閆然，秦雪梅，王琪，蔡瑾*

1.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心（太原 030006）；2.山西大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（太原 030006）；3.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所（太原 030006）；4.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（太原 030006）

植物源殺菌劑是一類綠色健康殺菌劑，能夠殺死或抑制病原菌，具有對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[4]。許多可食用植物的非食用部位能提取出具有抑菌活性的物質(zhì)。菱角（Trapa bispinosaRoxb），又名菱實(shí)、沙角，在我國(guó)作為食物被廣泛種植[5]。菱角殼是菱角果實(shí)的外皮，一般在菱角果實(shí)加工時(shí)被丟棄，沒(méi)有得到有效的開(kāi)發(fā)和利用，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6]。有研究表明在菱角殼中存在抑菌活性物質(zhì)[7]。因此，試驗(yàn)以菱角殼為材料，以Cmm為供試菌，對(duì)菱角殼活性物質(zhì)的提取條件進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，以期提高菱角殼抑制Cmm活性物質(zhì)的產(chǎn)量；分析菱角殼活性物質(zhì)處理后Cmm的AKP活性、細(xì)胞膜通透性及細(xì)胞膜電位的變化。試驗(yàn)結(jié)果可為Cmm綠色有效防治及番茄的食用安全提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菱角，購(gòu)自浙江嘉興南湖，洗凈后剝殼、晾干，粉碎備用。

番茄潰瘍病菌（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm）由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供，試驗(yàn)完成后所有病菌及試驗(yàn)用具均已做除害處理。

羅丹明123（Sigma公司）；無(wú)水乙醇、二甲基亞砜（天津市大茂化學(xué)制劑廠）；PI染色試劑盒（上海生工生物有限公司）；AKP測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek儀器有限公司）；F-280型熒光分光光度計(jì)（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菱角殼活性物質(zhì)提取流程

質(zhì)疑與建構(gòu)：著作權(quán)法創(chuàng)作激勵(lì)目的之二重奏............................................................................................司 明 02.77

菱角殼粉碎后過(guò)0.300 mm孔徑（50目）篩，用無(wú)水乙醇作為溶劑，以一定的溫度、時(shí)間和料液比回流提取。提取液在2 500 r/min下離心15 min，所得上清液旋蒸去除溶劑后得到粉末狀固體，即為菱角殼抗Cmm活性物質(zhì)。

1.3.2 菱角殼抑菌活性物質(zhì)的檢測(cè)

將1.3.1所得活性物質(zhì)用40% DMSO配制至20 mg/mL。DMSO（40%）作為陰性對(duì)照。通過(guò)在瓊脂平板上打孔來(lái)測(cè)定抑菌活性。在瓊脂平板培養(yǎng)基上加入200 μL Cmm的細(xì)菌懸浮液（106CFU/mL）并涂布均勻。用10 mm打孔器在上述培養(yǎng)基上均勻打孔，并將200 μL各提取條件下得到的活性物質(zhì)加入到對(duì)應(yīng)孔中，培養(yǎng)箱（28 ℃，1 d）培養(yǎng)后，測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.3.3 菱角殼抑菌活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

參照1.3.1提取菱角殼活性物質(zhì)，并用1.3.2的方法檢測(cè)活性物質(zhì)的抑菌效果。以抑菌圈直徑為指標(biāo)檢測(cè)并分析菱角殼活性物質(zhì)受提取溫度（20，40，60，80和100 ℃）、提取時(shí)間（3，6，9，12和15 h）、料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25 g/mL）影響下抑菌能力的變化。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)置溫度（A）、時(shí)間（B）、料液比（C）3種因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平。試驗(yàn)選用L27(313)正交設(shè)計(jì)表（表1），正交試驗(yàn)的27份菱角殼活性物質(zhì)標(biāo)記順序號(hào)1～27。將所得27組菱角殼活性物質(zhì)按照1.3.2的方法測(cè)抑菌活性。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析，以獲得最佳的提取條件。后續(xù)試驗(yàn)所用的菱角殼活性物質(zhì)均在最佳提取條件下獲得。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

1.3.4 測(cè)定菱角殼活性物質(zhì)最小抑菌濃度（MIC）

菱角殼活性物質(zhì)的MIC采用96孔板微量稀釋法測(cè)定。菱角殼活性物質(zhì)用7% DMSO助溶后加入到液體培養(yǎng)基中，采用二倍稀釋法，使其最終濃度達(dá)到40～0.01 mg/mL。另配7% DMSO的樣品作為陰性對(duì)照。將200 μL上述液體培養(yǎng)基和10 μL菌液（106CFU/mL）依次加入于96孔板的對(duì)應(yīng)孔中，于28 ℃培養(yǎng)1 d。肉眼觀察培養(yǎng)基渾濁度。

1.3.5 對(duì)細(xì)胞壁的影響試驗(yàn)

取100 mL液體培養(yǎng)基，在其中加入100 μL Cmm（106CFU/mL）及定量用0.2% DMSO助溶的菱角殼活性物質(zhì)，調(diào)終濃度至1/2 MIC，MIC和2 MIC。以不加入菱角殼活性物質(zhì)的樣品作為陰性對(duì)照，搖床培養(yǎng)（28 ℃，120 r/min，24 h）。在4 000 r/min下離心10 min取上清液。AKP測(cè)定試劑盒用于檢測(cè)上清液中AKP活性，即為細(xì)胞外AKP活性。

1.3.6 細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

取100 mL液體培養(yǎng)基，在其中加入100 μL Cmm（106CFU/mL）及定量用0.2% DMSO助溶的菱角殼活性物質(zhì)，調(diào)終濃度至1/2 MIC，MIC和2 MIC，以僅加入0.2% DMSO無(wú)菱角殼活性物質(zhì)的樣品作為陰性對(duì)照，搖床培養(yǎng)（28 ℃，120 r/min，24 h）。將樣品以4 000 r/min的速度離心10 min，除去上清液，用生理鹽水沖洗3次，重新懸浮，調(diào)A600nm=0.6。取95 μL菌液與5 μL PI染劑充分混合均勻，黑暗下室溫孵育30 min，生理鹽水沖洗3次，再次重懸，在λex=488 nm和λem=630 nm條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.3.7 細(xì)胞膜電位變化的測(cè)定

按1.3.6方法制備A600nm=0.6重懸液。在1.5 mL重懸液中加入5 μL的羅丹明123。避光培養(yǎng)30 min后，生理鹽水洗滌3次，重懸后測(cè)定熒光強(qiáng)度（λex=505 nm和λem=530 nm）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均平行重復(fù)3次，使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性采用Duncan新復(fù)極差法檢測(cè)，數(shù)值=平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菱角殼活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)分析

菱角殼活性物質(zhì)抑菌效果受提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素的影響，結(jié)果在圖1中顯示。圖1（A）顯示，菱角殼活性物質(zhì)的抑菌效果在20～60 ℃的提取溫度下，隨著提取溫度的升高而增強(qiáng)，達(dá)到60℃時(shí)抑菌效果最佳（P＜0.05），此后隨著溫度的升高，抑菌效果開(kāi)始減弱。因此，選擇40，60和80 ℃進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。圖1（B）說(shuō)明，提取時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)使菱角殼活性物質(zhì)的抑菌效果呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。提取時(shí)間為6 h時(shí)抑菌效果最佳（P＜0.05），因此選擇3，6和9 h進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。圖1（C）表明，料液比1∶5 g/mL時(shí)，抑菌活性較弱，料液比變化至1∶10 g/mL時(shí)，抑菌效果最強(qiáng)，此后液體占比進(jìn)一步增大，抑菌作用逐步減弱。因此，選擇1∶5，1∶10和1∶15 g/mL進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

圖1 提取溫度、提取時(shí)間、料液比對(duì)菱角殼活性物質(zhì)抑菌效果的影響

2.1.2 正交試驗(yàn)分析

為考察不同因素間的相互作用對(duì)菱角殼活性物質(zhì)抑菌效果的影響，并分析最佳提取條件，用L27(313)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行提取溫度、提取時(shí)間、料液比3個(gè)因素的正交試驗(yàn)。表2顯示正交試驗(yàn)的結(jié)果，菱角殼的活性物質(zhì)對(duì)Cmm的抑制作用因提取條件不同而有顯著差異。根據(jù)極差值R大小，溫度（A）、時(shí)間（B）和料液比（C）影響菱角殼活性物質(zhì)抑菌效果的先后順序可排列為B＞A＞C。就不同因素相互作用的影響而言，由溫度和時(shí)間交互作用（AB）、溫度和料液比交互作用（AC）、時(shí)間和料液比交互作用（BC）產(chǎn)生的極差R分別為是2.71，1.83和2.69，因此，交互作用的影響大小順序依次可排列為AB＞BC＞AC。綜合考察因素以及因素間交互作用的極差值R大小，影響菱角殼活性物質(zhì)抑菌效應(yīng)的因素順序依次可排列為AB＞BC＞B＞A＞AC＞C。

表2 L27(313)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

接表2

用方差分析法分析正交試驗(yàn)結(jié)果，考察菱角殼活性物質(zhì)的抑菌效果受各因素及各因素間交互作用的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。菱角殼活性物質(zhì)對(duì)Cmm的抑制作用，在所考察的3種提取條件中，受提取溫度（F=11.39＞F0.01（2,8）=8.65）和時(shí)間（F=15.80＞F0.01（2,8）=8.65）的影響是非常顯著的；提取料液比沒(méi)有顯著（F=0.84＜F0.05（2,8）=4.46）影響菱角殼活性物質(zhì)對(duì)Cmm的抑制效果。同時(shí)，提取時(shí)間與提取溫度及提取時(shí)間與料液比之間有顯著（F=4.35＞F0.05（4,8）=3.84；F=4.29＞F0.05（4,8）=3.84）交互作用，但提取溫度和料液比間不存在交互作用（F=0.13＜F0.05（4,8）=3.84）。

表3 正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，理論最優(yōu)水平為A2B3C3。考慮到經(jīng)濟(jì)效益及菱角殼活性物質(zhì)抑菌效果，抑菌效果最佳的提取條件應(yīng)為A2B3C1，即提取溫度60 ℃、提取時(shí)間9 h、料液比1∶5 g/mL，此時(shí)菱角殼活性物質(zhì)的抑制效果最佳。

2.2 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定結(jié)果及分析

菱角殼活性物質(zhì)對(duì)Cmm的MIC測(cè)定結(jié)果如表4所示。40～0.313 mg/mL處理濃度的菱角殼活性物質(zhì)較陰性對(duì)照而言，培養(yǎng)基澄清，無(wú)Cmm生長(zhǎng)。隨著菱角殼活性物質(zhì)濃度的降低，培養(yǎng)基逐漸變得渾濁，菌量增多。由此可知，菱角殼的抑菌活性物質(zhì)對(duì)Cmm的MIC為0.313 mg/mL。

表4 不同濃度的菱角殼活性物質(zhì)對(duì)番茄潰瘍病菌的抑制效果

2.3 對(duì)病原菌細(xì)胞壁的影響

細(xì)胞壁不僅能保持細(xì)胞形態(tài)，還可以防止抑菌劑等外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞[8]。AKP酶在細(xì)胞壁完整性正常的情況下存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，很難在細(xì)胞外檢測(cè)到其存在[9]。因此，細(xì)胞外AKP酶的水平可作為判斷細(xì)菌細(xì)胞壁完整性的依據(jù)。圖2顯示，用菱角殼活性物質(zhì)處理后Cmm胞外AKP活力較對(duì)照組顯著（P＜0.05）增加，可知1/2 MIC，MIC和2 MIC的菱角殼活性物質(zhì)均可以破壞菌體細(xì)胞壁的完整性，導(dǎo)致AKP外漏。

圖2 番茄潰瘍病菌胞外AKP活力受菱角殼活性物質(zhì)的影響

2.4 細(xì)胞膜通透性分析

細(xì)胞膜參與生物體內(nèi)許多生理代謝過(guò)程，其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)是維持細(xì)胞生理功能正常進(jìn)行的前提[10]。PI熒光染料是核DNA的染色試劑，能夠通過(guò)損傷的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而對(duì)核進(jìn)行染色，因此其可用于檢測(cè)細(xì)胞膜通透性[11]。由圖3可知，Cmm經(jīng)菱角殼活性物質(zhì)處理后熒光強(qiáng)度隨著菱角殼活性物質(zhì)濃度的升高而顯著（P＜0.05）增強(qiáng)。結(jié)果表明，菱角殼活性物質(zhì)可破壞細(xì)胞膜的通透性，影響菌體正常生理狀態(tài)，從而表現(xiàn)出良好的抑菌效果。

圖3 番茄潰瘍病菌細(xì)胞膜通透性受菱角殼活性物質(zhì)的影響

2.5 細(xì)胞膜電位變化分析

羅丹明123加入到菌體中后，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度變化可以反映出菌體細(xì)胞膜電位變化[12]。圖4表明，菱角殼活性物質(zhì)作用后，Cmm的熒光強(qiáng)度顯著（P＜0.05）低于陰性對(duì)照組。由此可知，菱角殼活性物質(zhì)破壞菌體細(xì)胞膜，導(dǎo)致羅丹明123釋放，膜電位降低，發(fā)生去極化，從而影響Cmm的正常生理活動(dòng)。

圖4 番茄潰瘍病菌細(xì)胞膜電位受菱角殼活性物質(zhì)的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)從番茄食用安全的角度出發(fā)，選用菱角殼為材料，Cmm為指示菌，對(duì)其抗Cmm活性物質(zhì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定以提取溫度60 ℃、提取時(shí)間9 h、料液比1∶5 g/mL作為提取條件。AKP活力數(shù)據(jù)顯示，菱角殼活性物質(zhì)能破壞細(xì)胞壁。羅丹明123染色和PI染色試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，活性物質(zhì)能夠降低細(xì)胞膜電位，損壞細(xì)胞膜通透性。試驗(yàn)結(jié)果可得到菱角殼高效抗Cmm的活性物質(zhì)，同時(shí)明確其抑菌作用特性，為綠色防治Cmm及防范番茄食用安全隱患提供可能對(duì)策。