徐亞男， 劉懿萱， 劉亮亮， 王 淼， 姜 軍， 樸炫春

(延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

狼毒大戟(EuphorbiafischerianaSteud)是大戟科大戟屬多年生草本植物，主要分布于東北、河北等地區(qū)，國外蘇聯(lián)西伯利亞地區(qū)也有分布。全株均有毒性，根毒性最大[1]。全草含刺激性乳汁，皮膚接觸后，能引起水泡。其含有多種藥用成分，包括萜類[2]、多糖[3]等。多用作治療淋巴結(jié)結(jié)核，骨結(jié)核，皮膚結(jié)核等疾病，具有極高的藥用價值。然而，狼毒大戟的野生資源逐年減少，加之尚未建立人工栽培體系，使植物材料較為缺乏，導致其深入研究和產(chǎn)品開發(fā)及生產(chǎn)受到限制。植物細胞或器官培養(yǎng)為一種可替代植物資源傳統(tǒng)生產(chǎn)的方法之一，可在短期內(nèi)獲得大量植物材料。該實驗室在前期研究中，已經(jīng)從狼毒大戟葉片中成功誘導出狼毒大戟愈傷組織，且發(fā)現(xiàn)狼毒大戟愈傷組織中含有較多的多糖，表明其存在潛在的應用價值。

植物多糖是植物體內(nèi)的一種活性成分，隨著研究的深入，植物多糖逐漸被人們重視，在近年研究中，植物多糖被證實有降血脂[4-5]、抗氧化[6-7]、抗炎[8-9]等作用。目前，多糖的提取方法主要有超聲提取法[10-11]、酸堿提法[12-13]、生物酶提法[14-15]等，與上述方法相比，閃式提取法具有用時短、效率高等優(yōu)點[16-17]。閃式提取是一種應用于植物組織破碎的新式提取方法，主要由控制系統(tǒng)、電動機、刀盤、提取罐和底座組成，利用高速機械剪刀和超動分子滲透技術(shù)對植物的根、莖、葉進行提取，將組織磨碎至超微顆粒，使各種成分達到細胞內(nèi)外平衡，從而達到提取的目的，其用時短，通常30 s能夠完成，對植物成分破壞小，且除揮發(fā)性溶劑，如乙醚外，其他溶劑均可使用[18]。目前，許多植物已經(jīng)建立了閃式提取的提取工藝，如隋志方等[19]進行了代代花的閃式提取，優(yōu)化的條件為液料比21∶1 (mL∶g)，提取電壓145 V，提取時間100 s，此條件下的黃酮得率為10.81%；葉潤等[20]以油茶葉為試驗材料，研究提取時間、液料比和提取溫度對多糖得率的影響，篩選出的閃式提取條件為液料比30∶1 (mL∶g)，提取溫度81 ℃，提取時間75 s，此條件下，油茶葉多糖得率為8.43%；馮素香等[21]以連翹為試驗材料，研究乙醇濃度、液料比、提取時間對提取物中連翹苷含量的影響，從而篩選出最佳提取工藝為電壓120 V，液料比10∶1 (mL∶g)，提取1 min，提取2次，此條件下連翹苷的含量為4.50 mg/g。

提取工藝的優(yōu)化常常與響應面法結(jié)合。響應面法是一種建模方法，最早是由數(shù)學家Box和Wilson于1951年提出來的[22]，是通過一系列確定性的“試驗”擬合一個響應面來模擬真實極限狀態(tài)曲面，其基本思想是假設一個包括一些未知參量的極限狀態(tài)函數(shù)與基本變量之間的解析表達式代替實際的不能明確表達的結(jié)構(gòu)極限狀態(tài)函數(shù)。它允許優(yōu)化指定變量，例如在植物材料提取中，可以同時估計幾個不同的自變量來獲得具有最高水平的提取物。響應面方法已應用于辣木葉[23]、赤瓟子[24]、唐古特白刺果實[25]、暴馬丁香[26]和紫薯[27]等植物的提取工藝優(yōu)化中。

該研究為了將狼毒大戟愈傷組織多糖應用于實際生產(chǎn)中，利用閃式提取法，采用響應面設計對閃式提取的液料比、提取時間以及提取溫度條件進行了優(yōu)化，并測定優(yōu)化后的狼毒大戟愈傷組織多糖的DPPH自由基清除能力，這對今后狼毒大戟愈傷組織多糖的工業(yè)化提取具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

將野生狼毒大戟莖葉經(jīng)無菌消毒后誘導出愈傷組織，將10 g/L新鮮的愈傷組織接種于5 L反應器內(nèi)(含有4 L的培養(yǎng)液)，培養(yǎng)液配比為MS+1.5 mg/L BA+0.2 mg/L NAA+20 g/L蔗糖，pH值調(diào)節(jié)為5.8，通氣量為0.1 vvm，25 ℃條件下光培養(yǎng)21 d后，進行收獲，收獲的細胞用自來水清洗后，置于45 ℃恒溫干燥箱中烘干48 h，即得狼毒大戟愈傷組織干品。將上述干品研磨，過80目篩，粉末密封保存，備用。

1.2 儀器與藥品

JA2002電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；JHBE-50T閃式提取儀(上海釩幟精密設備有限公司)；YHW-1103遠紅外鼓風干燥箱(中國天津市華北實驗儀器有限公司)；UV1102紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)；所用試劑苯酚、硫酸、無水甲醇購于天津市科密歐化學試劑有限公司，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine, DPPH)、維生素C(Vitamin C, VC)、葡萄糖購于上海源葉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖提取的單因素試驗

1) 液料比的篩選

稱取狼毒大戟愈傷組織粉末5.00 g，置于250 mL三角瓶中，固定提取時間40 s，利用閃式提取儀進行提取，液料比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 (mL∶g)(溶劑為蒸餾水)，所得液體濾紙過濾，烘干箱烘干，測定提取物中總多糖含量，篩選出最適液料比。

2) 提取時間的篩選

稱取狼毒大戟愈傷組織粉末5.00 g，置于250 mL三角瓶中，固定液料比40∶1 (mL∶g)，利用閃式提取儀進行提取，提取時間為30、40、50、60和70 s，所得液體濾紙過濾，烘干箱烘干，測定總多糖含量，篩選出最適提取時間。

3) 提取溫度的篩選

稱取狼毒大戟愈傷組織粉末5.00 g，置于250 mL三角瓶中，固定液料比40∶1 (mL∶g)、提取時間50 s，利用閃式提取儀進行提取，提取溫度分別為30，40，50，60和70 ℃，所得液體濾紙過濾，烘干箱烘干，測定總多糖含量，篩選出最適提取溫度。

1.3.2 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以液料比(X1)，提取時間(X2)，提取溫度(X3)3個因素為自變量，依據(jù)Box-Behnken法進行3因素3水平試驗設計(表1)，共計17個組合。按照各組合條件進行閃式提取，以提取物中總多糖含量為響應值。最后，對優(yōu)化組合進行3次重復的驗證試驗，確定最佳提取工藝。

表1 響應面試驗因素及水平

1.4 總多糖含量測定

參照Ye等[28]測定多糖的含量。制作多糖標準曲線，精密稱取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，溶解定容至100 mL容量瓶中，即濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖溶液。將該溶液稀釋為0.010、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125和0.150 mg/mL。分別取1 mL于試管中，加入1 mL 5%苯酚，再加入5 mL濃硫酸，室溫放置30 min，空白對照為蒸餾水。利用紫外分光光度計在490 nm處測定吸光值，繪制標準曲線。

稱取狼毒大戟愈傷組織提取物干品100 mg，加蒸餾水定容至100 mL，即得1.0 mg/mL的待測樣品溶液。取0.5 mL于試管中，加入0.5 mL蒸餾水，1 mL 5%苯酚，再加入5 mL濃硫酸，室溫放置30 min，此時溶液變?yōu)槌赛S色，呈微稠狀。在490 nm處測定吸光值，計算多糖的含量。

總多糖含量/(mg·g-1)=(CDf)/W，

式中,C為樣品溶液的葡萄糖濃度(mg/mL)；D為稀釋倍數(shù)；f為換算因子；W為樣品重量(g)。

1.5 清除DPPH自由基活性測定

參考陳琦[29]對DPPH自由基清除能力進行測定，并稍加改動。稱取40 mg利用響應面最優(yōu)條件提取的粗多糖提取物(CE)置于離心管，用甲醇定容至10 mL，使樣品最終濃度為4.0 mg/mL，將準備好的上述溶液用二倍稀釋法稀釋至濃度為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL的待測定樣溶液樣品，VC為陽性對照，配置方法同樣品配置方法。稱取DPPH粉末0.003 9 g，用甲醇定容至100 mL。將2 mL待測樣品溶液與2 mL的DPPH溶液混合，作為待測樣品組。用2 mL甲醇代替待測樣品，作為空白對照。避光靜置30 min后，溶液呈淡紫色，用紫外分光光度計在517 nm下測定吸光值，DPPH自由基清除率計算如下。

清除率=(A空-A樣)/A空×100%，

式中，A空為空白對照組吸光值，A樣為待測樣品組吸光值。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗進行3次重復，數(shù)值為平均值±標準偏差。使用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行單因素試驗中顯著性差異分析、GraphPad Prism 8.0軟件繪制單因素試驗及DPPH自由基清除試驗圖，使用Design Expert 10.0進行響應面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對提取物中總多糖含量的影響

由圖1可知，總多糖含量隨著液料比的升高而升高，當液料比為40∶1 (mL∶g)時，總多糖含量最高，液料比繼續(xù)升高，總多糖含量并沒有繼續(xù)上升，可能是溶劑少使閃式提取儀攪拌器的阻力過大，影響轉(zhuǎn)速。液料比高，溶劑過多，閃式提取儀攪拌器刀片不能充分與物質(zhì)接觸，不利于多糖的提取。

2.1.2 提取時間對提取物中總多糖含量的影響

由圖2可知，在狼毒大戟愈傷組織多糖提取過程中，隨著提取時間的增加，總多糖含量逐漸上升，在提取時間為50 s時，提取物總多糖含量最高，達到373.20 mg/g，隨著提取時間的增加，總多糖含量并沒有繼續(xù)上升，無顯著性差異。因此，50 s為最適合狼毒大戟愈傷組織粗多糖提取的時間。

注：數(shù)值為平均值 標準偏差(n=3)。不同字母表示0.05水平上差異顯著，下同。

圖2 提取時間對總多糖含量的影響

2.1.3 提取溫度對提取物中總多糖含量的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，總多糖含量逐漸上升，在50 ℃時，總多糖含量達到最高。溫度是影響多糖溶解速度的重要因素，溫度低，物質(zhì)流動速度慢，溫度高破壞多糖結(jié)構(gòu)。因此，由試驗結(jié)果可知，50 ℃是最有利于狼毒大戟愈傷組織粗多糖提取的溫度。

2.2 響應面法優(yōu)化提取工藝

在上述單因素試驗的基礎上，利用響應面分析法的Box-Behnken Design方法，進行了3因素3水平的試驗設計。結(jié)果表明，不同試驗組提取物中的總多糖含量有很大差異(表2)。以各試驗組總多糖含量作為響應值建立了響應面設計模型，經(jīng)多元擬合回歸分析，得到二次回歸模型方程：

Y=420.97-0.97X1+4.62X2+6.04X3+0.56X1X2+1.87X1X3-17.16X2X3-62.26X12-42.34X22-14.14X32，

式中，X1、X2、X3分別代表液料比、提取時間、提取溫度，Y為總多糖含量預測值。

圖3 提取溫度對總多糖含量的影響

表2 響應面試驗設計與結(jié)果

F值從大到小的順序為提取溫度(F=6.15)，液料比(F=3.60)，提取時間(F=0.11)，說明對總多糖含量影響最大的是提取溫度，其次是液料比，提取時間的影響最小(表3)。

表3 方差分析結(jié)果

響應面分析法中，用試驗數(shù)據(jù)繪制多元二次回歸方程，進而預測最優(yōu)工藝參數(shù)。該研究對狼毒大戟愈傷組織粗多糖閃式提取的3因素3水平進行了響應面分析，結(jié)果表明，回歸模型充分擬合試驗數(shù)據(jù)，因此，用此模型分析結(jié)果可用于提取工藝的優(yōu)化。

回歸模型給出的最佳提取工藝參數(shù)為液料比39.967∶1 (mL∶g)，提取時間50.128 s，提取溫度52.034 ℃。該研究通過3次獨立試驗對此工藝進行了驗證。從表4可以看出，3次重復試驗的總多糖含量為423.26、418.69和419.67 mg/g，相對標準偏差(RSD)為0.57%，表明3次重復試驗結(jié)果穩(wěn)定，且與預測值吻合。因此，該研究中響應面分析所預測的最優(yōu)組合可用于實際提取工藝中。

表4 驗證試驗結(jié)果

2.3 清除DPPH自由基能力

按照上述提取工藝優(yōu)化后的條件對狼毒大戟愈傷組織進行提取。如圖4所示，隨著提取物濃度上升，DPPH自由基清除率逐漸上升，當提取物濃度上升至2 mg/mL時，清除率達到95%，濃度繼續(xù)上升，清除率保持穩(wěn)定。

圖4 提取物清除DPPH自由基能力

3 討論與結(jié)論

到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了許多技術(shù)來提取植物中的化合物，包括熱回流提取、索氏提取等傳統(tǒng)技術(shù)和超聲輔助提取、脈沖電場提取等新興技術(shù)，與新興技術(shù)相比，傳統(tǒng)技術(shù)耗時、耗能和溶劑消耗高[30]。新興技術(shù)也存在不可忽視的問題，由于技術(shù)和理論研究不夠充分，儀器復雜和操作成本相對較高，這些技術(shù)的工業(yè)應用仍處于萌芽階段。閃式提取可以有效解決上述問題，不僅能夠在極短的時間內(nèi)實現(xiàn)高產(chǎn)，操作簡單，設備便宜，而且具有較高的工業(yè)實踐性。到目前為止，閃式提取已被應用于提取植物中含有的初級代謝物和次級代謝物[31]，賀石麟等[32]以淫羊藿苷和總黃酮含量為指標，通過正交試驗得出閃式提取法提取其淫羊藿苷和總黃酮的最優(yōu)條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝為液料比25∶1(mL∶g)，提取3次，提取時間10 min；陳克家等[33]利用閃式提取儀提取竹葉，結(jié)果表明，竹葉多糖閃式提取的最佳工藝條件為提取時間170 s，提取電壓180 V，在此條件下進行提取，所得到竹葉多糖的提取量為34.02 mg/g；楊云等[34]利用閃式提取儀天麻總酚，閃式提取最佳條件為提取時間2 min，液料比40∶ 1(mL∶g)，乙醇體積分數(shù)20%，在最佳提取條件下得到的天麻總酚含量為35.25 mg·GAE g-1。與上述試驗結(jié)果相比，該試驗處理時間較短，料液比則與上述結(jié)果相似，可能是試驗材料不同，所以提取時間差異較大。

該試驗采用響應曲面法優(yōu)化了狼毒大戟愈傷組織粗多糖的提取工藝，通過單因素試驗，液料比、提取時間、提取溫度各因素在單一因素變化的情況下的最優(yōu)值。在單因素試驗結(jié)果基礎上，用響應面法對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，建立液料比、提取時間、提取溫度和多糖含量的二次回歸方程模型。經(jīng)驗證，該數(shù)學模型可靠，可用于狼毒大戟愈傷組織粗多糖的提取優(yōu)化工藝參數(shù)的預測。結(jié)合單因素試驗、響應面試驗和驗證試驗確定狼毒大戟愈傷組織粗多糖閃式提取的提取工藝參數(shù)為：液料比39.967∶1(mL∶g)，提取時間50.128 s，提取水溫52.034 ℃，在此條件下，狼毒大戟愈傷組織中提取物總多糖含量為420.54 mg/g，當提取物濃度為2 mg/mL時，DPPH自由基清除率達到95%。該試驗為狼毒大戟愈傷組織的進一步應用提供理論依據(jù)。