于泓鵬，鄒金池，吳克剛,2*，柴向華，段雪娟，何東,2

（1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州 510006）（2.廣東省植物資源生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

精油是植物次級代謝產(chǎn)物，其含有的主要是揮發(fā)程度不同的各種液體有機(jī)物[1]，包括醛類（如檸檬醛）、酚類（如丁子酚、香芹酚）和醇類（如香葉醇）等[2]。精油一直以來被認(rèn)為是綠色安全的，精油中的一些成分也已經(jīng)得到安全性評估，并被認(rèn)為是安全的，如α-蒎烯、芳樟醇及桉樹醇等精油組分被Api 等[3-5]進(jìn)行食品與化學(xué)毒理學(xué)評估并獲得認(rèn)可。

肉桂精油是一種黃色至紅褐色的澄清液體，主要存在于肉桂的桂枝、桂皮、果實(shí)等部位，其有效成分主要有肉桂醛、蒎烯、鄰甲氧基肉桂醛和杜松烯等。肉桂精油還具有良好的抑菌[6]能力，對細(xì)菌[7]及真菌[8]均具有良好的抑制或殺滅作用。肉桂精油抗菌能力可應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，如Chang 等[9]發(fā)現(xiàn)，土肉桂具有良好的抗嗜肺乳桿菌活性，可應(yīng)用到度假或家庭水浴設(shè)施中的抗菌。Rangsuwan 等[10]發(fā)現(xiàn)肉桂精油可以抑制黃曲霉分生孢子及菌落的生長，在防治玉米發(fā)霉方面具有不錯(cuò)前景；Purkait 等[11]研究發(fā)現(xiàn)肉桂和丁香的組合在食品和制藥行業(yè)中作為抗菌、抗氧化劑具有可靠性和安全性。近年來，肉桂精油抗菌機(jī)理不斷被報(bào)道，如Bouhdid 等[12]在肉桂精油誘導(dǎo)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肉桂精油先是顯著降低細(xì)菌細(xì)胞的代謝活性和復(fù)制能力，而后才對細(xì)菌膜完整性產(chǎn)生影響；Felso 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂精油能夠改變銅綠假單胞細(xì)菌外膜蛋白，低濃度時(shí)，增加了銅綠假單胞細(xì)菌的外膜蛋白量，高濃度時(shí)，其處理過的菌外膜分子量為42.7 和80.8 ku 的蛋白質(zhì)消失，說明肉桂精油可以通過改變細(xì)菌生物膜的外膜蛋白成分，進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)菌生長的能力。

目前報(bào)道的精油抑菌方式主要有直接接觸法和氣相熏蒸法，有研究表明，氣相熏蒸方式下精油的抗菌活性可能更可靠，如Goni 等[14]認(rèn)為，直接接觸方式下，起抗菌作用的主要是親水性更強(qiáng)和揮發(fā)性較小的物質(zhì)，而氣相實(shí)驗(yàn)中，頂空釋放的揮發(fā)性化合物（親水性和疏水性）和一部分在瓊脂表面吸收的親水性化合物之間達(dá)到了平衡，因此氣相實(shí)驗(yàn)用來估計(jì)精油的抗菌活性可能更為可靠。本研究在氣相熏蒸的基礎(chǔ)上，通過改變?nèi)夤鹁蜌庀嘞惴辗绞剑捎米匀粨]發(fā)、水浴加熱、燃燒、噴霧霧化四種香氛方式，討論其對白色葡萄球菌抑制、殺滅作用的影響，并進(jìn)一步利用電子鼻、HS-SPME-GC-MS，分析四種香氛方式具有相同殺菌能力時(shí)，其香氛氣體成分構(gòu)成的變化。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

白色葡萄球菌（Staphylococcus8032），廣東省微生物研究所；真空干燥器（空間體積6.5 L），廣州廣淘科技股份有限公司；培養(yǎng)皿（環(huán)球60 mm），廣州市天力達(dá)化玻有限公司；營養(yǎng)瓊脂，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；封口膜（14×14 cm，膜直徑30 mm），常德比曼客生物科技有限公司；肉桂精油（99%），香飄三創(chuàng)眾創(chuàng)平臺(tái)提供；CAR/PDMS 萃取頭（75 μm），美國SUPELCO 公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

YX280/20 手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-25 生化培養(yǎng)箱，上海銳豐儀器儀表有限公司；（GC7890B-MS 5977B，Agilent）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津；PEN3 電子鼻，德國AIRSENSE 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香氛形成方式對肉桂精油抗菌活性實(shí)驗(yàn)

四種香氛方式中，水浴加熱與自然揮發(fā)是將肉桂精油與丙二醇混合稀釋，燃燒與噴霧霧化方式是將肉桂精油與乙醇混合稀釋。本實(shí)驗(yàn)裝置使用玻璃真空干燥器，在其內(nèi)放置小鐵架，用于倒置涂有菌液的小培養(yǎng)皿，底部可放置精油溶液或丙二醇，裝置頂部包裹透氣不透菌封口膜，具體裝置如圖1。

圖1 氣相熏蒸裝置Fig.1 Vapor phase fumigation device

1.3.1.1 自然揮發(fā)香氛方式

（1）將需要用到的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基、涂布棒等材料包裝好后在121 ℃下，高溫高壓滅菌處理20 min，烘干備用。

（2）菌種活化：取實(shí)驗(yàn)室斜面菌種劃線活化并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳至2～3 代備用。

（3）涂布：將傳代好的白色葡萄球菌稀釋至106～107CFU/mL，吸取50 μL 菌液在倒好的培養(yǎng)基上，用涂布棒涂抹均勻[15]。

（4）將精油按空間濃度0、10、20、30、40、50 μL/L依次添加到準(zhǔn)備好的裝置中，并迅速放入涂布好菌液的培養(yǎng)基，蓋上蓋子，并用封口膜將縫隙封好，裝置上端圓孔使用透氣不透菌封口膜封緊。

（5）將上述裝置擺放在相同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下，記錄每日溫度、濕度，培養(yǎng)1～2 d，直至有培養(yǎng)皿表面生長出均勻的菌落。

（6）將裝置中的菌板在無菌操作臺(tái)內(nèi)取出，觀察菌落生長情況并做記錄；每個(gè)培養(yǎng)皿挖取3 個(gè)大小相同的6 mm 圓孔轉(zhuǎn)移到新的干凈培養(yǎng)基，并放入培養(yǎng)箱在37 ℃下培養(yǎng)24 h。

（7）觀察圓孔周圍菌落生長情況并做記錄。

步驟（4）、（6）均做三個(gè)平行。

1.3.1.2 燃燒香氛方式

將空間濃度為0、10、30、50、100、200 μL/L 的精油依次添加到準(zhǔn)備好的裝置中，并迅速放入3 個(gè)涂布好菌液的培養(yǎng)基，蓋上蓋子，并用封口膜將縫隙封好，從裝置上端伸入打火器點(diǎn)燃酒精-肉桂溶液，點(diǎn)燃后將裝置上端圓孔使用透氣不透菌封口膜封緊。其余步驟與自然揮發(fā)相同。

1.3.1.3 水浴加熱香氛方式

將空間濃度為0、10、30、50、100、200 μL/L 的精油依次添加到準(zhǔn)備好的裝置中，并迅速放入3 個(gè)涂布好菌液的培養(yǎng)基，蓋上蓋子，并用封口膜將縫隙封好，裝置上端圓孔使用透氣不透菌封口膜封緊。將裝置底部依次放入溫水盆內(nèi)，并保持水溫在40 ℃～50 ℃間，放置時(shí)間為1.5 h～2 h。其余步驟與自然揮發(fā)相同。

1.3.1.4 噴霧霧化香氛方式

將空間濃度為0、5、10、15、200 μL/L 的精油依次添加到準(zhǔn)備好的噴霧器中，并迅速放入3 個(gè)涂布好菌液的培養(yǎng)基，隨后打開霧化器開關(guān)，迅速放入裝置內(nèi)，蓋上蓋子，并用封口膜將縫隙封好，裝置上端圓孔使用透氣不透菌封口膜封緊。其余步驟與自然揮發(fā)相同。

1.3.2 不同香氛形成方式下肉桂精油的成分分析

1.3.2.1 電子鼻

使用電子鼻采集四種香氛方式的氣體成分：25 ℃下，取四種香氛方式在1.3.1 抗菌實(shí)驗(yàn)中，得到的最低殺菌濃度的肉桂精油溶液置于實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)（干燥器）頂空40 min；電子鼻洗氣80 s；數(shù)據(jù)采集100 s；氣體流量為600 mL/min。

1.3.2.2 SPME-GC-MS

四種香氛方式（水浴、自然揮發(fā)、霧化、明火燃燒）均使用1.3.1 得到的最低殺菌濃度，氣體成分采集使用SUPELCO 固相微萃取SPME 方法。水浴方法為取樣品于蒸發(fā)皿中，加入丙二醇稀釋，置于干燥器中水浴40 ℃加熱吸附萃??；自然揮發(fā)取樣品于蒸發(fā)皿中，加入丙二醇稀釋，直接置于干燥器中吸附萃??；霧化方法取樣品于蒸發(fā)皿中，加入乙醇稀釋，使用專用霧化器霧化完畢后吸附萃取；明火燃燒取樣品于蒸發(fā)皿中，加入乙醇，置于干燥器中點(diǎn)火燃燒完畢后吸附萃取；吸附萃取將老化完成的75 μm CAR/PDMS 涂層萃取頭插于干燥器中懸空吸附40 min，萃取完成后于進(jìn)樣口解吸5 min。

氣相色譜參數(shù)：儀器型號(hào)：Agilent 7890B；色譜柱：HP-5MS UI（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣體積：0.2 μL（精油直接進(jìn)樣）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣模式：直接進(jìn)樣分流比120：1；SPME 采集進(jìn)樣為不分流進(jìn)樣；載氣模式：恒流1 mL/min；傳輸線溫度：300℃；升溫程序：50 ℃（3 min）_2 ℃/min_180 ℃（0 min）_20 ℃/min_300 ℃（10 min）。

質(zhì)譜參數(shù)：儀器型號(hào)：Agilent 5977B GC/MS；離子化方式：EI，atune；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；掃描范圍：29～550 u；溶劑延遲：5 min（霧化揮發(fā)方式）。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

抗菌活性實(shí)驗(yàn)、電子鼻分析數(shù)據(jù)利用Excel 處理，圖形繪制用Origin 2021。HS-SPME-GC-MS 結(jié)果采用Agilent 5977B 對樣品進(jìn)行分析，結(jié)合Nist14 和百花香料公司自建香料譜庫進(jìn)行定性檢索，并結(jié)合保留時(shí)間輔助定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 香氛形成方式對肉桂精油抗菌活性的影響

四種香氛形成方式均對白色葡萄球菌均具有良好的抑制、殺滅作用。四種香氛方式下的MIC、MBC如表1。四種精油香氛方式的抑菌效果為：噴霧霧化＞水浴加熱＞自然揮發(fā)＞燃燒；殺菌效果為：水浴加熱＞噴霧霧化＞自然揮發(fā)＞燃燒。

表1 四種香氛方式下的抗菌效果Table 1 Bacteriostatic and bactericidal effects under four volatilization modes

由表可知，水浴加熱的MBC 值最小，為10 μL/L（0.01 μL/mL），可能是水浴加熱方式下，精油揮發(fā)出了更多有效抗菌活性成分，表現(xiàn)出顯著殺菌效果；噴霧霧化方式的MIC 值最小，為5 μL/L，可能是噴霧器可以強(qiáng)制性地霧化精油中不易揮的成分，增大空氣中抗菌成分濃度，從而產(chǎn)生顯著抑菌效果；燃燒方式下抗菌活性最差，MIC 為100 μL/L，MBC 為200 μL/L，可能是高溫燃燒的方式，導(dǎo)致精油中具有抗菌活性的成分失活，從而降低了空間內(nèi)精油的有效抗菌活性成分濃度，例如在高溫下，可能加速萜烯類與空氣中的氧發(fā)生氧化和聚合[16]反應(yīng)，生成CO2、水，空間內(nèi)有效成分濃度降低，抗菌活性相應(yīng)也降低；自然揮發(fā)方式具有良好的抗菌活性，其最低抑菌濃度為30 μL/L，最低殺菌濃度為40 μL/L，此方式也是四種方式中最簡單易操作的。與吳紅影等[17]利用肉桂精油氣相熏蒸得到的MIC 值0.006 25 μL/mL 相比，噴霧霧化的MIC 值5 μL/L（0.005 μL/mL）更具有優(yōu)勢。與段雪娟等[18]利用肉桂精油氣相熏蒸的MIC 值0.25 μL/mL，MBC 值0.50 μL/mL 相比，噴霧霧化和水浴加熱兩種香氛方式的MIC、MBC 值都更小。從抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，水浴加熱和噴霧霧化兩種香氛方式都極大地提高了肉桂精油抑制、殺滅細(xì)菌的能力。

2.2 香氛形成方式對肉桂精油氣體成分影響

2.2.1 電子鼻分析

四種香氛方式電子鼻指紋圖譜如圖2 所示，傳感器各序列號(hào)所對應(yīng)代表化合物種類[19]如表2。結(jié)合表2與圖2a 可知，燃燒方式對S7、S9 傳感器響應(yīng)值均比較低，S7 響應(yīng)與精油中萜烯類有關(guān)，S9 響應(yīng)與精油內(nèi)芳香成分有關(guān)，可能是燃燒的香氛方式溫度過高，萜烯和芳香成分隨溶劑在高溫下迅速發(fā)生揮發(fā)、燃燒和反應(yīng)，生成CO2和H2O，降低了空間內(nèi)這兩類物質(zhì)的含量；噴霧霧化方式對所有有響應(yīng)的傳感器都響應(yīng)值高，與前面抑菌實(shí)驗(yàn)中分析相符：在強(qiáng)制性霧化方式下，不易揮發(fā)成分通過霧化方式飄散在空氣中，極大地提高了空間中精油成分濃度；與自然揮發(fā)相比，水浴加熱對S2、S6、S8、S9 傳感器都更靈敏，可能是水浴加熱的方式，使精油的溫度升高，一些具有揮發(fā)性的成分及小分子物質(zhì)能更容易的隨溶劑揮發(fā)到氣相中，增大了空間內(nèi)成分濃度。

表2 不同傳感器序列號(hào)所代表的化合物種類Table 2 Compounds represented by different sensor sequences

圖2 四種香氛方式電子鼻傳感器響應(yīng)值指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of the response value of the electronic nose sensor in four fragrance modes

由圖2b 雷達(dá)圖可知，噴霧霧化和燃燒在雷達(dá)圖中各序列號(hào)響應(yīng)值存在較明顯差異，能夠被電子鼻很好的區(qū)分開。自然揮發(fā)與水浴加熱方式在雷達(dá)圖中重合性較好，電子鼻較難對這兩種香氛方式加以區(qū)分。電子鼻對四種香氛方式氣體成分分析實(shí)驗(yàn)中，只能對四種香氛方式的氣體成分進(jìn)行一個(gè)大類別的區(qū)分，其具體成分還需要進(jìn)一步采用HS-SPME-GC-MS 的方式才能得到。

2.2.2 SPME-GC-MS 成分分析

四種香氛方式下氣相成分HS-SPME-GC-MS 部分分析結(jié)果如表3，由表可知，四種香氛方式檢測出的相對含量大于1%的化合物種類數(shù)具有顯著差異，其中水浴加熱（15 種）＞自然揮發(fā)（6 種）＞燃燒（4 種）和噴霧霧化（4 種）。四種香氛方式均使用MBC 的情況下，水浴加熱明顯揮發(fā)出更多種類相對含量大于1%的化合物。其中就包含多種萜烯，如α-蒎烯、β-石竹烯和香檸檬烯等，絕大多數(shù)的萜烯具有抗菌活性[20,21]。如Jin[22]等利用揮發(fā)性有機(jī)化合物對A549 和HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激影響等研究，發(fā)現(xiàn)α-蒎烯可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；Gwak[23]等對熱萃取柳杉時(shí)檢測到的包括δ-杜松烯在內(nèi)的32 種揮發(fā)性萜烯類進(jìn)行抗菌活性研究，發(fā)現(xiàn)這些萜烯對紅毛癬菌、毛癬菌和石膏微孢子蟲具有抗菌活性。表3 列出的各香氛方式揮出相對含量在1%以上的組分存在差異，可能正是這些組分差異導(dǎo)致了各香氛方式下肉桂精油不同的抗菌活性。

表3 肉桂精油四種香氛方式相對含量1%以上的有機(jī)化合物Table 3 Organic components with a relative content greater than 1% detected by four fragrance mode of cinnamon essential oil

四種香氛方式采用HS-SPME-GC-MS 測得的主要有機(jī)化合物結(jié)果如表4。由表可知，在MBC 下，燃燒和噴霧霧化香氛方式下肉桂醛相對含量都較大，兩種香氛方式下肉桂醛和α-蒎烯相對含量差異小，說明這兩種方式起殺菌作用的成分可能一致，主要是靠高空間濃度的肉桂醛達(dá)到殺菌效果。噴霧霧化的殺菌能力僅次于水浴加熱香氛方式，為20 μL/L 的空間濃度，該方式能將肉桂精油組分以噴霧的形式揮出，覆蓋到整個(gè)裝置內(nèi)，增大了精油組分的空間濃度，從而表現(xiàn)出較好的殺菌效果。四種方式均取MBC，燃燒方式添加的肉桂精油空間濃度是水浴方式下的20 倍，噴霧方式下的10 倍，為200 μL/L，但該方式檢測到的有機(jī)揮發(fā)性化合物并不多，其檢測到的肉桂醛相對含量還稍低于噴霧霧化香氛方式。這是由于燃燒方式產(chǎn)生明火，高溫燃燒了部分肉桂精油組分，其抑菌能力也就是四種方式中最差的。

表4 肉桂精油四種香氛方式主要有機(jī)化合物結(jié)果Table 4 The results of four perfuming methods of cinnamon essential oil

自然揮發(fā)和水浴加熱香氛方式下，肉桂醛含量不及前兩種方式，說明除了肉桂醛起作用外，可能還有其他揮發(fā)性有機(jī)化合物起作用，自然香氛方式下測得的相對含量大于1%揮發(fā)性有機(jī)化合物為6 種，α-蒎烯相對含量為前兩種方式的將近兩倍，β-石竹烯、γ-依蘭油烯、δ-杜松烯3 種萜烯相對含量也在1%以上，故推測自然香氛方式下萜烯（如α-蒎烯）增強(qiáng)了肉桂醛殺菌能力；水浴加熱香氛方式下的肉桂醛相對含量最低，這是由于水浴加熱方式下的MBC 最小的，為10 μL/L的空間濃度，在該測試中添加的肉桂精油量最少，其殺菌效果表現(xiàn)出眾，是因?yàn)榧訜崆闆r下，更多的萜烯成分受熱揮出，與肉桂醛協(xié)同，起到殺菌效果。如α-蒎烯、δ-杜松烯、β-紅沒藥烯和γ-依蘭油烯相對含量都在2%以上，α-依蘭油烯等10 種萜烯測得相對含量均在1%以上，相對含量在1%以上的各萜烯相對含量和達(dá)到了29.76%。此時(shí)，其在肉桂精油水浴加熱殺菌過程中，起到重要作用。故水浴加熱殺菌能力強(qiáng)依賴于相對含量高的萜烯及肉桂醛共同作用。

上述成分分析結(jié)果與前面2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果中“水浴加熱、噴霧霧化具有很好的抗菌效果”結(jié)論相符合。

3 結(jié)論

四種香氛方式對白色葡萄球菌的抗菌實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)不同香氛方式抑菌效果存在明顯差異，且存在一定的規(guī)律性。其中，四種香氛方式抑菌能力強(qiáng)弱大小：噴霧霧化＞水浴加熱＞自然揮發(fā)＞燃燒；四種香氛方式殺菌能力強(qiáng)弱大小：水浴加熱＞噴霧霧化＞自然揮發(fā)＞燃燒。

四種香氛方式HS-SPME-GC-MS 數(shù)據(jù)采集實(shí)驗(yàn)中，均使用的是最低抑菌濃度，水浴加熱揮發(fā)的有萜烯類成分相對含量較其他方式種類更多、更高，相對含量達(dá)29.76%，其中包括α-蒎烯、β-石竹烯和香檸檬烯等具有抗菌活性的萜烯化合物；噴霧方式霧化出相對含量達(dá)74.26%的肉桂醛，這兩種方式均能夠在很低的肉桂精油濃度下，具有很好的抗菌能力，雖然達(dá)到效果的方式存在差異，但卻能給人們在使用精油進(jìn)行抑菌、殺菌時(shí)，提供更多的選擇。自然揮發(fā)的方式抑菌、殺菌效果也表現(xiàn)良好，這可能與其揮發(fā)出成分種類有一定關(guān)系，與水浴方式相比，其檢測出的成分種類很相似，但各成分相對含量稍低。綜合來看，水浴加熱和噴霧霧化兩種香氛方式的抗菌能力是最佳的。