū)?fù)雜體系中的樣品進(jìn)行精確的定量分析和影像分析［7］。

1.2.2 分選型流式細(xì)胞儀 分選型流式細(xì)胞儀除含有分析型流式細(xì)胞儀的系統(tǒng)外，還配備了分選模塊，可同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和細(xì)胞分類分選。分選型流式細(xì)胞儀通過(guò)在噴嘴上引入輕微振動(dòng)，當(dāng)射流從噴嘴出來(lái)時(shí)，在射流表面上產(chǎn)生小波，使其在激光交叉點(diǎn)下游破裂成規(guī)則的液滴，從而能夠?qū)颖局械陌邢蚣?xì)胞進(jìn)行分離和回收。分選不會(huì)對(duì)被處理的微粒造成損害，也不會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性和功能產(chǎn)生任何影響，因此可用于后續(xù)的功能性實(shí)驗(yàn)［8-9］。

2 流式細(xì)胞術(shù)在農(nóng)作物研究中的應(yīng)用

2.1 農(nóng)作物種質(zhì)資源基因組分析

流式細(xì)胞術(shù)在植物研究中最重要的應(yīng)用之一是細(xì)胞核DNA 含量的測(cè)定，通過(guò)分析可以得出目標(biāo)植物的基因組大小、細(xì)胞周期、遺傳倍性水平，以及對(duì)目標(biāo)細(xì)胞核進(jìn)行精準(zhǔn)分選等［10-15］。張俊環(huán)等［16］應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)普通杏、遼杏、西伯利亞杏、紫杏和仁用杏5 個(gè)種或類型的13 個(gè)杏品種資源的基因組大小進(jìn)行測(cè)定，首次揭示了杏屬植物不同種和品種間基因組大小存在差異，為后續(xù)杏基因組大小與其種間分化、表型性狀及植物學(xué)分類研究奠定基礎(chǔ)。李雯雯等［17］利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定新疆野杏染色體倍性和DNA 含量，所采集的野杏均為二倍體，同時(shí)篩選出最適合杏的解離液。流式細(xì)胞術(shù)在種質(zhì)資源鑒定中扮演著重要角色［18］。Burson 等［19］利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了568 份黃樟草種質(zhì)資源，研究結(jié)果表明，黃樟草存在多種不同的倍性，明確了不同黃樟草種質(zhì)資源內(nèi)在的差異，也為黃樟草的開發(fā)利用以及種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

2.2 植物原生質(zhì)體分析與單細(xì)胞測(cè)序

植物原生質(zhì)體在很多研究中被認(rèn)為是完整植物細(xì)胞的理想模型，其包含完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可用于研究植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理功能和次生代謝產(chǎn)物等?？蓱?yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析和分選目標(biāo)原生質(zhì)體進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)，對(duì)開展原生質(zhì)體研究相關(guān)工作均具有重要意義。Luria 等［20］使用活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）探針測(cè)定擬南芥和番茄成熟花粉的萌發(fā)頻率，發(fā)現(xiàn)高ROS 花粉的萌發(fā)頻率是低ROS 花粉的35 倍，同時(shí)證明使用流式細(xì)胞術(shù)研究花粉應(yīng)激反應(yīng)期間的代謝變化具有很好的潛力。隨著科研方法和技術(shù)手段的進(jìn)步，近年來(lái)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在微生物學(xué)、篩選動(dòng)物細(xì)胞單克隆等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用［21］。植物細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序在很大程度上依賴流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行分離純化得到原生質(zhì)體［22］。為獲得玉米穗的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，Xu 等［23］應(yīng)用流式細(xì)胞儀獲得純化后的玉米穗原生質(zhì)體并進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。Dreissig 等［24］利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行單細(xì)胞分選研究大麥花粉，評(píng)估每條染色體上的重組位點(diǎn)數(shù)量和位置，驗(yàn)證了細(xì)胞學(xué)假設(shè)。

2.3 農(nóng)作物抗逆研究

植物在自然界不同生境中需要應(yīng)對(duì)各式各樣的環(huán)境脅迫，包括高溫、低溫、土地鹽堿化、干旱、病蟲害和環(huán)境污染等。一般植物可通過(guò)自身強(qiáng)大的抗逆能力調(diào)節(jié)基因表達(dá)，如合成抗凍蛋白、滲透調(diào)節(jié)蛋白等抗逆蛋白質(zhì)［25］。目前有關(guān)植物內(nèi)在抗逆調(diào)節(jié)的分子機(jī)制尚不清晰。利用流式細(xì)胞儀在檢測(cè)方面的強(qiáng)大功能，選擇合適的熒光染料與抗逆因子或抗病因子相結(jié)合，從而檢測(cè)出抗逆基因表達(dá)的潛在途徑［26］。同時(shí)流式細(xì)胞儀也可應(yīng)用于植物病原微生物的檢測(cè)，主要是利用特異性抗體識(shí)別病原體，通過(guò)測(cè)定特異的熒光表達(dá)量或者代謝產(chǎn)物等評(píng)估病原菌的生存能力或活力［27］。

3 流式細(xì)胞術(shù)在畜牧研究中的應(yīng)用

3.1 動(dòng)物免疫檢測(cè)分析

流式細(xì)胞術(shù)在動(dòng)物免疫檢測(cè)分析，尤其是免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)和細(xì)胞因子檢測(cè)方面應(yīng)用也很廣泛［28］。楊蕾芳等［29］利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠感染附紅細(xì)胞后細(xì)胞因子CD4、IL-17 等的表達(dá)變化，結(jié)果表明Th17 細(xì)胞在小鼠感染附紅細(xì)胞后增多，由此推測(cè)此過(guò)程中Th17 細(xì)胞發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)。流式細(xì)胞術(shù)也可用于快速分析異質(zhì)細(xì)胞群，可以從混合物中識(shí)別多個(gè)表型亞群，選擇單個(gè)細(xì)胞，甚至可以分離該細(xì)胞用于表征免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)疾病。有研究者使用流式細(xì)胞術(shù)比較荷爾斯泰因奶牛和荷爾斯泰因小牛之間以及荷斯坦奶牛分娩前后的外周血白細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與成熟奶牛相比，小牛白細(xì)胞的CD3 淋巴細(xì)胞、γδ T 細(xì)胞、CD8+γδT 細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例更高。相反，奶牛淋巴細(xì)胞的CD4 和CD8 T 細(xì)胞以及B 細(xì)胞的比例高于小牛淋巴細(xì)胞，利用該技術(shù)可以更好地了解牛的免疫系統(tǒng)以及影響奶牛免疫的相關(guān)疾?。?0］。因此，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)動(dòng)物淋巴細(xì)胞各亞群的數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，可監(jiān)控動(dòng)物的免疫狀態(tài)并及時(shí)制定預(yù)防機(jī)制，避免各種傳染病的傳播。

3.2 動(dòng)物機(jī)體微量元素檢測(cè)

微量元素是動(dòng)物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，直接參與機(jī)體大量的生理、生化活動(dòng)，對(duì)動(dòng)物的新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育及生產(chǎn)性能影響較大。研究微量元素對(duì)畜禽生產(chǎn)性能的影響，對(duì)提高微量元素的利用率、減少排放和控制環(huán)境污染具有重要意義。流式細(xì)胞儀對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)的微量元素的檢測(cè)具有重要作用。彭西等［31］利用流式細(xì)胞術(shù)研究日糧中硒對(duì)雛雞免疫功能影響的機(jī)理發(fā)現(xiàn)，日糧硒水平達(dá)到5 mg/kg 以上會(huì)導(dǎo)致免疫器官細(xì)胞分裂增殖能力下降、凋亡細(xì)胞增多；外周血T 淋巴細(xì)胞增殖能力降低，CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T 細(xì)胞數(shù)量下降，進(jìn)而導(dǎo)致免疫器官生長(zhǎng)發(fā)育受阻，出現(xiàn)病理?yè)p傷，嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育。Wu 等［32］通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)等方法揭示了硒對(duì)黃曲霉毒素誘導(dǎo)的肉雞肝臟發(fā)病具有保護(hù)作用，并揭示了黃曲霉毒素在細(xì)胞和分子水平上誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，流式細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示，0.4 mg/kg 硒能改善afb1 誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞凋亡。Fasil 等［33］采用流式細(xì)胞術(shù)定量測(cè)定斑馬魚細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，分析探討硒納米顆粒（SeNPs）和氧化鋅納米顆粒（ZnONPs）對(duì)斑馬魚體內(nèi)ROS 產(chǎn)生的影響，細(xì)胞內(nèi)ROS 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在不同濃度SeNPs+ZnONPs（2 mg/kg）聯(lián)合處理和對(duì)照的斑馬魚中，SeNPs+ZnONPs 聯(lián)合給藥比單獨(dú)給藥產(chǎn)生的ROS 更少。

3.3 精子質(zhì)量控制和性別控制

流式細(xì)胞術(shù)可以用于動(dòng)物精子質(zhì)量控制和動(dòng)物性別控制方面的研究。利用流式細(xì)胞術(shù)可以對(duì)精子類型進(jìn)行選擇，產(chǎn)生符合期望的性別后代，從而促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展。哺乳動(dòng)物（家畜）中的后代性別主要由父本的X/Y 染色體決定，X 精子的DNA 含量比Y 精子多3.0%～4.5%，據(jù)此可以利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物的精子進(jìn)行分離，獲得高純度的X、Y 精子群，從而達(dá)到控制動(dòng)物性別的目的。該方法具有分離速度快、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)方法對(duì)精子活力、胚胎和后代發(fā)育造成損傷的缺點(diǎn)［34］。研究表明，利用流式細(xì)胞術(shù)分離精子，可以達(dá)到8 000 個(gè)/s 的分離速度，純度可達(dá)到90%左右。目前流式細(xì)胞術(shù)已在生產(chǎn)上應(yīng)用于各種哺乳動(dòng)物的精子分離，包括牛、豬、馬、綿羊、山羊、狗、貓、鹿、麋鹿、海豚、水牛等［35］。該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用對(duì)畜牧業(yè)育種具有重要意義。

3.4 霉菌毒素毒性作用分析

霉菌毒素對(duì)畜牧業(yè)是一種非常嚴(yán)重的危害［36-38］，一方面帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，另一方面嚴(yán)重危害人畜健康。由于流式細(xì)胞術(shù)具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于霉菌毒素檢測(cè)及細(xì)胞毒性研究中。流式細(xì)胞術(shù)可以用于計(jì)數(shù)細(xì)胞以及檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，通過(guò)特定的染料還可以用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生理狀態(tài)。目前已研制出多種染色劑來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞功能，比如細(xì)胞繁殖能力、代謝活動(dòng)、膜活動(dòng)以及膜電位等。隨著DNA 染料的不斷發(fā)展、細(xì)胞周期階段標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)以及新技術(shù)的出現(xiàn)，流式細(xì)胞術(shù)一直是細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡研究的首選技術(shù)。因此，可以通過(guò)檢測(cè)各細(xì)胞周期中DNA 含量的改變，得到不同時(shí)期細(xì)胞的分布比例，從而研究霉菌毒素對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響［39-40］。Kwon 等［41］利用流式細(xì)胞術(shù)分析EGR-1 基因敲除對(duì)霉菌毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，毒素通過(guò)增加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子EGR-1 的磷酸化而提高ATF3 的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活。Fraeyman 等［42］利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)鐮刀菌毒素等進(jìn)行分析，通過(guò)檢測(cè)IPEC-J2 細(xì)胞活力、凋亡、凋亡/壞死的百分比分布來(lái)評(píng)估真菌毒素對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞毒性影響。流式細(xì)胞術(shù)不僅可以對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，還能夠根據(jù)細(xì)胞DNA 含量變化、線粒體膜電位和通透性的變化以及胞內(nèi)ROS 等指標(biāo)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行高通量分選，為霉菌毒素毒性作用分析提供了有力依據(jù)。

4 流式細(xì)胞術(shù)在農(nóng)業(yè)病原微生物研究中的應(yīng)用

4.1 病原菌分析

流式細(xì)胞術(shù)已被用于快速區(qū)分和鑒定微生物細(xì)胞、快速評(píng)估細(xì)胞活力和多種生理特性、分析抗微生物藥物-細(xì)胞相互作用、分離高產(chǎn)菌株等，并已成功用于多種病例。對(duì)于菌血癥、細(xì)菌尿癥等病癥，利用流式細(xì)胞術(shù)既能快速發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致感染的微生物，又能根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)特征初步判斷微生物種類。流式細(xì)胞術(shù)可以快速采集樣品中細(xì)胞群的多種參數(shù)，能夠從不同樣品中檢測(cè)和分離病原體的抗體和RNA 探針，并從樣品基質(zhì)中回收和區(qū)分細(xì)菌，區(qū)分總種群中的活細(xì)菌、受損或死亡的細(xì)菌細(xì)胞。使用特定的熒光染料還可以更深入地了解活細(xì)菌細(xì)胞的生理狀態(tài)和代謝活動(dòng)［43］。在厭氧條件下使用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分選技術(shù)，能夠從糞便材料中檢測(cè)、分離和培養(yǎng)新的腸道共生菌種菌株。該方法可以快速分析微生物種群，同時(shí)可以使用特異性抗體對(duì)極度氧敏（Extremely Oxygen Sensitive，EOS）菌進(jìn)行分類、分離和培養(yǎng)新的普氏菌和細(xì)枝桿菌菌株，為培養(yǎng)組學(xué)開辟了新途徑［44］。另外，流式細(xì)胞術(shù)可以準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞外細(xì)菌和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌，對(duì)于闡明病原體觸發(fā)的宿主細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制具有重要意義［45］。流式細(xì)胞術(shù)在食源性病原體檢測(cè)中的應(yīng)用也很廣泛。Wang 等［46］基于流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)對(duì)特異性抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記可快速和多重檢測(cè)牛肉樣品中的食源性病原體如沙門氏菌、大腸桿菌O157 和福氏鏈球菌的單細(xì)胞。Liu 等［47］通過(guò)高選擇性的熒光標(biāo)記抗體和碘化丙啶識(shí)別活的金黃色葡萄球菌細(xì)胞，再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，可以有效監(jiān)測(cè)金黃色葡萄球菌污染，可應(yīng)用于快速檢測(cè)牛奶和乳制品中的微生物。

4.2 病毒分析

病毒可以利用宿主因子進(jìn)入細(xì)胞并引起疾病。研究病毒的入侵和復(fù)制階段以及它們與宿主因素的相互作用是全面了解病毒感染的關(guān)鍵，對(duì)病毒性疾病的基礎(chǔ)研究以及抗病毒產(chǎn)品在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用至關(guān)重要［48］。流式細(xì)胞術(shù)可用于分析病毒與細(xì)胞之間的相互作用，可以檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)和表面的病毒抗原。通過(guò)使用特異性識(shí)別細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原的單克隆抗體，利用流式細(xì)胞術(shù)可以快速檢測(cè)并定量受感染細(xì)胞，該技術(shù)現(xiàn)已用于診斷一系列病毒，包括導(dǎo)致流感［49］、雞新城疫［50］、非洲豬瘟［51］和牛結(jié)核?。?2］等的病毒。流式細(xì)胞術(shù)還可用于記錄受病毒感染植物細(xì)胞間層面的感染狀態(tài)，能夠精準(zhǔn)測(cè)量植物細(xì)胞被單種病毒或多種病毒感染的情況，以及受多種病毒變體感染的細(xì)胞在時(shí)空上的分布。Tromas 等［53］利用流式細(xì)胞術(shù)分析煙草花葉病毒的細(xì)胞感染速率。流式細(xì)胞術(shù)已被用于表征細(xì)胞群并檢查其內(nèi)部分子和過(guò)程，通常用于研究整個(gè)感染細(xì)胞內(nèi)的病毒標(biāo)記物。流式細(xì)胞術(shù)不僅用于檢測(cè)還可用于純化細(xì)胞內(nèi)病毒的成熟中間體，這為病毒學(xué)研究衣殼組裝、成熟和釋放、分析突變表型以及確定與特定病毒中間體相關(guān)的宿主因子開辟了新的研究途徑［54］。流式細(xì)胞術(shù)還可以應(yīng)用于病毒核酸樣本的測(cè)序［55］和病毒滴度的定量檢測(cè)［56］，在病毒培養(yǎng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)病毒滴度和細(xì)胞系的狀態(tài)對(duì)于開展疫苗生產(chǎn)及其優(yōu)化非常重要。Schulze-Horsel等［57］認(rèn)為，流式細(xì)胞術(shù)是研究培養(yǎng)條件和工藝變化對(duì)病毒復(fù)制和病毒產(chǎn)量影響的有價(jià)值的工具，對(duì)監(jiān)測(cè)生物反應(yīng)器病毒感染以及對(duì)于疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的工藝表征和再現(xiàn)性研究也是靈敏、可靠的方法。

5 展望

流式細(xì)胞術(shù)是目前對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行綜合和多重分析最有效可行的技術(shù)，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。隨著光電技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，流式細(xì)胞儀已開始向模塊化發(fā)展，即其光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)器單元和電子系統(tǒng)都可以按照實(shí)驗(yàn)要求隨意更換。隨著新型多功能流式細(xì)胞儀以及新型特異探針的開發(fā)，流式細(xì)胞術(shù)的功能也將更強(qiáng)大、數(shù)據(jù)也將更精確；流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小顆粒的檢測(cè)能力也越來(lái)越強(qiáng)，打破了傳統(tǒng)檢測(cè) 0.5～50 μm 的顆粒檢測(cè)范圍，目前可以達(dá)到0.1 μm 的檢測(cè)精度，極大拓寬其應(yīng)用范圍，使其還可應(yīng)用于微囊泡（外泌體）的分析與分選、細(xì)菌和微生物研究等方面。目前流式細(xì)胞術(shù)在植物研究中的應(yīng)用主要集中在細(xì)胞核DNA 含量的測(cè)定，在線粒體、葉綠體、花粉等應(yīng)用研究較少。由于植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與組成存在多樣性和復(fù)雜性，很大程度上限制了流式細(xì)胞術(shù)在植物研究中的應(yīng)用。如何能夠分離純化出適合流式細(xì)胞儀分析和分選的單細(xì)胞顆粒懸浮液，是未來(lái)植物流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵前提。流式細(xì)胞儀在動(dòng)物疫病檢測(cè)、精子分選和性別控制等方面已被廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)能夠?qū)ι飿悠愤M(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析處理并實(shí)現(xiàn)高通量篩選。流式細(xì)胞術(shù)雖在微生物研究中開始得比較晚，但目前已經(jīng)發(fā)展了多種對(duì)病原菌進(jìn)行快速篩查以及分離純化的方法，在病毒感染分析與診斷方面，具有特異性好、靈敏度高、操作能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

此外，單細(xì)胞測(cè)序方法（Single Cell Sequencing，SNS）可以準(zhǔn)確定量單個(gè)細(xì)胞的基因組，能夠避免混合樣本的均質(zhì)化掩蓋單細(xì)胞的異質(zhì)性，可以在單細(xì)胞水平下深入探索細(xì)胞狀態(tài)，因此被評(píng)為2014 年度 Nature Methods 最重要的方法學(xué)進(jìn)展。但是單細(xì)胞研究有兩大技術(shù)難點(diǎn)，即對(duì)單細(xì)胞的精準(zhǔn)捕獲、對(duì)低豐度單細(xì)胞核酸高分辨率的測(cè)序，而流式細(xì)胞術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)分析大量細(xì)胞，并且進(jìn)行單細(xì)胞分選，將單個(gè)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)和細(xì)胞功能三者有機(jī)結(jié)合，與上下游進(jìn)行無(wú)縫銜接，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)成為單細(xì)胞獲取的主流技術(shù)，具有成熟的標(biāo)準(zhǔn)操作方案。隨著純化技術(shù)和標(biāo)記熒光染料的不斷開發(fā)與完善，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)必將有廣泛的應(yīng)用前景。綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)由于其諸多優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用前景將越來(lái)越廣闊，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中也會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。