李佳穎, 王國(guó)勝, 葉明亮, 秦洪強(qiáng)*

(1. 沈陽(yáng)化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110142; 2. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國(guó)科學(xué)院分離分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023)

蛋白質(zhì)作為生命功能的執(zhí)行者,其表達(dá)量、空間定位與結(jié)構(gòu)差異是調(diào)控細(xì)胞功能活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著人類(lèi)蛋白質(zhì)草圖計(jì)劃的初步完成[1,2],研究者們發(fā)展了一系列用于蛋白質(zhì)高通量、高靈敏度的定性與定量技術(shù),并將其與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等相結(jié)合,用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)等多種生物學(xué)過(guò)程研究,進(jìn)而為蛋白質(zhì)參與生命活動(dòng)過(guò)程的研究提供技術(shù)支撐和數(shù)據(jù)支持。其中,藥物小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用研究,將極大程度地推動(dòng)新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)和原創(chuàng)藥物的研制,進(jìn)而提高臨床治愈效率與國(guó)民的健康生活質(zhì)量。然而,目前尚有超過(guò)85%的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是不可成藥的[3],其主要原因是對(duì)蛋白質(zhì)的功能信息缺乏了解,對(duì)蛋白質(zhì)可以被藥物分子靶向的空腔以及相應(yīng)的反應(yīng)活性位點(diǎn)缺乏研究,從而嚴(yán)重阻礙了新治療策略的發(fā)展。

尋找新靶標(biāo)是藥物研發(fā)的重要環(huán)節(jié),隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)分析藥物或小分子化學(xué)探針與靶標(biāo)蛋白的相互作用取得了長(zhǎng)足進(jìn)步,該技術(shù)挖掘潛在藥物的靶點(diǎn)或現(xiàn)有臨床藥物的未知靶點(diǎn),為藥物研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持?；瘜W(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)可分為化學(xué)修飾蛋白質(zhì)組學(xué)方法和非化學(xué)修飾蛋白質(zhì)組學(xué)方法兩大類(lèi),其中非化學(xué)修飾蛋白質(zhì)組學(xué)方法包括細(xì)胞熱位移測(cè)定(cell thermal displacement assay, CETSA)、熱蛋白組學(xué)分析法(thermal proteome profiling, TPP)和限制性蛋白酶解法(limited proteolysis, LiP)等方法[4]。以上方法基于蛋白質(zhì)與其配體結(jié)合后,通過(guò)靶標(biāo)蛋白及其復(fù)合物對(duì)熱、氧化和酶解等應(yīng)激狀態(tài)的改變進(jìn)行確認(rèn),但其無(wú)法應(yīng)用于與藥物分子結(jié)合構(gòu)象沒(méi)有發(fā)生顯著變化的靶標(biāo)蛋白?；瘜W(xué)修飾蛋白質(zhì)組學(xué)包括親和色譜法(affinity chromatography, AC)和基于活性的蛋白質(zhì)組分析(activity-based protein profiling, ABPP)等方法。AC是化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)策略中較為經(jīng)典的方法之一,主要應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)與生物活性小分子或蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用,但研究分子衍生物活性的不確定性和材料配體結(jié)合力的差異性以及非特異性吸附都將會(huì)干擾研究結(jié)果?；贏BPP方法已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)的研究。通過(guò)活性小分子直接釣取靶標(biāo)蛋白,該方法能夠評(píng)估活性小分子和靶標(biāo)蛋白的結(jié)合狀態(tài)。針對(duì)目前缺乏藥物靶標(biāo)蛋白的挑戰(zhàn),研究者設(shè)計(jì)了多種類(lèi)型的親電活性小分子,實(shí)現(xiàn)了在蛋白質(zhì)提取物、完整細(xì)胞乃至活體等層次蛋白質(zhì)反應(yīng)活性的標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上,利用蛋白質(zhì)組學(xué)的定量技術(shù)實(shí)現(xiàn)藥物靶標(biāo)蛋白的發(fā)現(xiàn)及其作用區(qū)域的鑒定[5]。通過(guò)以上研究,不僅有助于了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,并且有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)和先導(dǎo)化合物,從而解決傳統(tǒng)意義上不可成藥蛋白質(zhì)的問(wèn)題(如圖1所示)。人體內(nèi)蛋白質(zhì)中主要存在20種具有不同反應(yīng)活性的天然氨基酸,并且同一蛋白質(zhì)、同一類(lèi)型氨基酸受到空間微環(huán)境(包括氫鍵相互作用、局部pH值、氧化還原條件或誘導(dǎo)效應(yīng))的影響,導(dǎo)致其空間反應(yīng)活性存在顯著的差異。如何基于ABPP方法進(jìn)行氨基酸反應(yīng)活性的評(píng)估,篩選出高反應(yīng)活性的氨基酸成為其中的關(guān)鍵。本文將聚焦基于不同類(lèi)型活性探針的ABPP技術(shù)在氨基酸反應(yīng)活性篩選領(lǐng)域的研究進(jìn)展,并對(duì)其技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

圖 1 基于活性的蛋白質(zhì)組分析解決不可成藥蛋白質(zhì)的問(wèn)題Fig. 1 Activity-based proteomics addresses the problem of undruggable proteins

1 ABPP技術(shù)概況

ABPP是一種活性導(dǎo)向(主要包括反應(yīng)活性、結(jié)合特異性等)的蛋白質(zhì)組分析方法。1999年Cravatt教授等[6]首次提出這一概念,并將其用于蛋白酶的活性檢測(cè),包括絲氨酸水解酶[7]、蛋白激酶[8,9]、糖苷酶[10,11]、金屬蛋白酶[12]以及氧化還原酶[13]等許多執(zhí)行重要生物功能的蛋白酶家族[14]。并通過(guò)對(duì)酶活性的研究,篩選與疾病密切相關(guān)的關(guān)鍵酶,進(jìn)而開(kāi)發(fā)針對(duì)這些目標(biāo)酶的選擇性抑制劑用于疾病治療[15]。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展和定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的深入,ABPP方法已成功用于藥物靶標(biāo)蛋白篩選等研究,成為蛋白質(zhì)鑒定和表征功能的關(guān)鍵技術(shù),其主要包括基于ABPP的直接富集和基于競(jìng)爭(zhēng)性的ABPP間接富集兩種策略(如圖2所示): 1)基于ABPP的直接富集策略,首先通過(guò)反應(yīng)基團(tuán)將探針與靶標(biāo)蛋白共價(jià)標(biāo)記,后續(xù)利用點(diǎn)擊化學(xué)將探針與報(bào)告基團(tuán)(包括熒光、親和富集等基團(tuán))相連接,再通過(guò)熒光光譜、質(zhì)譜等技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記蛋白的檢測(cè)與鑒定,表征標(biāo)記氨基酸的反應(yīng)活性,進(jìn)而挖掘更多的藥物靶標(biāo)蛋白。其中關(guān)鍵的是,探針以化學(xué)鍵的方式“凍結(jié)”小分子與靶標(biāo)蛋白之間的相互作用,共價(jià)鍵連接可以實(shí)現(xiàn)低親和力靶標(biāo)蛋白的鑒定[16]。該策略具有富集簡(jiǎn)單、背景干擾低等優(yōu)勢(shì),然而其面臨著探針化合物化學(xué)修飾步驟繁瑣、應(yīng)用范圍受限等挑戰(zhàn);2)基于競(jìng)爭(zhēng)性的ABPP間接富集策略,首先利用化合物分子文庫(kù)與蛋白質(zhì)提取物共孵育,后續(xù)使用通用型工具探針?lè)肿舆M(jìn)行蛋白質(zhì)中非文庫(kù)結(jié)合位點(diǎn)的標(biāo)記,結(jié)合同位素定量分析,表征氨基酸與小分子化合物的配位性,挖掘潛在的藥物先導(dǎo)化合物與其靶標(biāo)蛋白。該策略無(wú)需對(duì)化合物進(jìn)行化學(xué)修飾,而是基于通用型化學(xué)探針競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記策略間接進(jìn)行不同小分子化合物靶標(biāo)蛋白的篩選與鑒定,具有良好的通用性與分析通量。目前,該策略主要限于共價(jià)偶聯(lián)藥物及小分子藥物的靶標(biāo)蛋白研究[17]。綜上所述,ABPP技術(shù)助力于潛在的治療蛋白靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、先導(dǎo)化合物的篩選和藥物靶點(diǎn)的識(shí)別,進(jìn)而為原創(chuàng)藥物的設(shè)計(jì)提供參考和幫助。其中,通用型化學(xué)探針的研制被譽(yù)為ABPP策略的“心臟”,其設(shè)計(jì)與研制歷程將在下一節(jié)詳細(xì)介紹。

圖 2 基于ABPP方法發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn)和藥物先導(dǎo)化合物Fig. 2 Discovery of drug targets and lead compounds using activity-based protein profiling (ABPP)

2 針對(duì)氨基酸反應(yīng)活性的ABPP探針研制

如上所述,ABPP技術(shù)的核心是利用化學(xué)探針標(biāo)記一類(lèi)在某些特定環(huán)境中顯示出更高活性的蛋白質(zhì)位點(diǎn)[18]。因此,ABPP探針的選擇是其成敗的關(guān)鍵[19]?；钚蕴结?activity-based probe, ABP)主要由反應(yīng)基團(tuán)、連接臂和報(bào)告基團(tuán)三部分構(gòu)成(如圖3所示)。其中,反應(yīng)基團(tuán)是ABP探針的基礎(chǔ),其通過(guò)共價(jià)鍵等強(qiáng)親和作用力實(shí)現(xiàn)藥物靶標(biāo)的錨定,其反應(yīng)具有高特異性、高轉(zhuǎn)化率的特征,并且反應(yīng)需要具備良好的生物兼容性。報(bào)告基團(tuán)也被稱(chēng)為報(bào)告標(biāo)簽,主要用于后續(xù)標(biāo)記蛋白的可視化和富集檢測(cè)。在標(biāo)記蛋白的可視化研究中,熒光基團(tuán)是一種常見(jiàn)的報(bào)告基團(tuán),主要有羅丹明、熒光素等熒光試劑[20]。此外,多數(shù)報(bào)告基團(tuán)分子尺寸較大,存在著嚴(yán)重的空間位阻效應(yīng)[21]。隨著生物正交反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展,可視化報(bào)告基團(tuán)逐漸被具有生物正交反應(yīng)基團(tuán)(包括炔基、疊氮基等)所取代。新型探針?lè)肿訜o(wú)需直接連接相對(duì)分子質(zhì)量較大的報(bào)告基團(tuán),而是在蛋白標(biāo)記后利用點(diǎn)擊化學(xué)等反應(yīng)引入生物素等報(bào)告基團(tuán),實(shí)現(xiàn)其可視化檢測(cè)[22-25]。該策略既方便探針的合成,又避免了空間位阻影響探針的反應(yīng)活性,同時(shí)為標(biāo)記蛋白的富集和基于質(zhì)譜等策略的檢測(cè)引入可富集標(biāo)簽,為后續(xù)特異性的鑒定提供了保障。連接臂是反應(yīng)基團(tuán)與報(bào)告基團(tuán)之間的橋梁,其通過(guò)調(diào)節(jié)化學(xué)反應(yīng)活性與空間位阻,提高探針的穩(wěn)定性與空間分布。通過(guò)以上3個(gè)部分的有機(jī)組合,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)ABP探針對(duì)靶標(biāo)蛋白的高特異性富集與檢測(cè)。

圖 3 基于活性的化學(xué)探針Fig. 3 Activity-based probe

在基于ABPP策略的氨基酸反應(yīng)活性表征研究方面,由于同一蛋白質(zhì)的不同氨基酸所處的微環(huán)境不同,進(jìn)而導(dǎo)致其反應(yīng)活性存在顯著差異。針對(duì)高反應(yīng)活性氨基酸、蛋白質(zhì)的表征,將為共價(jià)靶向藥物的篩選提供新靶標(biāo),進(jìn)而推動(dòng)共價(jià)靶向類(lèi)原創(chuàng)藥物的研制,因此氨基酸反應(yīng)活性的篩選已成為新的研究熱點(diǎn)。目前,針對(duì)具有親核/親電活性的不同類(lèi)型氨基酸,分別開(kāi)發(fā)了對(duì)應(yīng)的高效標(biāo)記探針,進(jìn)而用于氨基酸反應(yīng)活性的表征。其中,以Cravatt研究團(tuán)隊(duì)為代表,針對(duì)半胱氨酸、賴(lài)氨酸等高親核活性的氨基酸,發(fā)展了一系列具有不同親電活性類(lèi)型的探針,并將其應(yīng)用于體外蛋白質(zhì)提取物中氨基酸反應(yīng)活性的表征[26]。近年來(lái),基于ABPP策略的氨基酸反應(yīng)活性研究擴(kuò)展到其他具有低親核活性的氨基酸,以下將以氨基酸類(lèi)型進(jìn)行分別詳細(xì)介紹。

2.1 半胱氨酸的反應(yīng)活性表征

半胱氨酸約占人類(lèi)蛋白質(zhì)中氨基酸含量的2.3%,雖然其豐度不高,但是其側(cè)鏈的巰基基團(tuán)具有高度的親核性,并且其存在于超過(guò)97%的人源蛋白質(zhì)序列中[27]。同時(shí),半胱氨酸殘基的位置具有高度保守性,其活性與蛋白質(zhì)的生物化學(xué)功能緊密聯(lián)系[28]。目前,半胱氨酸是許多臨床共價(jià)靶向藥物的反應(yīng)靶點(diǎn),如肺癌的二代和三代藥物包括阿法替尼、奧希替尼等。

基于半胱氨酸的強(qiáng)親核性,開(kāi)發(fā)具有不同親電性的ABP探針成為最佳的選擇。親電的碘代乙酰胺與半胱氨酸的巰基發(fā)生取代反應(yīng),使半胱氨酸發(fā)生烷基化?；诖朔磻?yīng)原理,Cravatt等[29]研制了具有高反應(yīng)活性的碘代乙酰胺-炔烴探針,并利用標(biāo)記的炔烴進(jìn)行點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),實(shí)現(xiàn)標(biāo)記位點(diǎn)的富集與鑒定;研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸標(biāo)記效率與濃度存在正相關(guān)性,進(jìn)而發(fā)展了基于高、低濃度的半胱氨酸反應(yīng)活性探測(cè)技術(shù)。進(jìn)一步將其與穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,發(fā)展了基于同位素標(biāo)記定量的串聯(lián)生物正交蛋白質(zhì)標(biāo)記表征技術(shù)(isoTOP-ABPP)。在此基礎(chǔ)上,將其應(yīng)用于乳腺癌等細(xì)胞系中半胱氨酸殘基的反應(yīng)活性表征,共定量到1 082個(gè)半胱氨酸殘基,其中包括350個(gè)具有高反應(yīng)性半胱氨酸殘基,這些位點(diǎn)與蛋白質(zhì)的功能密切相關(guān)[30]?；诘獯阴０?炔烴探針的探測(cè)技術(shù),Backus等[31]構(gòu)建了含有氯乙酰胺和丙烯酰胺的親電小分子片段庫(kù),并在637種蛋白質(zhì)中鑒定了758個(gè)配體半胱氨酸結(jié)合位點(diǎn),分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)所鑒定的蛋白質(zhì)大部分尚未在Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄,其為后續(xù)新的藥物靶標(biāo)蛋白的發(fā)現(xiàn)和篩選提供了新的候選蛋白庫(kù)。同時(shí),發(fā)現(xiàn)GSTO1、RTN4、ACAT1、MLTK等與腫瘤高度相關(guān)的蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的多個(gè)配體小分子,為靶向藥物的研究提供了潛在的藥物前體分子,進(jìn)一步增加半胱氨酸的標(biāo)記和鑒定覆蓋深度,Bar-Peled等[32]將上述工作中發(fā)現(xiàn)的與半胱氨酸具有反應(yīng)性的兩個(gè)親電小分子化合物用于非小細(xì)胞肺癌中潛在藥物靶向活性半胱氨酸位點(diǎn)的高覆蓋度檢測(cè),在6個(gè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)了9 700個(gè)半胱氨酸的高覆蓋度定量,鑒定到約1 100個(gè)可配位的半胱氨酸;同時(shí)發(fā)現(xiàn)NRF2的下游調(diào)控蛋白NR0B1中C274具有高反應(yīng)活性,并被親電的靶向片段藥物分子進(jìn)行共價(jià)修飾,從而破壞轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物的形成和抑制含有KEAP1突變的非小細(xì)胞肺癌的增殖,為肺癌靶向治療研究提供了候選方案。在進(jìn)一步的工作中,Vinogradova等[33]通過(guò)對(duì)富集連接臂與斷裂基團(tuán)進(jìn)行改造,繪制了靜止和刺激狀態(tài)下原代人類(lèi)T細(xì)胞中半胱氨酸反應(yīng)性和親電小分子相互作用圖譜,鑒定到2 283種蛋白質(zhì)中3 466個(gè)配體結(jié)合半胱氨酸,并且發(fā)現(xiàn)親電化合物通過(guò)對(duì)蛋白酶的活性直接抑制以及降解等途徑抑制T細(xì)胞活化,進(jìn)而為獲得性免疫的調(diào)控研究提供新維度。針對(duì)以上技術(shù)需要多步標(biāo)記、操作繁瑣的問(wèn)題,Kuljanin等[34]發(fā)展了基于脫硫生物素碘乙酰胺探針和定量的串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tags, TMT)技術(shù)相結(jié)合的一步“標(biāo)記-富集”技術(shù),實(shí)現(xiàn)高通量篩選半胱氨酸反應(yīng)性片段庫(kù),共表征了超過(guò)8 000個(gè)半胱氨酸殘基反應(yīng)性和285個(gè)親電小分子片段的配位能力,實(shí)現(xiàn)了人源細(xì)胞蛋白中半胱氨酸活性位點(diǎn)的高覆蓋度鑒定與活性篩選。

目前,針對(duì)半胱氨酸反應(yīng)活性的研究主要依賴(lài)于碘代乙酰胺-炔烴探針,其具有反應(yīng)速率快、標(biāo)記活性高的優(yōu)勢(shì)。同時(shí),針對(duì)碘代乙酰胺-炔烴探針的細(xì)胞毒性高、難以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞層次標(biāo)記的難題,Abo等[35,36]開(kāi)發(fā)了光籠基團(tuán)保護(hù)的溴、碘取代親電探針,其與碘代乙酰胺-炔烴探針的反應(yīng)原理相同,溴離子、碘離子與半胱氨酸的巰基發(fā)生親電取代反應(yīng)。但該探針和碘代乙酰胺類(lèi)非保護(hù)探針相比毒性顯著降低,實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中半胱氨酸的標(biāo)記。另一方面,烯丙基酮類(lèi)中的烯鍵易與巰基等發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),該反應(yīng)條件溫和、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,不易發(fā)生光分解等副反應(yīng),因此成為共價(jià)抑制劑設(shè)計(jì)中普遍采用的反應(yīng)彈頭。如上所述,碘代乙酰胺-炔烴探針廣泛用于半胱氨酸反應(yīng)活性探測(cè),烯丙基酮類(lèi)分子則被用于共價(jià)抑制劑的開(kāi)發(fā),這二者的反應(yīng)原理不同,導(dǎo)致半胱氨酸與二者的反應(yīng)活性存在差異,進(jìn)而容易引起藥物設(shè)計(jì)的偏差。因此,發(fā)展基于烯丙基酮類(lèi)探針的半胱氨酸反應(yīng)活性表征技術(shù)成為新的研究方向。Yu等[37]開(kāi)發(fā)了4-乙酰氧基環(huán)戊烯酮探針,其通過(guò)邁克加成反應(yīng)標(biāo)記蛋白中的半胱氨酸,并進(jìn)一步通過(guò)弱堿性條件下的β-消除反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了半胱氨酸的可逆標(biāo)記。α,β-不飽和烯醛與半胱氨酸的巰基具有更高的反應(yīng)活性,Zhang等[38]用4-羥基壬烯醛(HNE)探針標(biāo)記半胱氨酸,進(jìn)而利用醛與羥胺之間的反應(yīng),結(jié)合多重穩(wěn)定同位素標(biāo)記-親和純化(SiLAP)策略在肝細(xì)胞系中鑒定到626個(gè)半胱氨酸修飾位點(diǎn)。以上策略初步展示了烯丙基酮/醛類(lèi)探針在半胱氨酸反應(yīng)活性表征方面的應(yīng)用潛力。然而,以上兩種探針?lè)肿哟嬖谳^大的空間尺寸位阻效應(yīng),導(dǎo)致半胱氨酸的檢測(cè)覆蓋度較低。因此,低空間位阻、高反應(yīng)活性的烯丙基酮/醛類(lèi)探針仍是半胱氨酸活性探測(cè)研究的新方向。

2.2 賴(lài)氨酸的反應(yīng)活性表征

在蛋白質(zhì)氨基酸中,賴(lài)氨酸不僅具有較高的豐度(占人類(lèi)蛋白質(zhì)中的5.9%),而且它的側(cè)鏈伯胺具有一定的親核性,容易與探針發(fā)生共價(jià)生物偶聯(lián)[39]。更重要的是,賴(lài)氨酸通常是許多蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn),比如是酶活性中心位點(diǎn)或者位于蛋白質(zhì)配體的結(jié)合口袋中,進(jìn)而介導(dǎo)蛋白質(zhì)及其配體之間的相互作用。同時(shí),賴(lài)氨酸是生物體內(nèi)最重要的翻譯后修飾的位點(diǎn),包括?；揎?、甲基化修飾、泛素化修飾等翻譯后修飾類(lèi)型,其直接調(diào)控了細(xì)胞的表觀(guān)遺傳、細(xì)胞的發(fā)育和增殖等重要生物學(xué)過(guò)程[40]。因此,基于其重要的生理功能,賴(lài)氨酸被認(rèn)為是最有潛力的共價(jià)靶向藥物結(jié)合位點(diǎn)。針對(duì)賴(lài)氨酸靶向藥物的研究也日益引起關(guān)注,如PI3K激酶活性位點(diǎn)中的賴(lài)氨酸是天然產(chǎn)物渥曼青霉素的靶標(biāo),開(kāi)發(fā)出了PI3K的共價(jià)抑制劑,并已經(jīng)進(jìn)入非小細(xì)胞癌、去勢(shì)抵抗性前列腺癌與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床試驗(yàn)[41,42]。

羧基活化產(chǎn)生的活性酯是目前標(biāo)記賴(lài)氨酸的主要反應(yīng)基團(tuán),該基團(tuán)可與賴(lài)氨酸的氨基發(fā)生取代反應(yīng),現(xiàn)已開(kāi)發(fā)了一系列活性酯化學(xué)探針用于賴(lài)氨酸的選擇性標(biāo)記。Ward等[43]開(kāi)發(fā)了基于商品化的羥基琥珀酰亞胺酯-炔烴(NHS)探針標(biāo)記小鼠肝臟組織中賴(lài)氨酸殘基的方法,該方法鑒定到1 639個(gè)賴(lài)氨酸殘基,且31%是在UniProt網(wǎng)站注釋的功能位點(diǎn),包括結(jié)合活性中心、鈣離子結(jié)合位點(diǎn)和翻譯后修飾位點(diǎn)等。基于NHS的反應(yīng)條件溫和,具有良好的生物兼容性,合成基于NHS-酯的化合物用于靶蛋白中的賴(lài)氨酸的篩選,如二氫嘧啶脫氫酶(Dpyd)中的K497和乙醛脫氫酶2(Aldh2)中的K211等,以上位點(diǎn)為靶向藥物的設(shè)計(jì)提供了候選靶標(biāo)。然而,NHS標(biāo)記試劑存在易水解、交叉性副反應(yīng)等問(wèn)題。針對(duì)這一挑戰(zhàn),Hacker等[44]研制了磺基四氟苯酯(STP)探針用于賴(lài)氨酸反應(yīng)性與配位性的表征,利用該策略鑒定了人源蛋白質(zhì)組中超過(guò)9 000個(gè)賴(lài)氨酸殘基,并篩選出310個(gè)高反應(yīng)性賴(lài)氨酸殘基。在此基礎(chǔ)上,研究者合成了51個(gè)活性酯的小分子化合物,將其用于賴(lài)氨酸殘基與小分子配體的相互作用探測(cè),結(jié)果表明小分子與賴(lài)氨酸之間的共價(jià)標(biāo)記有效抑制了靶標(biāo)蛋白質(zhì)的功能;將其用于SIN3A-TGIF1通路的阻斷,實(shí)現(xiàn)了針對(duì)三陰性乳腺癌靶向干預(yù)研究。Abbasov等[45]進(jìn)一步擴(kuò)展了賴(lài)氨酸反應(yīng)的小分子化合物庫(kù),表征了180個(gè)親氨基化合物與14 000個(gè)賴(lài)氨酸的反應(yīng)性,為具有靶向賴(lài)氨酸位點(diǎn)的共價(jià)藥物的開(kāi)發(fā)提供了更多的信息。

上述探針主要基于賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基與活性酯的取代反應(yīng),該反應(yīng)具有條件溫和、反應(yīng)速率高等優(yōu)勢(shì)。然而,活性酯存在尺寸大、易水解等問(wèn)題,不利于共價(jià)靶向抑制劑的研制。針對(duì)這一挑戰(zhàn),Tang等[46]開(kāi)發(fā)了可調(diào)胺反應(yīng)性親電試劑(TAREs)作為賴(lài)氨酸的共價(jià)探針,該探針具有穩(wěn)定性好、毒性低等優(yōu)勢(shì),在共價(jià)抑制劑的開(kāi)發(fā)方面具有應(yīng)用潛力。醛基與伯胺發(fā)生席夫堿反應(yīng),其產(chǎn)物易發(fā)生降解。對(duì)醛基的取代基進(jìn)行調(diào)控,結(jié)合蛋白質(zhì)的空間限域效應(yīng),有助于形成穩(wěn)定的加合物。Quach等[47]基于羰基硼酸與賴(lài)氨酸氨基的反應(yīng),設(shè)計(jì)了第一個(gè)靶向賴(lài)氨酸的BCR-ABL (breakpoint cluster region Abelson leukemia virus)可逆共價(jià)激酶抑制劑,該抑制劑在體外實(shí)驗(yàn)中展示了優(yōu)異的抑制效果,但是在活細(xì)胞層次抑制效果較差。在此基礎(chǔ)上,他們進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了基于水楊醛的可逆共價(jià)探針用于ABL激酶催化域賴(lài)氨酸的靶向修飾[48],該探針在治療慢性粒細(xì)胞白血病(CML)研究中,展現(xiàn)出良好的細(xì)胞活性抑制效果。鄰硝基芐醇衍生物在光激活條件下會(huì)產(chǎn)生鄰亞硝基苯甲醛,其與伯胺發(fā)生環(huán)化反應(yīng)生成吲唑酮類(lèi)化合物[49,50],該反應(yīng)具有標(biāo)記效率高、反應(yīng)可控等優(yōu)勢(shì)。Chen等[51]將此反應(yīng)與化學(xué)交聯(lián)技術(shù)相結(jié)合,開(kāi)發(fā)了具有賴(lài)氨酸選擇性的遺傳編碼蛋白質(zhì)光交聯(lián)劑。利用紫外光照激活,該光交聯(lián)劑可以在體外和活細(xì)胞中檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用。在進(jìn)一步的工作中[52],將該光交聯(lián)劑引入生物正交反應(yīng)基團(tuán),開(kāi)發(fā)了基于光誘導(dǎo)的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),在活細(xì)胞層次實(shí)現(xiàn)對(duì)賴(lài)氨酸的特異性標(biāo)記。該策略具有反應(yīng)可控的優(yōu)勢(shì),在活細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記具有重要應(yīng)用潛力。綜上所述,隨著醛基反應(yīng)、光標(biāo)記等可控反應(yīng)的引入,賴(lài)氨酸的活性標(biāo)記反應(yīng)逐漸由細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)到活細(xì)胞層次,這極大地推動(dòng)了賴(lài)氨酸作為共價(jià)鍵的靶向藥物的研制。

2.3 酪氨酸的反應(yīng)活性表征

酪氨酸在人類(lèi)蛋白質(zhì)中占3%,多處于蛋白質(zhì)表面,是修飾蛋白質(zhì)的重要位點(diǎn)[53,54]。酪氨酸具有很重要的生物學(xué)功能,比如參與蛋白質(zhì)磷酸化,酶底物之間的結(jié)合以及蛋白-蛋白相互作用等[55]。目前,已報(bào)道了多種靶向酪氨酸的共價(jià)抑制劑[56]。如Hett等[57]利用磺酰氟共價(jià)抑制劑特異性靶向mRNA脫殼酶DcpS中的酪氨酸殘基,用于治療脊髓性肌萎縮癥。因此,酪氨酸反應(yīng)活性的探測(cè)也至關(guān)重要。

在酪氨酸的標(biāo)記方面,Joshi等[58]利用醛和帶電子的苯胺生成亞胺中間產(chǎn)物標(biāo)記酪氨酸,該反應(yīng)條件較溫和。但是,在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)特異性不強(qiáng),存在色氨酸修飾等副反應(yīng)的干擾[59]。Chen等[60]用芳基氟硫酸鹽探針標(biāo)記酪氨酸,可以靶向脂質(zhì)結(jié)合蛋白iLBPs配體結(jié)合位點(diǎn)中的保守酪氨酸殘基,但是該反應(yīng)的特異性也較差。Hahm等[61]通過(guò)硫-苯三唑交換反應(yīng)(SuTEx)實(shí)現(xiàn)對(duì)酪氨酸位點(diǎn)的特異性標(biāo)記,用三唑基團(tuán)替換氟原子增加對(duì)酪氨酸的特異性。鑒定到了3 000個(gè)蛋白質(zhì)中的8 000多個(gè)酪氨酸位點(diǎn),這些位點(diǎn)廣泛分布在酶以及蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域中。通過(guò)穩(wěn)定同位素細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)記(SILAC)定量了2 400個(gè)酪氨酸殘基,篩選出127個(gè)高反應(yīng)性酪氨酸殘基,這些位點(diǎn)與酪氨酸磷酸化的程度呈負(fù)相關(guān)。Brulet等[62]通過(guò)進(jìn)一步改變SuTEx中的離去基團(tuán)和加成基團(tuán)來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)酪氨酸的反應(yīng)活性和位點(diǎn)選擇性,篩選出300多個(gè)可配位的酪氨酸位點(diǎn),并發(fā)現(xiàn)基于SuTEx探針設(shè)計(jì)的JWB142化合物可以選擇性地靶向金屬肽酶DPP3中的Y417位點(diǎn)來(lái)抑制靶標(biāo)活性,JWB198化合物靶向GSTP1的Y8位點(diǎn)來(lái)抑制其活性,這一技術(shù)為靶向酪氨酸的先導(dǎo)化合物研究提供候選分子。酪氨酸的側(cè)鏈苯酚可以與重氮鹽發(fā)生偶聯(lián)偶氮反應(yīng)[63], Sun等[64]通過(guò)改變重氮鹽苯環(huán)上的取代基,增強(qiáng)其對(duì)酪氨酸的反應(yīng)性。該反應(yīng)的標(biāo)記產(chǎn)物可以進(jìn)一步用亞代硫酸鈉釋放,所以該探針標(biāo)記引入的標(biāo)簽尺寸非常小,實(shí)現(xiàn)了超過(guò)5 000個(gè)酪氨酸位點(diǎn)的鑒定。結(jié)合TMT標(biāo)記篩選到75個(gè)高反應(yīng)性酪氨酸殘基,這些高反應(yīng)性位點(diǎn)大多數(shù)位于活性功能蛋白質(zhì)中,包括催化活性、激酶結(jié)合活性和水解酶活性等蛋白質(zhì)。通過(guò)以上策略,初步實(shí)現(xiàn)對(duì)酪氨酸的選擇性標(biāo)記,并利用反應(yīng)的可逆性,顯著降低質(zhì)量標(biāo)簽的相對(duì)分子質(zhì)量,有助于后續(xù)的質(zhì)譜鑒定,進(jìn)而提高標(biāo)記酪氨酸的鑒定覆蓋度,為其活性篩選提供了技術(shù)支持。

2.4 其他低親核性氨基酸的反應(yīng)活性表征

除了上述強(qiáng)親核性的氨基酸殘基外,還有許多低親核性的氨基酸,主要包括谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸和組氨酸等。目前,針對(duì)其活性的研究也取得了重要進(jìn)展。

谷氨酸和天冬氨酸是酸性氨基酸,含有羧基基團(tuán),既是氫鍵的供體,又是受體[65,66]。這一特性大大增加了其特異性標(biāo)記的難度。Li等[67]研制了二芳基四唑光交聯(lián)劑,在紫外線(xiàn)照射下,可以實(shí)現(xiàn)特異性標(biāo)記谷氨酸和天冬氨酸。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步設(shè)計(jì)了四唑骨架的小分子探針光交聯(lián)探針庫(kù)[68],實(shí)現(xiàn)了癌癥標(biāo)志物膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)的高特異性標(biāo)記。Bach等[69]通過(guò)可見(jiàn)光活化的2,5-二取代四唑探針結(jié)合ABPP技術(shù)表征細(xì)菌蛋白質(zhì)組中的天冬氨酸和谷氨酸的反應(yīng)活性,在裂解液和活細(xì)胞層次共定量了近9 000個(gè)天冬氨酸和谷氨酸殘基。以伍德沃德氏試劑K(WRK)和異噁唑鹽作為配體化合物,表征了44個(gè)天冬氨酸和谷氨酸與配體化合物的相互作用。這一技術(shù)填補(bǔ)了羧基氨基酸活性表征的空白,促進(jìn)了針對(duì)羧基共價(jià)抑制劑的開(kāi)發(fā)。Ma等[70]開(kāi)發(fā)3-苯基-2H-吖丙因化學(xué)探針,在裂解液和活細(xì)胞層次標(biāo)記天冬氨酸和谷氨酸,鑒定到1 128個(gè)谷氨酸和549個(gè)天冬氨酸位點(diǎn),且生成的加合物N-苯基乙酰胺具有高穩(wěn)定性。該團(tuán)隊(duì)結(jié)合isoTOP-ABPP技術(shù)篩選到與惡性腫瘤密切相關(guān)的靶標(biāo)蛋白,如胰腺癌的生物標(biāo)志物BASP1蛋白,食管鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物PTMA蛋白等,為相關(guān)腫瘤的早期高靈敏度檢測(cè)和后續(xù)的靶向治療提供候選蛋白質(zhì)分子。綜上,結(jié)合光活化的四唑探針和3-苯基-2H-吖丙因探針的開(kāi)發(fā),現(xiàn)已在裂解液和活細(xì)胞層次實(shí)現(xiàn)天冬氨酸和谷氨酸的活性表征。然而,目前針對(duì)天冬氨酸和谷氨酸的探針開(kāi)發(fā)仍是有限的,尤其是具有標(biāo)記特異性的探針仍有待進(jìn)一步拓展。

甲硫氨酸與半胱氨酸都是含硫氨基酸,但是甲硫氨酸的親核性非常弱,并且具有一定疏水性[71,72]。與半胱氨酸類(lèi)似,甲硫氨酸在蛋白質(zhì)中的豐度比較低,僅有2%左右。甲硫氨酸作為蛋白質(zhì)翻譯的起始氨基酸,屬于生物體的必需氨基酸,具有高度保守性,并且對(duì)體內(nèi)的氧化-還原環(huán)境高度敏感。然而,甲硫氨酸殘基多處于蛋白質(zhì)內(nèi)部,難以進(jìn)行精準(zhǔn)的靶向[73],針對(duì)甲硫氨酸化學(xué)探針的開(kāi)發(fā)仍是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)[74]。Kharenko等[75]通過(guò)靶向甲硫氨酸開(kāi)發(fā)與多種癌癥相關(guān)的溴結(jié)構(gòu)域蛋白-4(BRD4)的共價(jià)抑制劑,顯示了開(kāi)發(fā)以甲硫氨酸為靶點(diǎn)的共價(jià)抑制劑的應(yīng)用前景。Chang等[76]利用氧化還原化學(xué)標(biāo)記(ReACT)策略標(biāo)記蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸,通過(guò)氧氮丙啶試劑與硫醚形成亞磺酰亞胺標(biāo)記,在生理?xiàng)l件下標(biāo)記了235個(gè)甲硫氨酸殘基,進(jìn)一步將該策略與isoTOP-ABPP技術(shù)相結(jié)合,篩選到111個(gè)具有高反應(yīng)性的甲硫氨酸殘基,這些位點(diǎn)包括糖酵解代謝途徑中心烯醇化酶中的3個(gè)高反應(yīng)性甲硫氨酸殘基。尤其值得注意的是,靠近活性位點(diǎn)高度保守的171位點(diǎn)對(duì)烯醇化酶功能的氧化還原調(diào)節(jié)至關(guān)重要,發(fā)現(xiàn)171位點(diǎn)突變的菌株對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有更強(qiáng)的抵抗力。綜上,基于氧氮丙啶開(kāi)發(fā)的ReACT策略可以實(shí)現(xiàn)對(duì)甲硫氨酸的活性表征,但是現(xiàn)有針對(duì)甲硫氨酸的化學(xué)探針?lè)N類(lèi)仍比較單一,尚難以實(shí)現(xiàn)甲硫氨酸功能位點(diǎn)圖譜的高覆蓋度檢測(cè),有待新的化學(xué)標(biāo)記反應(yīng)及探針的引入。

組氨酸在人類(lèi)蛋白質(zhì)中約占2%,是pKa值唯一接近7的氨基酸[77]。組氨酸的側(cè)鏈為咪唑基團(tuán),在生理環(huán)境中既能接受質(zhì)子又能提供質(zhì)子,發(fā)揮著質(zhì)子傳遞的作用。同時(shí),組氨酸占據(jù)超過(guò)1/5人源酶活性中心,在蛋白質(zhì)中發(fā)揮多重作用[78],包括與金屬離子配位、質(zhì)子受體和酸堿催化等[79,80]。目前,組氨酸磷酸化修飾已被報(bào)道與惡性腫瘤疾病密切相關(guān)[81-83]。Zhang等[84]發(fā)現(xiàn)白喉毒素催化真核翻譯延伸因子2 (eEF2)發(fā)生ADP核糖基化修飾,組氨酸是白喉疾病的修飾靶點(diǎn),通過(guò)靶向組氨酸的小分子可以有效阻斷白喉疾病,是白喉疾病理想的治療靶點(diǎn)[85]。然而,組氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)活性極低,常規(guī)親核試劑難以與其形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵,對(duì)于組氨酸化學(xué)探針的開(kāi)發(fā)仍處于起步階段。Li等[86]利用環(huán)氧化物實(shí)現(xiàn)組氨酸殘基標(biāo)記,并研制了基于環(huán)氧化物的熒光探針,用于測(cè)定人血清中的組氨酸探測(cè)。然而,該反應(yīng)條件相對(duì)苛刻,在生理?xiàng)l件下難以實(shí)現(xiàn)對(duì)組氨酸的標(biāo)記及活性探測(cè)。烯烴可以和組氨酸的側(cè)鏈咪唑基團(tuán)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng),Joshi等[87]基于此反應(yīng)原理研發(fā)環(huán)己烯酮特異性標(biāo)記組氨酸,但該反應(yīng)的反應(yīng)速度較慢,難以實(shí)現(xiàn)組氨酸的快速標(biāo)記。Jia等[88]受組氨酸磷酸化翻譯后修飾的啟發(fā),合成了一系列關(guān)于膦親電試劑,在堿性條件下實(shí)現(xiàn)了組氨酸的快速標(biāo)記。該化學(xué)探針可以實(shí)現(xiàn)組氨酸的標(biāo)記,但是尚難以實(shí)現(xiàn)生理?xiàng)l件下組氨酸的快速標(biāo)記,進(jìn)而難以在復(fù)雜樣品中對(duì)組氨酸活性進(jìn)行全局分析。我們?cè)诮诘墓ぷ髦邪l(fā)展了基于α,β-不飽和烯醛的組氨酸標(biāo)記反應(yīng),初步實(shí)現(xiàn)了生理?xiàng)l件下組氨酸的高效標(biāo)記,目前工作還處在進(jìn)一步完善中。

綜上所述,雖然已有部分化學(xué)探針可以靶向天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸和組氨酸等親核性較弱氨基酸[89,90],但是針對(duì)親核較弱氨基酸的探針開(kāi)發(fā)仍是很大的挑戰(zhàn),尤其是尚缺乏對(duì)組氨酸活性進(jìn)行全局分析的探針。因此,亟需開(kāi)發(fā)與ABPP方法兼容的新型反應(yīng)彈頭,探索新的藥物靶點(diǎn)和藥物先導(dǎo)化合物。

3 總結(jié)與展望

基于化學(xué)探針和活性蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合技術(shù)評(píng)估氨基酸側(cè)鏈的反應(yīng)活性,進(jìn)而篩選新的藥物靶點(diǎn)及其先導(dǎo)化合物,可以助力于共價(jià)抑制劑藥物的開(kāi)發(fā)[91]。目前研究的化學(xué)探針主要靶向半胱氨酸、賴(lài)氨酸等具有強(qiáng)親核性的氨基酸,關(guān)于親核性較弱的氨基酸(如組氨酸、甲硫氨酸和天冬氨酸)等仍需要開(kāi)發(fā)新的化學(xué)探針,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)更多不可成藥蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵靶向調(diào)控研究。未來(lái)ABPP的發(fā)展可能還會(huì)涉及其他的小分子,比如RNA、DNA中的活性位點(diǎn),幫助開(kāi)發(fā)疾病治療新策略。同時(shí),ABPP蛋白組學(xué)富集方法需要在化學(xué)探針上修飾炔基或疊氮基團(tuán),進(jìn)而基于點(diǎn)擊化學(xué)引入生物素等反應(yīng)探針進(jìn)行靶標(biāo)蛋白的鑒定。然而,針對(duì)基于氨基酸反應(yīng)活性的探測(cè)反應(yīng),最關(guān)鍵的是修飾肽段的鑒定。目前,基于點(diǎn)擊化學(xué)的策略需要多步富集,容易引入大質(zhì)量標(biāo)簽,不利于標(biāo)記肽段的鑒定。如何發(fā)展針對(duì)修飾肽段的一步捕獲與可逆釋放技術(shù)成為其中的關(guān)鍵。我們課題組前期發(fā)展了基于可逆的酰肼化學(xué)富集的O-GalNAc和O-GlcNAc糖肽富集新方法[92-94],其主要是通過(guò)醛基與酰肼、羥胺之間的可逆反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了標(biāo)記肽段的可逆富集。與常規(guī)的點(diǎn)擊化學(xué)策略相比,該策略具有反應(yīng)效率高、引入質(zhì)量標(biāo)簽小等優(yōu)勢(shì),利于標(biāo)記肽段的鑒定。因此,可逆的酰肼化學(xué)作為一種新的富集方法,一步反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)標(biāo)記與富集,在熒光和質(zhì)譜的檢測(cè)方面都具有突出優(yōu)勢(shì)。同時(shí),其他基于可逆反應(yīng)的新型氨基酸標(biāo)記策略的引入,也必將推動(dòng)氨基酸反應(yīng)活性表征技術(shù)的發(fā)展,進(jìn)而為靶向藥物的研究加入新的活力。