張晴晴， 邢何歡， 龍昌輝， 劉 轉(zhuǎn)

(1.亳州學(xué)院中藥學(xué)院，安徽 亳州 236800；2.安徽天凱生物科技有限公司，安徽 滁州 239500)

薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)為唇形科薄荷屬的一種具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的芳香植物[1-2]。薄荷中的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類、有機(jī)酸類、萜類、黃酮類等，其中，黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗衰老、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用[3-5]。薄荷黃酮顯著的生理活性引起了人們的關(guān)注，而人體不能直接合成黃酮類化合物，只能通過(guò)食物、藥品獲得。因此，如何從薄荷中提取具有生理活性的薄荷黃酮成為研究和開(kāi)發(fā)利用的熱點(diǎn)[6-8]。

目前薄荷中黃酮類化合物的提取工藝主要采用有機(jī)溶劑提取法、微波萃取法、超臨界CO2萃取技術(shù)和超聲波提取法[9-13]。其中，超臨界CO2流體萃取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的一種新型提取分離的技術(shù)方法，該法具有無(wú)溶劑殘留、萃取能力強(qiáng)、提取效率高、活性成分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解破壞、安全廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，此法符合當(dāng)今人們倡導(dǎo)綠色、環(huán)保理念，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，該技術(shù)已在黃酮類成分的提取中得到廣泛應(yīng)用[14-20]。丁麗娜等[19]采用超臨界CO2萃取法從沙棘果油中提取18種黃酮類化合物，表明該技術(shù)具有低溫提取、無(wú)有毒殘溶和可以選擇性分離的特點(diǎn)。Lingzhao等[20]用超臨界CO2萃取技術(shù)從野葛中萃取出黃酮類化合物，并對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行了優(yōu)化。采用超臨界CO2萃取技術(shù)萃取薄荷黃酮鮮少報(bào)道，因此，該研究采用超臨界CO2萃取技術(shù)萃取薄荷中的黃酮類化合物，利用正交試驗(yàn)確定其最佳萃取工藝，采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)薄荷中的黃酮類化合物進(jìn)行成分分析。該研究旨在獲取薄荷黃酮較高提取率的同時(shí)，減少萃取過(guò)程對(duì)環(huán)境的污染，從而為薄荷資源的深度開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

薄荷的干燥地上部分(亳州康美中藥材大市場(chǎng))。

1.2 試劑與儀器

HA0-50-06型超臨界萃取裝置(江蘇華安超臨界萃取有限公司)；LC-20型高效液相色譜儀(島津儀器蘇州有限公司)；UV4150紫外可見(jiàn)分光光譜儀(島津儀器蘇州有限公司)；DFY-400搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；聚酰胺薄膜10×10 cm(浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠出品) ；電子天平(型號(hào)：HZK-FA210華志電子科技有限公司)；高速臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào)H1750 湖南望城經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)金穗路35號(hào))；乙腈、無(wú)水乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸等試劑均為分析醇。

1.3 方法

1) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.2 mg,放入25 mL容量瓶中，用濃度70%的乙醇定容,搖勻,放入冰箱冷卻,待用。用移液槍準(zhǔn)確吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別置于25 mL比色管中,加入濃度為70%的乙醇至10.0mL,再加入1 mL濃度為5%的NaNO2,搖勻,擱置6 min后，放入1 mL濃度為10%Al(NO3)3·9H2O,搖勻,擱置6 min,再取10 mL濃度為4%NaOH,用純化水定容,搖勻,擱置15 min。依次加入到比色皿中，放入紫外分光光譜儀中，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。

2) 薄荷中黃酮類化合物的提取方法 將薄荷全草進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱取薄荷粉末200 g裝入萃取釜中，設(shè)置萃取溫度和分離溫度，當(dāng)萃取和分離溫度均達(dá)到設(shè)定溫度，制冷溫度在5 ℃以下，打開(kāi)堵頭裝料，調(diào)節(jié)閥門使萃取壓力和儲(chǔ)罐壓力相等。開(kāi)啟CO2泵，CO2由壓縮機(jī)壓縮進(jìn)入萃取釜，達(dá)到設(shè)定壓力且穩(wěn)定后，加入一定濃度的夾帶劑(乙醇)進(jìn)行超臨界萃取，每間隔30 min從出口處收集萃取原液，直至萃取原液收集完全。將上述萃取原液用N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，直到體積不在發(fā)生變化時(shí)。將所得濃縮液用石油醚萃取除去脂溶性雜質(zhì),收集上清液,并旋蒸蒸干,用三氯甲烷溶解,再加70%乙醇分層,取下清液,得薄荷黃酮萃取液。

將上述黃酮萃取液移取1 mL于25 mL比色管中,按照1)中所述的方法進(jìn)行配制,測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品濃度,根據(jù)下列公式計(jì)算薄荷樣品中黃酮提取率：

(1)

式中，C：黃酮萃取液濃度，mg/mL；V：萃取液體積，mL；N：稀釋倍數(shù)；M：薄荷粉末質(zhì)量，g。

3) 單因素實(shí)驗(yàn) 采用單因素試驗(yàn)，研究夾帶劑濃度、萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間的變化對(duì)薄荷中黃酮類化合物提取率的影響[21]?？疾?方面的因素，每個(gè)因素考察5個(gè)水平，每個(gè)水平試驗(yàn)3次，取其平均值，計(jì)算每個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)誤差。具體參數(shù)設(shè)置詳見(jiàn)表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)因素水平表

4) 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以?shī)A帶劑濃度A、萃取壓力B、萃取溫度C、萃取時(shí)間D為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表如表2所示，以提取率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定最佳提取工藝條件[22-25]。

表2 正交因素水平表L9(34)

5) HPLC分析黃酮類化合物 采用Compass C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(A)-3%冰醋酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～20 min，15%～33%A，20～35 min,33%～40% A)，流速為 0.5 mL/min，波長(zhǎng)檢測(cè)為284 nm，柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL[26-28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得方程A=13.295C-0.002 8(R2=0.999 9)。該方程將用以測(cè)定薄荷提取液中的薄荷黃酮提取率(圖1)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

1) 夾帶劑濃度的選擇 黃酮類化合物的極性較大，因此采用CO2作為超臨界流體進(jìn)行萃取時(shí)需要加入夾帶劑。薄荷黃酮類物質(zhì)，易溶于熱水且極性也較大，所以采用極性大的乙醇作為夾帶劑較好[18]。在萃取溫度為55 ℃、萃取壓力為25 MPa、萃取時(shí)間為90 min時(shí)，選擇夾帶劑濃度50%、60%、70%、80%和90%乙醇，考察不同夾帶劑濃度對(duì)薄荷黃酮提取率的影響(圖2)。

圖2 夾帶劑濃度對(duì)提取率的影響

由圖2可知，薄荷黃酮提取率隨夾帶劑濃度的升高呈現(xiàn)下降-升高-下降-升高的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，提取率最大。這是由于某些醇溶性雜質(zhì)等成分與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)同水分子的結(jié)合，從而導(dǎo)致提取率下降，因此，乙醇濃度應(yīng)選擇70%為宜。

2) 萃取壓力的選擇 在萃取溫度55 ℃、萃取時(shí)間90 min，夾帶劑70%乙醇，考察萃取壓力為10、15、20、25和30 MPa時(shí)，對(duì)薄荷黃酮提取率的影響(圖3)。

圖3 萃取壓力對(duì)提取率的影響

由圖3可知，萃取壓力為10～20 MPa時(shí)，提取率隨壓力增大而緩慢降低，而后隨壓力增大提取率逐漸增大，當(dāng)壓力達(dá)到25 MPa時(shí)，提取率達(dá)到最大，而后提取率隨壓力增大而減小，這可能是由于當(dāng)壓力達(dá)到一定值后隨著壓力的增大使部分薄荷原料凝結(jié)成塊導(dǎo)致提取率的下降，因此，萃取壓力選擇25 MPa為宜。

3) 萃取溫度的選擇 在萃取壓力25 MPa，萃取時(shí)間90 min，夾帶劑70%乙醇，考察萃取溫度為45、50、55、60和65 ℃時(shí)，對(duì)薄荷黃酮提取率的影響(圖4)。

圖4 萃取溫度對(duì)提取率的影響

由圖4可知，在55 ℃以下，薄荷黃酮提取率隨溫度的增加而提高，當(dāng)溫度高于55 ℃后，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是由于隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，促使溶解速度提高，有利于提取，但是當(dāng)溫度升高到一定值后，超臨界流體的密度減小，從而導(dǎo)致流體的溶解能力降低，甚至?xí)茐哪承┗瘜W(xué)成分，同時(shí)雜質(zhì)含量也會(huì)增加，從而導(dǎo)致提取率降低，這也為后續(xù)的純化帶來(lái)困難[18]。因此，萃取溫度選擇55 ℃為宜。

4) 萃取時(shí)間的選擇 在萃取溫度55 ℃、萃取壓力25 MPa，夾帶劑70%乙醇，考察萃取時(shí)間為0、60、90、120和150 min時(shí)，對(duì)薄荷黃酮提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 萃取時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖5可知，在30～90 min時(shí)，提取率隨萃取時(shí)間增加而逐漸增大，增加趨勢(shì)明顯，在萃取時(shí)間為90 min時(shí)，提取率最大，為5.394%。而后隨時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率下降，這可能是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雜質(zhì)成分的提取率也在增加，雜質(zhì)過(guò)高使萃取粘液度增大，從而導(dǎo)致薄荷黃酮的提取率降低[13]。因此，萃取時(shí)間選擇90 min為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)各單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)表2進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，影響薄荷黃酮提取的各因素影響大小順序?yàn)椋篈(夾帶劑濃度)>D(萃取時(shí)間)>C(萃取溫度)>B(萃取壓力)。且最佳提取工藝條件為：A3B2C2D3，即夾帶劑的濃度80%，萃取壓力25 MPa，萃取溫度 55 ℃，萃取時(shí)間120 min。采用上述提取條件進(jìn)行超臨界CO2萃取操作，所得提取率為5.172 %。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 HPLC分析黃酮類化合物結(jié)果

按照1.2中所述的方法利用HPLC對(duì)最佳條件下萃取的薄荷黃酮類化合物進(jìn)行定性分析[29-30]，混合對(duì)照品及樣品高效液相色譜圖(圖6)。圖6-A是3種混合對(duì)照品的HPLC圖，3種混合對(duì)照品的保留時(shí)間分別是蘆丁18.5 min、橙皮苷24.5 min、蒙花苷31.5 min。圖6-B是樣品溶液的HPLC圖，圖中3個(gè)主要峰分別是蘆丁、橙皮苷和蒙花苷，其保留時(shí)間分別是19.5、24.0、31.0 min，這與對(duì)照品結(jié)果基本一致，圖中還存在一些小的峰型，這可能是在分離純化提取液時(shí)未能將提取液中的雜質(zhì)充分的分離開(kāi)。

圖6 黃酮標(biāo)準(zhǔn)品和薄荷黃酮提取物樣品的HPLC圖

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，黃酮類化合物的提取工藝主要有醇提法、機(jī)溶劑提取法和超聲波輔助提取法等，但普遍存在提取時(shí)間長(zhǎng)，提取率低，對(duì)環(huán)境不友好等弊端。超臨界CO2萃取技術(shù)作為一種新興的提取技術(shù)，具有無(wú)溶劑殘留、萃取能力強(qiáng)、提取效率高、活性成分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解破壞、安全廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。

該文采用超臨界CO2萃取技術(shù)萃取薄荷中黃酮類化合物，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到最佳萃取工藝條件：乙醇濃度80%、萃取壓力25 MPa、萃取溫度55 ℃、萃取時(shí)間120 min。在該工藝條件下薄荷黃酮的提取率為5.17%，明顯高于已報(bào)道的提取率[10]。

采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)薄荷中黃酮類化合物進(jìn)行成分分析。結(jié)果表明:薄荷中有3種黃酮類化合物，分別是橙皮苷、蒙花苷和蘆丁。

該研究旨在獲取薄荷黃酮較高提取率的同時(shí)，減少萃取過(guò)程對(duì)環(huán)境的污染，從而為薄荷資源的深度開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。