袁長巍，于化洲，徐陽，曹興午

(1.北京美中宜和北三環(huán)婦兒醫(yī)院，北京 100088；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029)

精子的發(fā)生、發(fā)展有其特殊性和復(fù)雜性，易受各種有害因素影響，而診斷和治療睪丸生精功能障礙的臨床思維，必須從睪丸生精功能進行評估，其功能的損傷與失調(diào)對探討男性不育的發(fā)生機制、保護男性生殖健康有重要的實際意義。精液中生精細胞的檢出常常牽涉到睪丸生精功能的改變，生精功能的改變又涉及到睪丸內(nèi)生精細胞的病理變化。因此，在診斷和治療睪丸生精功能障礙的過程中，有必要了解精液中各類細胞的脫落狀態(tài)(有無、多少、形態(tài))以及在病理損傷中所扮演的角色。精液細胞學是男性不育實驗診斷的重要檢測項目，通常與精液常規(guī)、精漿生化及性激素檢測等共同評估睪丸的生殖功能，并可作為無精子癥類型的鑒別診斷依據(jù)。

一、精液細胞學研究現(xiàn)狀

精液細胞學一詞含義較為廣泛，涵蓋了精液中顯微鏡下可見的所有內(nèi)含物，包括精子、未成熟的生精細胞、白細胞、上皮細胞、支持細胞及病原微生物等，精液中所有有形成分的檢出都可以作為考證睪丸生殖功能狀況和病理性損傷的有效指標。目前，精液細胞學檢測仍存在較多制約其發(fā)展的問題，如缺乏統(tǒng)一的檢測標準、對生精細胞缺乏識別能力、檢測耗時耗力、經(jīng)濟效益較差、相關(guān)內(nèi)容培訓少及學習意愿不強等多方面原因，使此項檢測和研究長期處于被忽視和弱化狀態(tài)，幾乎成為“被遺忘的角落”，與其他體液細胞學相比，發(fā)展明顯滯后。伍細言等[1]對中國性學會生殖檢驗分會委員單位的生殖檢驗現(xiàn)狀進行了調(diào)查，在75份問卷中，能進行精液細胞學檢測的實驗室僅有12%(9/75)，表明精液細胞學的檢測仍未引起足夠重視。雖然精液檢查自動化、儀器設(shè)置最優(yōu)化逐漸得到普及[2]，傳統(tǒng)人工顯微鏡細胞形態(tài)學檢查不應(yīng)忽視。精液中的白細胞、生精細胞及上皮細胞多呈圓形外觀，統(tǒng)稱為“圓形細胞”，在未經(jīng)染色狀態(tài)下難以正確分辨。目前仍有許多基層(也包括部分大型綜合醫(yī)院)的檢驗人員將精液中的圓形細胞誤認為白細胞，而且已形成了固有的慣性模式。報告成白細胞，臨床醫(yī)生就會認為有炎癥或有病原體存在，繼而進行抗生素治療，導(dǎo)致誤診誤治的同時也給患者帶來了精神和心理負擔[3]。精液中的圓形細胞并不等同于白細胞，也可能是未成熟的生精細胞，應(yīng)染色加以鑒別。因此，明確區(qū)分精液中主體細胞的類別在臨床診斷和治療上起關(guān)鍵作用，同時也是檢驗人員的基本責任。如主體細胞為白細胞，需要了解是否存在病原體感染；如診斷為生精細胞，則要進一步評估睪丸的生殖功能。精液中各類細胞的檢出，直接或間接反映了睪丸的生殖功能、感染及免疫狀態(tài)，臨床應(yīng)給予重視。實驗室的發(fā)展也應(yīng)與時俱進，不能只停留在“圓形細胞”的報告水平，加強人員培訓及質(zhì)量管理是當前精液細胞學檢測亟須解決的迫切問題。

二、精液細胞學的檢測方法

1.檢測方法：精子形態(tài)學的染色方法同樣適用于生精細胞的檢查，常用的染色方法包括改良巴氏染色法、Diff-Quik染色法、瑞氏-姬姆薩染色法以及HE染色法等，不同的染色方法其化學性質(zhì)有所不同，染色后各類細胞的形態(tài)特征亦存在差異。瑞氏-姬姆薩染色是細胞形態(tài)的經(jīng)典染色方法，主要用于血液和骨髓涂片染色。精液標本經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后，各類細胞相應(yīng)呈現(xiàn)不同的著色，細胞核、細胞漿以及漿內(nèi)的顆粒和異物成分清晰可辨，從而達到辨別其形態(tài)特征的目的，但對于精子形態(tài)染色效果要略遜于其他染色方法。

2.檢測注意事項：精液細胞學檢測主要應(yīng)用于無精子癥患者，精子濃度正常的精液標本生精細胞檢測意義有限。無精子癥患者精液中內(nèi)含物相對較少，將全部精液標本離心(3 000g，15 min)后進行檢測能更好地反映出睪丸的真實病理狀態(tài)。閱片時先在低倍鏡下觀察全片，對細胞的分布、數(shù)量和染色情況等做初步了解，并選擇體尾交界處染色良好區(qū)域，在油鏡下按“弓”字形路線進行圓形細胞的分類和計數(shù)。油鏡下要把握細胞形態(tài)辨別要點，注意個體細胞與群體細胞之間的關(guān)系，并遵循“核漿兼顧，以核為主”的細胞識別原則，依胞體(大小、形狀、偽足)、胞質(zhì)(比例、色澤、顆粒、內(nèi)容物)、胞核(大小、數(shù)量、形態(tài)、位置)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及核膜形態(tài)、核仁(有無、數(shù)量、大小)的順序，從外向內(nèi)逐步分析[4]。無精子癥患者精液中，生精細胞形態(tài)多不規(guī)則，千變?nèi)f化，增加了辨別難度，比如淋巴細胞與精原細胞、巨噬細胞與異常初級精母細胞、凋亡中性粒細胞與精子細胞的辨別容易相互混淆。形態(tài)學判斷具有主觀性，難免會出現(xiàn)認知偏差，所以，檢驗人員應(yīng)熟悉各類細胞形態(tài)特點及變化規(guī)律，并結(jié)合病史及相關(guān)檢查綜合分析，做到相互印證，以獲得正確的結(jié)論。細胞學報告以客觀描述為主，應(yīng)遵循看到什么、考慮什么、建議什么的報告模式，對于特殊的病例應(yīng)加強實驗室與臨床的有效溝通，一名優(yōu)秀的形態(tài)學檢驗人員應(yīng)該具有扎實的臨床醫(yī)學知識，有充實的理論做指導(dǎo)，才能不斷完善形態(tài)學診斷實踐。

三、精液細胞學檢測的臨床意義

睪丸生精功能障礙是指因各種原因?qū)е虏G丸內(nèi)生精上皮(或生精組織)生精能力下降，生精細胞部分或全部發(fā)育阻滯，導(dǎo)致少精子或無精子，從而不容易正常受孕[5]。當睪丸受到各種有害因素影響或發(fā)生自身固有改變時，生精小管內(nèi)的各類細胞將可能由生理性改變向病理性發(fā)展。由于睪丸受損的時間、程度及導(dǎo)致受損的因素不同，其生精細胞的病理性改變、脫落狀態(tài)及臨床表現(xiàn)也不盡相同，少精子癥、弱精子癥、畸形精子癥及無精子癥都可能發(fā)生。精液細胞學檢測的臨床意義主要體現(xiàn)如下幾個方面。

1.評估睪丸的生殖功能：生精細胞的脫落狀態(tài)反應(yīng)了睪丸生理與病理的變化過程，是睪丸生精功能障礙的敏感指標。精液中生精細胞的存在異常、比例異常及形態(tài)異常，可作為衡量睪丸生殖功能的有效指標。

存在異常：精液中沒有精子并不代表沒有生精細胞，存在生精細胞預(yù)示輸精管道是通暢的，病因可能在睪丸。本課題組對923例非梗阻性無精子癥(NOA)患者進行了精液細胞學檢查，精子和生精細胞的檢出率分別為20.04%和64.46%(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，這為NOA患者睪丸功能評估、后續(xù)治療及輔助生殖技術(shù)的選擇提供了重要信息。如果精液中沒有精子，也沒有生精細胞和支持細胞，則要結(jié)合患者的體格檢查、睪丸體積、生殖激素、精漿生化、超聲等檢測進行無精子癥類型及梗阻部位的確定。同時，精液生精細胞檢查聯(lián)合精漿果糖及中性α-葡糖苷酶檢測可有效避免有侵襲性的輸精管造影[6]。

比例異常：精原細胞分化成精子是一個連續(xù)過程，如果生精細胞在某個階段發(fā)生中斷，將會導(dǎo)致生精細胞分化障礙，導(dǎo)致生精阻滯，臨床上常表現(xiàn)為少精子癥(部分阻滯)或無精子癥(完全阻滯)。根據(jù)精液中各階段生精細胞脫落的數(shù)量、比例可大致判斷生精阻滯的類型。如果精液中一種或兩種生精細胞比例增高，而其后階段生精細胞減少或缺失，則要考慮睪丸生精阻滯，其中初級精母細胞阻滯最為常見，精子細胞階段次之。生精阻滯的致病機制較為復(fù)雜，有先天性和獲得性因素之分，與其他類型的NOA相比，生精阻滯患者睪丸體積及血清卵泡刺激素(FSH)水平相對正常，且遺傳變異發(fā)生頻率更高[7-8]。生精阻滯常見于Y染色體AZFb區(qū)完全缺失或特發(fā)性無精子癥，也見于一些AZFc區(qū)缺失、染色體易位的患者。近年來，一系列生精阻滯相關(guān)單基因致病突變已被發(fā)現(xiàn)，特別對于精母細胞階段完全阻滯的患者，其基因異常率明顯增高，且睪丸顯微取精率也不甚理想[9]。如果精液中檢出大量初級精母細胞、未見精子細胞和精子時，是否需要進行睪丸顯微取精還值得商榷。

形態(tài)異常：生精細胞凋亡和脹亡是細胞死亡兩種不同的表現(xiàn)類型。凋亡機制的調(diào)節(jié)失衡是許多疾病的根源，而誘發(fā)過多的生精細胞凋亡是一種病理現(xiàn)象，是造成睪丸生精功能障礙的重要原因。細胞凋亡的形態(tài)特征為細胞體積變小、胞質(zhì)濃縮、核染色質(zhì)固縮于邊緣、DNA降解，最后形成多個凋亡小體而被吞噬。細胞脹亡是一種細胞膜通透性增加至細胞膜完整性破壞、DNA裂解為非特異性片段，最后細胞溶解并伴有炎癥反應(yīng)的細胞死亡過程，主要表現(xiàn)為細胞腫脹、細胞核溶解[10]。細胞凋亡與細胞脹亡可共存于同一病灶中，并可由同一刺激引起，但兩者的出現(xiàn)與組織血供情況、刺激強度和刺激作用時間有關(guān)，血供豐富、刺激較弱、作用時間短傾向于凋亡，反之傾向于脹亡[11]。ATP水平也影響細胞死亡方式，同一刺激下細胞內(nèi)ATP水平高則表現(xiàn)出凋亡特征，否則因缺乏能量細胞不能完成凋亡程序則轉(zhuǎn)向脹亡，補充ATP后，脹亡也可能轉(zhuǎn)化為凋亡形式的細胞死亡[12]。生精細胞的形態(tài)變化反映了睪丸的損傷程度，臨床治療發(fā)現(xiàn)，NOA精液中正常形態(tài)生精細胞的比例越高，越具備治療價值。那么，正常形態(tài)生精細胞的檢出是否與睪丸生精小管內(nèi)存在微量生精灶相關(guān)？是否可作為睪丸顯微取精的預(yù)測指標？仍需要進一步研究。因此，對精液中的生精細胞進行形態(tài)分類，對療效觀察和判斷預(yù)后具有指導(dǎo)意義。

2.支持細胞檢出的臨床意義：睪丸支持細胞是唯一與生精細胞緊密接觸的細胞，其緊密連接是構(gòu)成血-睪屏障的重要組成部分，在維持生精小管微環(huán)境穩(wěn)定、精子發(fā)生及調(diào)控過程中發(fā)揮著核心作用[13-14]。支持細胞是多種有毒物質(zhì)的睪丸內(nèi)靶細胞，如微環(huán)境的平衡被打破，支持細胞必然受到累積性影響，最終導(dǎo)致支持細胞萎縮、高度降低及異常脫落[15-16]。正常生育者精液中支持細胞無或極少脫落，而NOA患者中較為常見；如精液中僅檢出支持細胞、未見生精細胞，則要考慮唯支持細胞綜合征可能。有害因素的刺激易使支持細胞骨架發(fā)生斷裂，并隨精液排出體外；精液中檢出支持細胞及支持細胞骨架的微管、微絲，往往提示睪丸微環(huán)境受累，損傷已威脅到支持細胞功能，而其功能的優(yōu)劣將直接決定生精細胞的分化程度及精子的生成。

3.精液中白細胞的區(qū)分：精液中可以檢出不同數(shù)量的白細胞，過氧化物酶染色是WHO推薦的檢測方法；當白細胞濃度>1×106/ml時，可診斷為白細胞精子癥(LCS)[17]。LCS的存在是生育力的一個負面預(yù)后因素，與精子濃度、精子活動力、正常形態(tài)精子率呈明顯負相關(guān)[18]。白細胞對精子的影響依賴于白細胞釋放活性氧(ROS)的能力和炎癥反應(yīng)[19]，盡管LCS與不育癥發(fā)病率增加有關(guān)，但其臨床意義、診斷和治療的不確定性仍然存在。LCS僅提示生殖道炎癥跡象，但并不能準確預(yù)測微生物感染。有證據(jù)表明，精液中低水平的白細胞濃度也會出現(xiàn)不同程度的精液質(zhì)量異常，并可引起同等程度的氧化損傷[20-21]，因此認為WHO制定的濃度閾值應(yīng)根據(jù)情況重新評定。由于精液中部分中性粒細胞處于活化階段，過氧化物酶染色并不能檢測到已經(jīng)釋放其顆粒的中性粒細胞和不含有過氧化物酶的白細胞類型，可能導(dǎo)致此方法計數(shù)白細胞濃度要比實際結(jié)果偏低，這可能與低水平的白細胞水平仍會導(dǎo)致精液質(zhì)量下降存在聯(lián)系。精液中不同來源的白細胞及其亞群與精液各參數(shù)之間的相關(guān)性仍不完全清楚，計數(shù)精液中總白細胞濃度并進行分類對損傷機制的探索可能更有實際意義。精液中的白細胞主要包括粒細胞(中性粒細胞、嗜酸粒細胞)、單核/巨噬細胞、淋巴細胞。免疫細胞化學法通過單克隆抗體與白細胞表面抗原特異性結(jié)合的方法進行檢測，是評估精液白細胞的金標準，但該方法操作復(fù)雜、試劑成本較高，并不適合常規(guī)開展。精液細胞染色分析可有效區(qū)分精液中的生精細胞和白細胞，還可以對白細胞的類型及形態(tài)進行分析，但要求技術(shù)人員對細胞的結(jié)構(gòu)及特點比較熟悉。精液中白細胞存在凋亡、活躍、壞死等不同的形態(tài)特征，其形態(tài)變化正是反映了生理性和病理性的不同。通常情況下，在急性炎癥時精液中以中性粒細胞為主，細胞常表現(xiàn)為核膜破損、核溶解、核破碎、核退變，結(jié)構(gòu)模糊等特征，有時胞漿內(nèi)可見胞內(nèi)菌和中毒顆粒；在慢性非特異性炎癥、急性炎癥恢復(fù)期時單核/巨噬細胞比例增高，胞內(nèi)常見吞噬精子、細胞、病原體、顆粒、結(jié)晶、組織碎片等異物成分，這與炎癥過后巨噬細胞功能激活、清掃異物功能增強有關(guān)；當淋巴細胞增多，并伴有異常淋巴出現(xiàn)時，則要考慮病毒、結(jié)核菌感染的可能。如果技術(shù)人員能夠做到正確分辨，這將是一種簡單快速、價格便宜、準確性高、指導(dǎo)性強、容易推廣的檢測方法。

另外，精液中出現(xiàn)大量前列腺上皮、精囊腺上皮及附睪上皮細胞則可提示附性腺的功能損傷。線索細胞、細菌、真菌及滴蟲的檢出則應(yīng)考慮感染因素存在，建議雙方治療，避免交叉感染。生精細胞內(nèi)存在包涵體，則要考慮病毒感染的可能，應(yīng)給予重視。精液中大量殘渣也有其臨床意義，這可能與睪丸支持細胞的吞噬功能下降有關(guān)。大量上皮細胞和乳酸桿菌的檢出應(yīng)考慮性交后排精。

四、精液細胞學與睪丸活檢

睪丸活檢是男性不育癥病理檢查的主要方法及金標準，多年來已被臨床所接受。通過病理組織學觀察可直接評價睪丸的生精功能和生精障礙程度。但對于NOA患者，睪丸本身的生精狀態(tài)不盡均衡，存在局部性精子發(fā)生現(xiàn)象，由于取材部位的局限性，單次睪丸活檢可能難以全面、完整反映睪丸的整體狀態(tài)，同時多點、多次的手術(shù)取材又會加重睪丸的損傷。精液細胞學檢測可以反映整個睪丸功能，免除了睪丸活檢帶來的創(chuàng)傷、恐懼和不可重復(fù)性。即使睪丸組織病理診斷為唯支持細胞綜合征的患者，通過精液細胞學檢查仍可以檢出生精細胞，甚至精子。兩者在無精子癥的診斷和治療上各有利弊，應(yīng)相互補充。對于睪丸生殖功能的評估，應(yīng)遵循“先無創(chuàng)、再微創(chuàng)、后有創(chuàng)”的原則進行，并結(jié)合性激素、抑制素B、精漿生化等結(jié)果綜合考量。

五、精液細胞學與性激素水平

男性不育的影響因素較多，其中性激素水平與男性不育的發(fā)生密切相關(guān)，下丘腦-垂體-睪丸軸的相互作用維持著正常男性的性激素水平和睪丸生精功能。精子發(fā)生是一個激素依賴的連續(xù)不斷增生和分化的過程，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)平衡失調(diào)，都可能影響精子的正常發(fā)生和成熟[22]。同時檢測黃體生成素(LH)、FSH及睪酮(T)的水平，對于性腺功能減退癥的病因定位診斷具有重要的價值，有助于后續(xù)治療方案的正確制定。精子發(fā)生在增殖和成熟階段，需要自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌刺激，這是由FSH和T共同保證的。FSH主要作用于初始的幾個階段，而T作用在最后幾個步驟[23]。睪丸生精功能障礙的發(fā)生，首先是睪丸支持細胞-生精小管嵌合體受損，負反饋引起FSH水平升高，繼而導(dǎo)致Leydig細胞T分泌減少，負反饋引起LH水平隨之升高[24]。血清FSH水平可反映生精小管內(nèi)各級生精細胞的分化和發(fā)育程度，高濃度的FSH往往預(yù)示著整個睪丸功能的損傷，且血清FSH水平越高，生精障礙程度越嚴重，精子數(shù)量降低越明顯[25-26]。如果同時伴有LH顯著升高時，表明損傷已經(jīng)累及Leydig細胞。FSH與T是保證生精細胞正常分化的必須因子，并通過Sertoli細胞進行調(diào)節(jié)，避免生精細胞過度凋亡。睪丸內(nèi)生精細胞的異常脫落導(dǎo)致成熟精子生成受阻，是最終表現(xiàn)為少精子癥或無精子癥的重要原因。

血清LH與FSH水平不僅與精子數(shù)量的多寡呈負相關(guān)，還與生精細胞脫落的數(shù)量有著密切聯(lián)系。本課題組將738例NOA患者的精液標本分為生精細胞存在組和生精細胞缺乏組，并對兩組的性激素水平(LH、FSH、T)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LH、FSH水平組間比較具有統(tǒng)計學差異，T水平比較無統(tǒng)計學差異[27]。睪丸生精功能障礙的病程發(fā)展，必定有初始-受損-輕度-中度-重度的病變過程，即使精液中沒有精子，生精細胞仍在繼續(xù)脫落并逐漸枯竭，最終可能發(fā)展為不可逆的唯支持細胞綜合征的病理表現(xiàn)類型。通過精液生精細胞和精子形態(tài)的檢查，能夠觀察其精子發(fā)生、發(fā)展的各個階段，即使唯支持細胞綜合征的患者，也應(yīng)該結(jié)合精液生精細胞檢出的有無、多少、比例、形態(tài)來評估和預(yù)測睪丸的生精功能。根據(jù)性激素水平和精液細胞學分析結(jié)果，適時調(diào)整藥物種類、劑量和給藥頻率，對評估和治療睪丸生精功能障礙有著重要價值。

總之，精液細胞學檢查可以更好地了解睪丸潛在的儲備能力，可以對睪丸可能持續(xù)生成精子的數(shù)量和質(zhì)量以及生精細胞的動態(tài)分化能力進行評估。形態(tài)學辨識是醫(yī)學檢驗的重點內(nèi)容，也是檢驗技術(shù)的重點和難點。精液細胞學已進入推廣和應(yīng)用階段，可以在推廣中探索與提高，在實踐中不斷地深入、豐富、糾正和完善，以期在充分發(fā)揮實驗室診斷價值的同時更好地為臨床服務(wù)。