鄧 鳴，曾慶花，朱健萍，盧日剛

(廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西南寧 530021)

非那雄胺(Finasteride)化學(xué)名稱為N-叔丁基-3-氧代-4-氮雜-5α-雄甾-1-烯-17β-甲酰胺，分子式為C23H36N2O2。非那雄胺最早由美國默沙東公司開發(fā)研制，1991年獲準(zhǔn)上市。非那雄胺是一種合成的甾體激素化合物，它是雄激素睪酮代謝為雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)過程中的細(xì)胞內(nèi)酶Ⅱ型5α還原酶的特異性抑制劑，具有抑制睪酮代謝的作用。良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia，BPH，也稱為前列腺肥大)有賴于體內(nèi)有效的雙氫睪酮的含量，即取決于前列腺中睪酮向DHT的轉(zhuǎn)化。非那雄胺能有效降低血液和前列腺內(nèi)的DHT濃度。目前非那雄胺制劑有5 mg和1 mg兩種規(guī)格，前者適應(yīng)證為治療和控制良性前列腺增生及相關(guān)癥狀，后者用于治療男性脫發(fā)[1,2]。

經(jīng)查閱各國藥典，非那雄胺被《中華人民共和國藥典：2020年版·二部》[3]、EuropeanPharmacopoeia(《歐洲藥典》)10.0版[4]、UnitedStatesPharmacopeia(《美國藥典》)2022年版[5]收載，均采用高效液相色譜(High Performance Liquid Chomatography,HPLC)法檢查有關(guān)物質(zhì)。其中《歐洲藥典》10.0版該品種項(xiàng)下給出了雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C的結(jié)構(gòu)?！吨腥A人民共和國藥典:2020年版·二部》中雜質(zhì)I即為《歐洲藥典》10.0版中的雜質(zhì)A，在以下的敘述中該雜質(zhì)均以雜質(zhì)A表示。

文獻(xiàn)[6-9]采用高效液相色譜法分離非那雄胺雜質(zhì)。近年來,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已日臻成熟,并被廣泛應(yīng)用于藥物中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定及來源分析[10-14]。本研究擬采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(High Performance Liquid Chromatography- Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS)研究非那雄胺的雜質(zhì)，并通過分析非那雄胺的裂解特征，與已知雜質(zhì)對(duì)照品比對(duì)，通過強(qiáng)制降解試驗(yàn)等途徑對(duì)其中的主要雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷，推測雜質(zhì)可能的來源，以期為藥品雜質(zhì)控制和工藝優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Waters Xevo G2 Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司),MILLI-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司),XS205DU 電子天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司]。

非那雄胺對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100611-201503，含量99.7%)，雜質(zhì)I (雜質(zhì)A)(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)420023-201501)，雜質(zhì)B(Toronto Research Chemicals Inc.，批號(hào)Y11M10W86170)，雜質(zhì)C (Toronto Research Chemicals Inc.，批號(hào)Y11M10W86171)。

非那雄胺原料來源于國內(nèi)兩個(gè)廠家，A廠家及B廠家各1批。乙腈為色譜純?cè)噭?，水為超純水，其他試劑為分析純?/p>

1.2 溶液的制備

混合對(duì)照品溶液：稱取非那雄胺對(duì)照品、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C對(duì)照品各約1 mg，置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液：稱取非那雄胺原料(A廠家或B廠家)約10 mg，置10 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.3 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

取非那雄胺原料(A廠家)約50 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

精密量取貯備液1 mL，置于5 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液1 mL，放置5 h，加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL中和，加50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得酸破壞溶液。

精密量取貯備液1 mL，置5 mL量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，放置2 h，加入1 mol/L 鹽酸溶液1 mL中和，加50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得堿破壞溶液。

精密量取貯備液1 mL，置5 mL量瓶中，加30%過氧化氫溶液1 mL，放置1 h，加入50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得氧化破壞溶液。

取非那雄胺原料(A廠家)適量，置120℃烘箱中加熱5 h，放冷，稱取約10 mg置10 mL量瓶中，加入50%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得高溫破壞溶液。

取非那雄胺原料(A廠家)適量，置4 500 lx光照條件下放置48 h，稱取約10 mg置10 mL量瓶中，加入50%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得強(qiáng)光破壞溶液。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：資生堂Capell-MGⅡ C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為乙腈∶水(45∶55)，流速：1.0 mL·min-1；柱后分流，檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：ESI(+/-)；數(shù)據(jù)采集質(zhì)荷比(m/z) 80-800；干燥氣溫度：350℃；脫溶劑氣(N2)流速：6.0 L·min-1；碰撞電壓：10-30 eV；毛細(xì)管電壓:4.5 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 非那雄胺高效液相色譜圖及雜質(zhì)來源分析

將非那雄胺供試品溶液、強(qiáng)制降解溶液進(jìn)樣后，主峰與各雜質(zhì)峰分離良好。供試品溶液中主要有15個(gè)峰，按保留時(shí)間順序命名為雜質(zhì)1-15 (圖1)。強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果表明，非那雄胺在氧化、光照、高溫條件下較穩(wěn)定，未產(chǎn)生明顯的降解產(chǎn)物；強(qiáng)酸破壞時(shí)雜質(zhì)4含量明顯增大，雜質(zhì)6和雜質(zhì)8含量有小幅度增大；強(qiáng)堿破壞時(shí)雜質(zhì)2增大；高溫破壞時(shí)雜質(zhì)C含量有小幅度增大。因此雜質(zhì)1，3，5，7，9，10，11，12，14，15為工藝雜質(zhì)，雜質(zhì)2，4，6，8和C可能是降解雜質(zhì)，也可能是工藝雜質(zhì)。通過分析雜質(zhì)的來源，提示企業(yè)應(yīng)優(yōu)化生產(chǎn)工藝，并在貯藏及運(yùn)輸過程中控制溫度，減少非那雄胺降解反應(yīng)的發(fā)生。

a:Mixed solution of reference substances;b:Finasteride (A manufacturer);c:Finasteride (B manufacturer);d:Acidic hydrolysis;e:Alkaline hydrolysis;f:Oxidative degradation;g:Photolytic degradation;h:Thermo degradation；number 1-15：Impurity 1-15圖1 對(duì)照品混合溶液、原料供試液及強(qiáng)制降解溶液高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference solution,raw test solution and forced degradation solution

2.2 非那雄胺主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

雜質(zhì)結(jié)構(gòu)與主藥往往具有相關(guān)性，通過分析非那雄胺二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律并結(jié)合破壞試驗(yàn)推測雜質(zhì)1，2，5，6，8，10，13，14等8種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其中雜質(zhì)10，13分別對(duì)應(yīng)《歐洲藥典》10.0版的特定雜質(zhì)A、C，其他7種雜質(zhì)因含量過低或受其他因素干擾，未推斷出結(jié)構(gòu)。為了確證所推斷的機(jī)理，對(duì)推斷的雜質(zhì)均進(jìn)行了高分辨數(shù)據(jù)分析(表1) 。

表1 雜質(zhì)準(zhǔn)分子離子理論值與實(shí)驗(yàn)值的偏差計(jì)算Table 1 Deviation calculation of theoretical values and experimental values of the impurities in MS2

2.2.1 非那雄胺

非那雄胺準(zhǔn)分子離子m/z為373.286 4，其二級(jí)質(zhì)譜碎片中主要的碎片峰為側(cè)鏈斷裂后,脫掉分子量為56的叔丁基形成m/z為317.223 4的碎片離子，其側(cè)鏈還可繼續(xù)斷裂生成m/z分別為299.214 9，282.186 6，272.204 3的碎片離子，母核結(jié)構(gòu)中的氮雜環(huán)開環(huán)后脫去質(zhì)量數(shù)為68的C4H4O后可形成m/z為305.259 9的碎片離子，該碎片離子進(jìn)一步脫去側(cè)鏈的基團(tuán)后可生成m/z分別為187.148 6，215.142 0的碎片離子，但豐度均較少，其二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖2。

圖2 非那雄胺[M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.2 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and fragmentation pathway of finasteride

2.2.2 雜質(zhì)13

在HPLC-UV-Q-TOF-MS中，雜質(zhì)13的液相保留時(shí)間、紫外光譜圖、準(zhǔn)分子離子(m/z為371.269 1)及二級(jí)質(zhì)譜均與雜質(zhì)C對(duì)照品一致，因此確證雜質(zhì)13為雜質(zhì)C。

雜質(zhì)C為非那雄胺合成過程的中間產(chǎn)物。雜質(zhì)C的裂解方式與非那雄胺類似，側(cè)鏈斷裂后可形成m/z分別為315.206 3，298.184 5，270.185 3，280.169 6的碎片離子，母核結(jié)構(gòu)中的氮雜環(huán)開環(huán)后脫去C4H4O后可形成m/z為303.247 3的碎片離子。母核結(jié)構(gòu)中的C5與C6為雙鍵，易脫去C上的甲基，形成具有共軛雙鍵的碎片結(jié)構(gòu)，該碎片離子的m/z為355.236 9。雜質(zhì)C二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖3。

圖3 雜質(zhì)13 [M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.3 Impurity 13 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.3 雜質(zhì)10

雜質(zhì)10的液相保留時(shí)間、紫外光譜圖均與《歐洲藥典》10.0版收載的雜質(zhì)A對(duì)照品一致。在HPLC-UV-Q-TOF-MS中該雜質(zhì)的準(zhǔn)分子離子(m/z為375.301 7)及其二級(jí)質(zhì)譜中各子離子的質(zhì)荷比、豐度也與雜質(zhì)A對(duì)照品基本一致，因此確認(rèn)雜質(zhì)10為雜質(zhì)A。

雜質(zhì)A的裂解方式與非那雄胺類似，側(cè)鏈斷裂后形成的碎片離子以及母核結(jié)構(gòu)中的氮雜環(huán)開環(huán)后形成碎片離子。雜質(zhì)A二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖4。

圖4 雜質(zhì)10 [M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.4 Impurity 10 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.4 雜質(zhì)1

雜質(zhì)1在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為389.282 1，較非那雄胺的準(zhǔn)分子離子質(zhì)荷比約多16，推測為多一個(gè)氧原子，其二級(jí)譜圖中出現(xiàn)了較母離子少72的碎片離子，推測非那雄胺結(jié)構(gòu)中的叔丁基氧化為叔丁醇。雜質(zhì)1的裂解方式與非那雄胺類似，二級(jí)圖譜中有側(cè)鏈斷裂后形成的碎片離子以及母核結(jié)構(gòu)中的氮雜環(huán)開環(huán)后形成碎片離子，此處不再贅述。雜質(zhì)1二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖5。

圖5 雜質(zhì)1 [M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.5 Impurity 1 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.5 雜質(zhì)2

雜質(zhì)2在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為391.297 2，與非那雄胺的m/z相差約18，且其二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，推測該雜質(zhì)為非那雄胺的氮雜環(huán)水解開環(huán)后生成的雜質(zhì)。其二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z為373.288 2的碎片為羧酸與氨基重新環(huán)合生成的。雜質(zhì)2二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖6。

圖6 雜質(zhì)2 [M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.6 Impurity 2 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.6 雜質(zhì)3

雜質(zhì)3在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為387.264 4，與非那雄胺的m/z相差約14，推測可能的分子式為C23H34N2O3，其二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)M+H-54、M+H-68的碎片峰，未出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，因此推測雜質(zhì)3具有與非那雄胺相同的氮雜環(huán)，而側(cè)鏈部分結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。另外，雜質(zhì)3二級(jí)質(zhì)譜中的碎片離子與非那雄胺均不一致，推測其母環(huán)結(jié)構(gòu)與非那雄胺不同，根據(jù)現(xiàn)有的信息無法推測碎片離子的組成，因此未能推斷其結(jié)構(gòu)。

2.2.7 雜質(zhì)4

雜質(zhì)4在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為389.278 8，與非那雄胺的m/z相差約16，推測可能的分子式為C23H36N2O3，其二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，未出現(xiàn)M+H-68的碎片峰，因此推測雜質(zhì)4母核結(jié)構(gòu)與非那雄胺不一致。根據(jù)現(xiàn)有的信息無法推測碎片離子的組成，因此未能推斷其結(jié)構(gòu)。

2.2.8 雜質(zhì)5

雜質(zhì)5在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為387.264 4，與非那雄胺的m/z相差約14，其二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)M+H-56、M+H-68碎片峰，未出現(xiàn)M+H-73的碎片峰，而出現(xiàn)了M+H-87，因此雜質(zhì)5側(cè)鏈上的叔丁基結(jié)構(gòu)未變，而N上多一個(gè)甲基。雜質(zhì)5二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖7。

圖7 雜質(zhì)5 [M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.7 Impurity 5 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.9 雜質(zhì)6

雜質(zhì)6在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為391.297 9，與非那雄胺的m/z相差約18。雜質(zhì)6二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)M+H-56、M+H-73碎片峰，未出現(xiàn)M+H-68的碎片峰，因此推測雜質(zhì)6為非那雄胺母核氮雜環(huán)發(fā)生了變化。雜質(zhì)6二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖8。

圖8 雜質(zhì)6 [M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.8 Impurity 6 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.10 雜質(zhì)8

雜質(zhì)8在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為389.280 5，與非那雄胺的m/z相差約16。雜質(zhì)8二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)M+H-56、M+H-68碎片峰，而其他碎片離子均與非那雄胺不一致，由于N原子可能會(huì)被氧化，因此推測雜質(zhì)8為非那雄胺母核氮雜環(huán)形成了氮氧化物。雜質(zhì)8二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖9。

圖9 雜質(zhì)8 [M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.9 Impurity 8 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.11 雜質(zhì)9

雜質(zhì)9在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為389.279 2，與非那雄胺的m/z相差約16。雜質(zhì)6二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，未出現(xiàn)M+H-68的碎片峰，因此推測雜質(zhì)9為非那雄胺母核氮雜環(huán)發(fā)生了變化，可能為雙鍵氧化成酮基。雜質(zhì)9二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖10。

圖10 雜質(zhì)9 [M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.10 Impurity 9 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.12 雜質(zhì)11

雜質(zhì)11在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為371.270 0，與非那雄胺雜質(zhì)C的分子量一致。雜質(zhì)11的二級(jí)質(zhì)譜與雜質(zhì)C部分一致，都出現(xiàn)m/z分別為298，280，270的碎片峰，因此推測雜質(zhì)11為非那雄胺母核碳碳雙鍵位置不同，已有信息無法判斷雙鍵的位置，因此未能推斷其結(jié)構(gòu)。

2.2.13 雜質(zhì)14

雜質(zhì)14在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準(zhǔn)分子離子m/z為387.301 5，與非那雄胺的m/z相差約14。雜質(zhì)6二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)M+H-68、M+H-70的碎片峰，未出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，因此推測雜質(zhì)14為非那雄胺側(cè)鏈N原子被2-甲基丁基取代。雜質(zhì)14二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑見圖11。

圖11 雜質(zhì)14 [M+H]+二級(jí)掃描質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.11 Impurity 14 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.14 其他雜質(zhì)

雜質(zhì)7，12和15由于峰響應(yīng)較低，未能推斷其結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

本文采用HPLC-TOF-MS對(duì)兩家非那雄胺原料生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩家生產(chǎn)的非那雄胺其雜質(zhì)的種類及含量存在一定差異；鑒定出8種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并推測了部分雜質(zhì)的來源，可為非那雄胺雜質(zhì)控制和工藝優(yōu)化提供參考依據(jù)。