李青玲，李樹德，衛(wèi)小娟,2，黃映光，李思熳*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，云南 昆明 650500；2.中國科學(xué)院 昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明 650201;3.云南省第一人民醫(yī)院 普外一科，云南 昆明 650034)

肝癌發(fā)病率高居世界第六，是癌癥相關(guān)死亡第二大原因.肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的75%～85%[1].由于HCC病情進(jìn)展迅速，并發(fā)癥多，大多數(shù)患者確診時(shí)已達(dá)中晚期[2]，且大量早期HCC患者在手術(shù)治療后還會(huì)復(fù)發(fā).目前對HCC的治療決策多依賴于病理及影像學(xué)證據(jù)，缺乏分子學(xué)指標(biāo).而基于HCC特異性分子構(gòu)建的預(yù)后預(yù)測模型則可進(jìn)一步輔助臨床醫(yī)師進(jìn)行HCC診治[3].腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden，TMB)作為衡量免疫治療效果的可靠指標(biāo)，在HCC預(yù)后評(píng)估中至關(guān)重要.TMB表示外顯子編碼區(qū)每兆堿基中替換、基因插入或突變的總數(shù)[4]，是預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療多種腫瘤(如肺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和結(jié)腸直腸癌)療效的有效指標(biāo)[5-9].多項(xiàng)研究[5-9]中已初步揭示TMB與免疫微環(huán)境之間的聯(lián)系及TMB與HCC中的免疫治療之間的聯(lián)系，但由于其測序的復(fù)雜性和高成本，不太可能廣泛應(yīng)用于免疫治療療效的臨床評(píng)價(jià).Zhang等[10]基于2020年公共數(shù)據(jù)進(jìn)行了HCC中TMB相關(guān)分析，然而，近2年the Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫更新后鮮有相關(guān)研究報(bào)道.

本研究旨在基于(TCGA)數(shù)據(jù)庫探索HCC中腫瘤突變概況，然后通過基因差異分析及預(yù)后分析篩選出TMB相關(guān)的預(yù)后基因，并基于篩選的預(yù)后基因構(gòu)建HCC預(yù)后預(yù)測模型.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫(http：www.ncbi.nlm.nih. gov/geo)下載與HCC相關(guān)的基因組和臨床病理數(shù)據(jù)，基因組數(shù)據(jù)格式為FPKM.由于數(shù)據(jù)丟失，部分樣本被刪除，最終選擇357個(gè)腫瘤樣本進(jìn)行后續(xù)分析.同樣，從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取HCC體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)，并使用R軟件中的“maftool”包進(jìn)行分析[11].

1.2 TMB計(jì)算和分組

運(yùn)用Perl腳本計(jì)算TMB.并通過X-tile結(jié)合患者總體生存率(overall survival，OS)找到TMB的最佳截?cái)嘀?，然后依?jù)該值將患者分為TMB-H組和TMB-L組.

1.3 獲取差異基因

使用R包“l(fā)imma”處理數(shù)據(jù)，篩選出與TMB相關(guān)的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs).采用|log 2 FC|>1,false discovery rate(FDR)<0.05篩選出所有差異基因，并使用“pheatmap”包對差異基因進(jìn)行分層聚類.

運(yùn)用R包“org.Hs.eg.db”進(jìn)行Gene Ontology(GO)富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析，“clusterProfiler”和“ggplot2”包用于注釋和繪圖[12].采用P<0.05篩選出潛在通路.

1.4 TMB預(yù)后指數(shù)的構(gòu)建

使用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)[13]分析差異基因的OS率.然后根據(jù)logrankP<0.05篩選出關(guān)鍵基因.然后根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(risk score,RS)將所有患者分為高危組和低危組.采用K-M曲線表示RS水平與OS之間的關(guān)系.最后，繪制受試者生存工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)，計(jì)算曲線下面積(caculate the area under the curve,AUC)，以評(píng)估預(yù)后模型的價(jià)值.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用R Studio(https://www.rstudio.com)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[14].OS采用K-M和log-rank檢驗(yàn)方法計(jì)算.2組連續(xù)變量比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析.P值<0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 TMB在HCC中的研究概況

首先，通過評(píng)估每個(gè)HCC樣本的突變情況發(fā)現(xiàn)：單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)、錯(cuò)義突變和C>T突變是HCC中最常見的變異類型.其中，C>T變異最高，達(dá) 15 420.HCC中突變前10位的基因?yàn)椋篢P53、TTN、CTNNB1、MUC16、PCLO和ALB、RYR2、ABCA13、MUC4頻率均高于10(P<0.001)(圖1).

2.2 突變基因的瀑布效應(yīng)和相互關(guān)系

圖2(a)描繪了HCC中前30個(gè)突變基因的瀑布圖.我們進(jìn)一步分析前20個(gè)突變基因表達(dá)相關(guān)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn):CTNNB1與TP53、AX1N1表達(dá)負(fù)相關(guān)(P<0.05)，CTNNB1與SPTA1、OBSCN；MUC16與SPTA1、ABCA13、RYR2；PCLO與CACNA1E、HMCN1；RYR2與XIRP2；APOB與LRP1B；FLG與CSMD3、OBSCN；LRP1B與CACNA1E;HMCN1與SPTA1；TTN與LRP1B表達(dá)正相關(guān)(P<0.05)(圖2(b)).

2.3 TMB與臨床相關(guān)性

利用X-tile確定TMB=4.61為最佳截止值，并據(jù)此將357個(gè)樣本分為TMB-H組和TMB-L組.TMB-H組和TMB-L組的平均值分別為8.19和2.79(圖3(a)).生存分析結(jié)果顯示TMB與HCC預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05).TMB高的患者預(yù)后較差[15](P<0.05)(圖3(b)).圖3(c)～(e)反映了TMB與臨床病理特征的關(guān)系：在HCC患者中TMB與N分期(P<0.05)、年齡(P<0.05)、性別(P<0.05)相關(guān).總的來說，老年(>65歲)無淋巴轉(zhuǎn)移的男性TMB較高，但TMB水平與T/M分期、臨床分期和分級(jí)無明顯相關(guān)性(圖3(f)～(i)).

(a)變異的分類 (b)變異類型 (c)單核苷酸多態(tài)性分類 (d)突變前10位的基因

(a)HCC中前30個(gè)突變基因的瀑布圖

(b)HCC中前20個(gè)突變基因的相互關(guān)系

(a) TMB在各組間的分布 (b)TMB與HCC預(yù)后相關(guān)性 (c)TMB與年齡的關(guān)系

(d)TMB與性別的關(guān)系 (e)TMB與N期的關(guān)系 (f)TMB與T期的關(guān)系

(g)TMB與M期的關(guān)系 (h) TMB與臨床分期的關(guān)系 (i) TMB與臨床分級(jí)的關(guān)系

2.4 差異基因的富集分析

首先通過基因差異分析，篩選出39個(gè)與TMB相關(guān)的DEGs.圖4(a)為DEGs的聚類熱圖.我們進(jìn)一步通過GO功能富集分析研究DEGs相關(guān)的主要生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞成分(cellular component，CC) (圖4(b)).KEGG通路分析顯示，DEGs主要富集于細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、硫化合物生物合成過程和硫化合物代謝過程(圖4(c)).Gene set enrichment analysis(GSEA)分析結(jié)果顯示，TMB-H組富集在RNA代謝過程，TMB-L組富集在其他途徑包括調(diào)控超分子纖維組織、調(diào)控細(xì)胞器組織、正調(diào)控細(xì)胞器組織、肌動(dòng)蛋白絲組織、調(diào)控細(xì)胞骨架組織、肌動(dòng)蛋白聚合或解聚、調(diào)控肌動(dòng)蛋白絲基過程、調(diào)控肌動(dòng)蛋白絲組織(圖4(d)).

2.5 COX回歸分析

基于生存分析，可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：SFRP4、IL7R、FBLN2、COLEC10和CHGA的表達(dá)可能是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素(圖5).由此，可利用COX回歸分析建立預(yù)后預(yù)測模型，并利用ROC曲線驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性.通過R包“merge”下載了357例HCC病例的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù).根據(jù)多元COX回歸模型，計(jì)算TMBPI為:

PI=(0.088 945 38×SFRP4-0.009 912 19×COLEC10-0.000 690 51×CHGA-0.024 612 34×FBLN2-0.165 479 22×IL7R).

每個(gè)個(gè)體的RS通過TMBPI得到，然后可根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組(圖6(a)).該模型1,3,5年生存率的AUC分別為0.64、0.67、0.59(圖6(b)).結(jié)果顯示高危組患者預(yù)后較差(P<0.001)(圖6(c)).

(a)DEGs的聚類熱圖

(b)DEGs的GO功能富集分析 (c)DEGs的KEGG通路分析

(d)TMB組間的GSEA分析

(a)SFRP4的表達(dá)與HCC患者預(yù)后相關(guān) (b) IL7R的表達(dá)與HCC患者預(yù)后相關(guān) (c) FBLN2的表達(dá)與HCC患者預(yù)后相關(guān)

(d)CHGA的表達(dá)與HCC患者預(yù)后相關(guān) (e) COLEC10的表達(dá)與HCC患者預(yù)后相關(guān)

3 討論與結(jié)論

HCC侵襲性強(qiáng)，且具有高度異質(zhì)性.多項(xiàng)研究[16-18]表明肝癌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路與正常肝細(xì)胞迥異.例如，PI3K/AKT和IKK/NF-κB通路在HCC中被激活，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19,20].此外，免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用.Marina等[21]觀察到MYC/CTNNB1通路的激活促進(jìn)了免疫逃避和肝癌藥物耐藥性.TMB作為免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊肝癌細(xì)胞的關(guān)鍵因素，在很大程度上影響患者的預(yù)后.此外，在各種癌癥中可觀察到TMB與客觀緩解率顯著相關(guān)[22].在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變是HCC中最常見的類型.研究表明TP53的錯(cuò)義突變可將HCC分化為不同的亞型，并可能促進(jìn)疾病的進(jìn)展[23].在HCC中SNP變異占絕大多數(shù)，在我們的研究中，C>T變異數(shù)量達(dá)到 15 420，這與HCC的發(fā)生密切相關(guān)[24,25].

功能分析結(jié)果表明，DEGs主要與細(xì)胞外基質(zhì)組織和硫化合物代謝過程有關(guān).細(xì)胞外基質(zhì)是HCC免疫微環(huán)境的組成部分，靶向給藥已取得一定成效[26].硫化合物代謝可能與HCC中的自噬密切相關(guān)[27].此外，我們發(fā)現(xiàn)RNA代謝過程的活性與TMB之間存在明顯的負(fù)相關(guān).越來越多的證據(jù)表明，不同的非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)參與多種肝臟疾病(包括乙肝、丙肝和非酒精性脂肪肝病)代謝狀態(tài)調(diào)控，并最終導(dǎo)致HCC[28-30].這可能是TMB-H組總體預(yù)后不佳的最主要原因之一.

SFRP4、IL7R、FBLN2、COLEC10和CHGA在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用.SFRP4位于染色體7p14.1上，含有一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域.該結(jié)構(gòu)域可通過與Wnt直接結(jié)合來調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，從而形成沉默復(fù)合體并抑制HCC[31].IL-7R在T細(xì)胞分化和淋巴細(xì)胞發(fā)育中能發(fā)揮作用[32].IL-7R上調(diào)可激活細(xì)胞內(nèi)通路，誘導(dǎo)相關(guān)分子表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移[33].COLEC10編碼肝臟膠原凝集素1，是C凝集素家族的一員[34].研究表明[35]，COLEC10受miR-452-5p的調(diào)控，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移.CHGA(或CGA)在HCC樣本中高度表達(dá)，既往研究[36]表明它可以作為HCC的輔助診斷分子.本研究顯示FBLN2高表達(dá)組與低表達(dá)組的預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.然而，F(xiàn)BLN2在肝癌中的作用及其應(yīng)用價(jià)值尚未見報(bào)道，這可能是一個(gè)值得探索的靶點(diǎn).

基于此，本文構(gòu)建了多元COX回歸模型，實(shí)現(xiàn)了對患者個(gè)體生存概率的預(yù)測和分析.在本研究中，該模型1、3、5年生存率的AUC分別為0.64、0.67、0.59，具有一定的準(zhǔn)確度.該模型將為探索HCC新的預(yù)后因素提供了新的思路.此外，該模型無須識(shí)別患者的體細(xì)胞突變，而是通過直接檢測TMB相關(guān)的5個(gè)基因，這使得基于關(guān)鍵基因的靶向測序技術(shù)更加常規(guī).基于5個(gè)基因的預(yù)后預(yù)測模型可有效評(píng)估患者預(yù)后，這可能有助于指導(dǎo)肝癌患者的臨床治療.在常規(guī)臨床實(shí)踐中，臨床醫(yī)師多通過病理分期決定患者治療手段.但HCC病理活檢損傷大，多數(shù)患者依賴術(shù)前影像學(xué)(如CT、MRI)或常規(guī)生化指標(biāo)(如AFP,CEA,CA199)等評(píng)估病情.本研究創(chuàng)新性地將TMB、DEGs與HCC臨床數(shù)據(jù)相結(jié)合，通過COX回歸模型預(yù)測患者預(yù)后，其可操作性強(qiáng)，侵入性更小.在精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，利用分子分析結(jié)合病理分期的預(yù)后預(yù)測將比傳統(tǒng)方法更準(zhǔn)確.

該模型具有對HCC患者的實(shí)質(zhì)性預(yù)測能力和價(jià)值，然而其局限性也應(yīng)當(dāng)被意識(shí)到.首先，目前研究缺乏患者的免疫治療信息，這限制了我們對TMB介導(dǎo)的HCC免疫微環(huán)境變化的研究.其次，由于TCGA項(xiàng)目中只有一部分樣本具有臨床病理和TMB數(shù)據(jù)可用于分析，目前的樣本量存在限制.最后，由于缺乏肝癌患者的全外顯子測序信息，我們沒有通過本中心臨床數(shù)據(jù)來驗(yàn)證結(jié)論.因此，預(yù)測模型的有效性值得在未來使用獨(dú)立隊(duì)列進(jìn)行更多的外部驗(yàn)證.

綜上，本研究建立了一個(gè)新的基于5個(gè)基因的HCC患者預(yù)后預(yù)測模型.該模型可能是HCC預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)分層的有效工具，并為肝癌的臨床診斷結(jié)合病理和分子分析提供了新的思路.