孫慧妙 ，沈偉良，陳彩芳，林志華 ，韓慶喜

( 1. 浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315100；2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315823；3. 寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江 寧波 315012；4. 浙江萬(wàn)里學(xué)院 寧海海洋生物種業(yè)研究院，浙江 寧海 315604)

1 引言

水生穴居動(dòng)物由于生存空間有限，其攝食、排泄均在洞穴中進(jìn)行，導(dǎo)致殘餌、排泄物等有機(jī)物在洞穴中積累。尤其是退潮時(shí)，洞穴內(nèi)氧氣含量迅速下降，在缺氧條件下，底部沉積物中的硫酸鹽、亞硫酸鹽和含硫有機(jī)物會(huì)被還原為硫化物H2S[1]，使得穴居動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間暴露于高濃度的硫化物環(huán)境中，對(duì)硫化物產(chǎn)生了一定的耐受性。目前對(duì)耐硫生物的研究主要集中在單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）[2]、美洲刺螠（Urechis caupo）[3]、羅 氏 沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[4]和日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[5]等水生無(wú)脊椎動(dòng)物中。

硫化物（H2S、HS-和S2-）是底棲環(huán)境常見(jiàn)的不良環(huán)境因子，具有呼吸毒性和免疫毒性[6-7]，會(huì)抑制需氧生物的有氧呼吸，使新陳代謝減慢，甚至導(dǎo)致生物體的死亡。為了抵御硫化物的毒性，耐硫生物會(huì)對(duì)其進(jìn)行氧化代謝解毒[2]。此硫化物氧化代謝途徑在硫醌氧化還原酶（Sulfide Quinine Oxidoreductase，SQR）、硫雙加氧酶（Sulfur Dioxygenase，SDO）、硫轉(zhuǎn)移酶（Sulfur Transferases，ST）等一系列酶的作用下，將有毒硫化物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒硫酸鹽[8]。硫酸鹽在機(jī)體內(nèi)會(huì)被進(jìn)一步活化為3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸（3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate，PAPS）；而胞質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶（Cytosolic Sulfotransferase，SULT）以PAPS作為其磺化反應(yīng)的通用供體，促進(jìn)甲狀腺激素、類固醇和兒茶酚胺類等有效內(nèi)源性物質(zhì)的失活和消除[9]。胞質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶1B1（Cytosolic Sulfotransferase 1B1, SULT1B1）通過(guò)磺化反應(yīng)調(diào)節(jié)甲狀腺激素（Thyroid Hormones，THs）水平[10]，以調(diào)控機(jī)體生理代謝水平。

縊蟶（Sinonovacula constricta）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類之一，常棲居于潮間帶的泥砂質(zhì)灘涂中。作為典型的穴居雙殼貝類，其埋棲深度可達(dá)體長(zhǎng)的5～8倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)深于泥蚶（Tegillarca granosa）、文蛤（Meretrix meretrix）等其他灘涂貝類[11-12]。由于潮汐作用和洞穴內(nèi)有限的海水交換，縊蟶常暴露于高濃度的硫化物環(huán)境中，且其耐受硫化物的能力要強(qiáng)于單環(huán)刺螠、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、羅氏沼蝦等水生動(dòng)物[12-13]。本課題組已有研究表明，縊蟶線粒體硫化物氧化途徑是其對(duì)硫化物解毒的重要策略[11-12]；在對(duì)其基因組的進(jìn)一步分析中發(fā)現(xiàn)，縊蟶SULT1B1（ScSULT1B1）基因家族存在基因擴(kuò)張現(xiàn)象，且在對(duì)已有的硫化物脅迫后縊蟶鰓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的比較分析中亦篩選到了該家族成員SULT1B1-12基因的全長(zhǎng)cDNA序列。因此，本研究擬以硫代謝途徑中間產(chǎn)物—硫酸鹽水平為連接點(diǎn)，對(duì)ScSULT1B1-12基因的序列特征、組織表達(dá)和硫化物脅迫后的表達(dá)特征進(jìn)行分析，探討其在縊蟶耐硫性狀中的作用機(jī)制，旨在為縊蟶耐硫化物分子機(jī)制研究及后續(xù)開(kāi)展分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用縊蟶采集自寧波市海洋與漁業(yè)研究院科技創(chuàng)新基地。選取健康、活力好、殼體完整、規(guī)格均勻的成年縊蟶，體質(zhì)量為（10.72±1.64）g，殼長(zhǎng)為（5.8±0.5）cm。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前暫養(yǎng)7 d，海水鹽度為21.2±0.5，溫度為（18.1±1.5）℃，連續(xù)充氣，每日換水1次，并定時(shí)投喂適量的小球藻。隨機(jī)選取4顆縊蟶，設(shè)為4個(gè)生物學(xué)平行，分別解剖取其鰓、閉殼肌、肝胰腺、斧足、外套膜、水管等組織，組織經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃，用于ScSULT1B1-12基因的組織表達(dá)研究。

2.2 硫化物脅迫實(shí)驗(yàn)

選取384顆健康縊蟶成貝進(jìn)行硫化物攻毒實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前2 d停止投喂和充氧。鑒于硫化物對(duì)縊蟶的96 h安全濃度為158 μmol/L[11]，故本研究設(shè)置3個(gè)濃度組，分別為50 μmol/L、150 μmol/L和300 μmol/L，每組均設(shè)4個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)用九水硫化鈉（Na2S·9H2O）配置100 mmol/L硫化物母液，成倍稀釋母液使水體濃度分別達(dá)到相應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)定濃度。每3 h補(bǔ)充1次母液，以維持暴毒水體硫化物濃度的穩(wěn)定。于硫化物攻毒后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，從各平行組隨機(jī)選取4顆縊蟶，抽取血液后解剖取其鰓和肝胰腺。各樣品均于液氮速凍后儲(chǔ)存于-80℃，用于Sc-SULT1B1-12基因的時(shí)間表達(dá)研究。

2.3 縊蟶血液 S O24-離子濃度檢測(cè)

用珠磨法破碎縊蟶血細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min；取上清液1 mL，加入1 mL乙腈沉淀蛋白質(zhì)后加入8 mL去離子水，振蕩混勻后靜置5 min；隨后10 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)過(guò)孔徑為0.22 μm濾膜過(guò)

濾。經(jīng)離子色譜法檢測(cè)濾液中 S O24

-濃度。

2.4 ScSULT1B1-12基因的生物信息學(xué)分析

從硫化物脅迫后縊蟶鰓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到ScSULT1B1-12基因全長(zhǎng)序列。利用ORF Finder查找 其 開(kāi) 放 閱 讀 框（Open Reading Box，ORF）。使 用NCBI（National Center for Biotechnology Information）的BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）分析序列的完整性并進(jìn)行同源性比較分析。使用ProtParam預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)（Isoelectric point，pI）和分子量（Molecular weight，Mw）（https://web.expasy.org/protparam/）。利 用PROSITE（https://prosite.expasy.org/）進(jìn)行功能域的分析。通過(guò)SWISSMODEL（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）進(jìn)行其蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。用Clustal W軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。利用MEGA-7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并利用iTOL（https://itol.embl.de/）進(jìn)行在線美化。

2.5 ScSULT1B1-12基因在縊蟶不同組織及硫化物脅迫下的表達(dá)

Trizol法提取縊蟶組織總RNA，使用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。根據(jù)ScSULT1B1-12基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)RT-qPCR引物（表1）。利用LightCycler?480II實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每組樣品設(shè)4個(gè)生物學(xué)平行，4個(gè)技術(shù)重復(fù)。以RS9基因?yàn)閮?nèi)參基因[14]，采 用2-ΔΔCT法[15]計(jì)算ScSULT1B1-12的 相 對(duì) 表達(dá)量。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used in the experiment

2.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，均使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），p＜0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果

3.1 硫化物脅迫下縊蟶血液 S O24-濃度的變化

隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，除50 μmol/L濃度組外，其余 較 高 濃 度 組（150 μmol/L、300 μmol/L）縊 蟶 血 液SO24-濃度波動(dòng)較大，總體均呈下降趨勢(shì)；且濃度越高，波動(dòng)越劇烈（圖1）。50 μmol/L硫化物脅迫下，其SO24-濃度波動(dòng)不大，在3 h時(shí)小幅上升，6 h時(shí)略微下降，隨后12 h、24 h、48 h時(shí)保持上升趨勢(shì)，但差異不顯著（p＞0.05），72 h時(shí)小幅下降。150 μmol/L硫化物脅迫下，其 SO24-濃度3 h時(shí)顯著下降（p＜0.05），6 h、12 h時(shí)持續(xù)小幅上升，之后24 h時(shí)有所下降，到48 h、72 h時(shí)保持在同一水平內(nèi)波動(dòng)。300 μmol/L硫化物脅迫下，其 SO24-濃度3 h時(shí)顯著上升（p＜0.05），6 h時(shí)大幅下降（p＜0.05），12 h時(shí)再次顯著升高（p＜0.05），24 h時(shí)小幅波動(dòng)，48 h、72 h持續(xù)大幅下降（p＜0.05）。

圖1 硫化物脅迫下縊蟶血液 SO24-濃度的變化Fig. 1 Changes in S O24- concentration of Sinonovacula constricta under sulfide stress

3.2 ScSULT1B1-12基因序列的生物信息學(xué)分析

ScSULT1B1-12基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1 100 bp，包含 897 bp的ORF，編碼298個(gè)氨基酸（圖2）。其預(yù)測(cè)的蛋白分子量為35.03 kDa，理論等電點(diǎn)為6.37，其中極性氨基酸所占比例較高，為親水性蛋白，無(wú)信號(hào)肽。功能域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其有1個(gè)功能域（Pfam：Sulfotransfer_1，46～291 aa）。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由117個(gè)H鍵、137個(gè)螺旋數(shù)和44個(gè)轉(zhuǎn)角組成。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其為同源二聚體。

氨基酸序列同源性分析顯示，ScSULT1B1-12與其他軟體動(dòng)物ScSULT1B1的同源性最高，其中與長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）和美洲牡蠣（Crassostrea virginica）的同源性分別為52.36%和48.48%。與其他動(dòng)物SULT1B1進(jìn)行多重序列比對(duì)表明，該基因保守性較高，含有4個(gè)催化活性位點(diǎn)（56K、104N、106H和134A）、N端的PAPS結(jié)合域（YPKSGTXW）、C端的PAPS結(jié)合和二聚化域（RKGXXGDWKNXFTVXXE）（圖3）。

圖3 11種動(dòng)物SULT1B1氨基酸序列的多重比較Fig. 3 Multiple alignments of the amino acid sequences of SULT1B1 in eleven animals

用MEGA7.0軟件以鄰接法構(gòu)建了各物種SULT1B1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，在線美化后如圖4所示。該進(jìn)化樹(shù)由3個(gè)分支組成，ScSULT1B1-12首先與貝類聚為一支，隨后與節(jié)肢動(dòng)物聚為一支，最后再與脊椎動(dòng)物聚為一支。

圖4 鄰接法構(gòu)建的ScSULT1B1-12系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 The ScSULT1B1-12 phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method

3.3 ScSULT1B1-12基因組織表達(dá)分析

利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了ScSULT1B1-12在縊蟶鰓、閉殼肌、肝胰腺、斧足、外套膜、水管中的表達(dá)情況（圖5）。結(jié)果表明ScSULT1B1-12基因在6種組織中均有表達(dá)，且其在鰓中表達(dá)量最高，其次為閉殼肌和肝胰腺。

圖5 ScSULT1B1-12基因在縊蟶不同組織中的表達(dá)Fig. 5 The expression of ScSULT1B1-12 gene in different tissues of Sinonovacula constricta

3.4 ScSULT1B1-12基因在硫化物脅迫下的表達(dá)特征分析

硫化物脅迫下，縊蟶鰓中ScSULT1B1-12基因表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈下降-升高-下降的波動(dòng)模式（圖6M）。50 μmol/L硫化物脅迫下，鰓ScSULT1B1-12基因的表達(dá)量在3 h 時(shí)略微下降，6 h、12 h時(shí)小幅波動(dòng)上升后于 24 h 時(shí)顯著升高（p＜0.05），隨后48 h 時(shí)顯著下降（p＜0.05），并在 72 h 時(shí)略有上升。150 μmol/L 硫化物脅迫下，鰓ScSULT1B1-12基因的表達(dá)量在 3 h 時(shí)顯著下降（p＜0.05），6 h、12 h 時(shí)小幅波動(dòng)后于 24 h 時(shí)顯著升高（p＜0.05），隨后 48 h 時(shí)顯著下降（p＜0.05），并在 72 h 時(shí)保持在同一表達(dá)水平。300 μmol/L硫化物脅迫下，鰓ScSULT1B1-12基因的表達(dá)水平較前兩組波動(dòng)劇烈，在3 h時(shí)略微下降后于6 h時(shí)顯著上升至峰值（p＜0.05），12 h時(shí)顯著下降（p＜0.05），隨后24 h小幅升高，在48 h時(shí)又劇烈下降（p＜0.05），最后于72 h時(shí)保持在同一表達(dá)水平。

圖6 硫化物脅迫下ScSULT1B1-12基因在縊蟶鰓（M）和肝胰腺（m）中的表達(dá)特征Fig. 6 The expression characteristics of the ScSULT1B1-12 gene in gill (M) and hepatopancreas (m) of Sinonovacula constricta under sulfide stress

硫化物脅迫下，縊蟶肝胰腺中ScSULT1B1-12基因表達(dá)水平亦呈波動(dòng)模式（圖6m）。50 μmol/L、150 μmol/L硫化物脅迫下，肝胰腺ScSULT1B1-12基因的表達(dá)模式類似，總體呈下降趨勢(shì)。50 μmol/L濃度組，其基因表達(dá)量在3 h時(shí)顯著下降（p＜0.05），隨后在6 h、12 h、24 h、48 h時(shí)在同一范圍內(nèi)小幅波動(dòng)，最后于72 h時(shí)顯著下降（p＜0.05）。150 μmol/L濃度組，肝胰腺ScSULT1B1-12基因表達(dá)量在前3 h維持同一水平，6 h時(shí)顯著下降（p＜0.05），之后在12 h時(shí)顯著上升（p＜0.05），隨后24 h、48 h、72 h時(shí)保持下降趨勢(shì)。300 μmol/L濃度組，肝胰腺ScSULT1B1-12基因的表達(dá)量在3 h時(shí)略微下降，6 h繼續(xù)下降后于12 h、24 h、48 h時(shí)在同一范圍內(nèi)波動(dòng)，最后于72 h小幅上升。

4 討論

硫是生命的基本元素，硫代謝對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活至關(guān)重要[8]。在該代謝通路中，首先硫化物相繼在SQR、SDO、ST等酶的催化下氧化生成代謝中間產(chǎn)物硫酸鹽[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，硫化物脅迫后縊蟶血液SO24-濃度與脅迫時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。而硫酸鹽必須經(jīng)活化后才能參與SULT介導(dǎo)的磺化反應(yīng)，并在調(diào)節(jié)內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)的生物活性，促進(jìn)其消除中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9,16]。故推測(cè)硫化物脅迫后縊蟶體內(nèi)硫酸鹽產(chǎn)物被活化為PAPS，為磺化反應(yīng)提供通用供體[9]，在激素、兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)等的穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[17]。

SULT1B1屬于SULT超家族成員之一[18]。該超家族基因包含4個(gè)保守的催化活性位點(diǎn)、PAPS結(jié)合域、PAPS結(jié)合和二聚化域[19]。本研究中ScSULT1B1-12基因也具有上述的催化活性位點(diǎn)及保守功能域。其中位于其C端的KTVE基序（KXXXTVXXE）是SULTs中同源和異源二聚體的常見(jiàn)蛋白質(zhì)相互作用基序[20]。大多數(shù)SULTs是以同源二聚體形式存在[21]。這亦與本研究結(jié)果一致，ScSULT1B1-12蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其為同源二聚體。除了SULTs的催化殘基和二聚化區(qū)域外，SULTs最保守的區(qū)域是PAPS結(jié)合域[22]。每個(gè)亞型都必須結(jié)合PAPS才能發(fā)揮其功能[23]。這些活性位點(diǎn)與結(jié)構(gòu)域?yàn)镾cSULT1B1-12發(fā)揮其磺化功能提供了結(jié)構(gòu)支撐。

從ScSULT1B1-12基因的組織表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要在鰓和肝胰腺中高表達(dá)，其中鰓表達(dá)量最高。這可能是由于鰓是水生生物的呼吸器官，直接暴露于硫化物中[11]，其對(duì)脅迫的敏感性較高[24]；而肝胰腺作為經(jīng)典的解毒代謝器官，也是硫化物氧化的主要部位[25-26]。ScSULT1B1-12基因在縊蟶肝胰腺中高表達(dá)，與在嚙齒動(dòng)物和人類中的研究結(jié)果相一致[27]，推測(cè)可能與該器官的強(qiáng)代謝能力有關(guān)[28-29]。

SULT1B1催化以THs為底物的磺化反應(yīng)[10,30]，該反應(yīng)是THs代謝的重要途徑[10]，以調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)THs的穩(wěn)態(tài)。而THs是機(jī)體最重要的激素之一[31]，可調(diào)節(jié)所有組織的新陳代謝[10,31-33]，且能參與免疫調(diào)節(jié)[34-37]。本研究結(jié)果表明，硫化物脅迫下ScSULT1B1-12基因的轉(zhuǎn)錄水平呈波動(dòng)模式，總體呈下降趨勢(shì)。這可能是由于磺化反應(yīng)是導(dǎo)致THs失活的重要一步[10]，在脅迫初期ScSULT1B1-12基因的表達(dá)量顯著升高，使THs大量失活以抑制機(jī)體的生理代謝水平，降低其能量消耗；但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量受抑制，可使THs活性保持在一定水平，以加強(qiáng)機(jī)體代謝機(jī)能來(lái)維持基本生命活動(dòng)所需，同時(shí)提高機(jī)體的免疫功能，以應(yīng)對(duì)高硫化物濃度的不良環(huán)境。此外，縊蟶體內(nèi)S O24-濃度的變化，從一定程度上也反應(yīng)了被活化的硫酸鹽通用供體，還可能參與除SULT1B1外的其他SULT超家族成員介導(dǎo)的磺化反應(yīng)。

5 結(jié)論

本研究對(duì)ScSULT1B1-12基因的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，表明其在結(jié)構(gòu)上具備催化磺化反應(yīng)的能力。組織分布表明，其在鰓和肝胰腺中表達(dá)量較高。硫化物脅迫后縊蟶血液 SO24-濃度呈下降趨勢(shì)，同時(shí)ScSULT1B1-12基因的轉(zhuǎn)錄水平呈抑制趨勢(shì)，表明硫酸鹽可被活化生成磺化反應(yīng)的供體，而ScSULT1B1-12催化的磺化反應(yīng)受抑制后可使縊蟶體內(nèi)THs保持活性，以加強(qiáng)其代謝機(jī)能來(lái)維持機(jī)體的基本生命活動(dòng)，同時(shí)提高機(jī)體的免疫功能，以適應(yīng)高硫化物濃度的不良環(huán)境。

補(bǔ)充材料

表S1 物種拉丁文學(xué)名及其NCBI登錄號(hào)對(duì)照表

補(bǔ)充材料可通過(guò)https://hyxbocean.cn/獲取。補(bǔ)充材料未進(jìn)行排版和編輯，內(nèi)容的準(zhǔn)確性和科學(xué)性由作者承擔(dān)。