滿子意，鳳怡，吳祥庭

溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035

胰脂肪酶是胰腺合成和分泌的重要脂解 酶，能將三酰基甘油酯水解成單?；视王ズ陀坞x脂肪酸，然后被機(jī)體重新吸收利用并最終合成脂肪[1]，過(guò)多的脂肪堆積是導(dǎo)致肥胖、高血脂癥、脂肪肝等多種疾病的關(guān)鍵原因[2]。而抑制胰脂肪酶活性，延緩三酰基甘油酯的水解過(guò)程，是預(yù)防和治療肥胖、高血脂癥及其并發(fā)癥的重要方法[3]。目前，市場(chǎng)上用于治療肥胖和高血脂癥的臨床藥物以?shī)W利司他和辛伐他汀為主[4]，雖然這類藥物可以有效控制血脂的上升，但長(zhǎng)期服用會(huì)出現(xiàn)惡心、頭痛、脹氣、腹瀉等副作用以及肝腎損傷等問(wèn)題[5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，天然植物提取物對(duì)胰脂肪酶具有較好的抑制效果，且副作用較小[6-8]，因此，從天然植物資源中找到安全、有效的胰脂肪酶抑制劑一直是食品、生物及醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）作為茶葉中的一種天然兒茶素單體，是茶葉中含量較豐富、生物活性較高的茶多酚之一，被應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥保健領(lǐng)域[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，植物多酚具有抗氧化、調(diào)節(jié)血糖和血脂水平的作用，這歸因于其多個(gè)-OH和環(huán)狀結(jié)構(gòu)[10]。陳旭等[11]研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉多酚在質(zhì)量濃度為 2.5 g·L-1時(shí)對(duì)胰脂肪酶的抑制率可達(dá)46.8%。李鋒等[12]對(duì)高血脂大鼠進(jìn)行連續(xù)飼喂EGC，發(fā)現(xiàn)EGC能極顯著降低高脂模型大鼠血清中的甘油三酯含量，在一定程度上可以降低低密度脂蛋白膽固醇含量，說(shuō)明EGC具有一定的降脂作用。王詩(shī)卉等[13]研究了茶葉兒茶素抑制劑對(duì)胰脂肪酶構(gòu)效關(guān)系的影響，發(fā)現(xiàn)胰脂肪酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與 EGCG濃度呈正相關(guān)，而三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與 EGCG濃度沒有顯著的相關(guān)性。然而目前有關(guān)兒茶素單體EGC的降血脂作用機(jī)制尚未完全清楚，并且關(guān)于EGC在體外抑制胰脂肪酶的研究也鮮見報(bào)道?；诖?，本研究從EGC與胰脂肪酶化學(xué)結(jié)構(gòu)的角度分析了二者之間的相互作用模式及結(jié)構(gòu)變化，并對(duì)EGC抑制胰脂肪酶的效果和類型進(jìn)行分析，旨在闡釋EGC與胰脂肪酶相互作用產(chǎn)生抑制效果的分子機(jī)制，為茶葉EGC在降血脂中的應(yīng)用提供技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

干茶樣品由紹興御茶村茶葉有限公司提供，胰脂肪酶（來(lái)源：豬胰腺；15～35 U·g-1）購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司，二甲基亞砜（NMR級(jí)）購(gòu)自寧波萃英化學(xué)技術(shù)有限公司，溴化鉀（光譜純）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，AB-8大孔樹脂購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，酚酞購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

MuNanoscope3a型掃描電子顯微鏡，美國(guó)Digitalinstrument公司；NicoletiN 10 MX型傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；AVANCE3 AV500型核磁共振氫譜儀，德國(guó)Bruker公司；F-7000型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；Rotavapor R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司。

1.3 EGC的分離純化

參考魏志文[14]和顧峰[15]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改提取純化EGC單體。茶多酚粗品的制備：稱取15 g干茶樣品，置于1 L燒杯中，加入 450 mL超純水，100℃水浴浸提 60 min（每隔20 min攪拌1次），過(guò)濾；向?yàn)V渣中再加入450 mL超純水，100℃水浴浸提60 min，過(guò)濾。合并兩次濾液，抽濾，棄濾渣，將濾液濃縮（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為50℃，壓強(qiáng)為0.1 mPa）得到約150 mL的濃縮液，濃縮液用等體積三氯甲烷萃取3次，脫除咖啡堿和色素，回收三氯甲烷層，水層用等體積的乙酸乙酯再次萃取3次，合并酯層溶液，溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮（50℃，0.4 mPa）、減壓干燥后得茶多酚粗品。

大孔樹脂柱的制備與裝柱：用超純水多次淘洗大孔樹脂，直到洗出液不再有白色濁液后向樹脂中加入95%的乙醇溶液繼續(xù)清洗，待洗出液澄清后將樹脂浸泡在 95%的乙醇溶液中24 h待用。用充分溶脹后的大孔樹脂裝柱，得到2.5 cm×38 cm的柱體，裝柱后用95%的乙醇以5 mL·min-1的流速平衡柱體24 h，平衡后上樣。

EGC單體的純化：稱取制備好的茶多酚粗品2 g，用15 mL 95%乙醇溶解，再用0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上柱，用95%的乙醇溶液保持5 mL·min-1的流速洗脫，收集樹脂柱前 3 BV流失液（BV為樹脂床體積，1 BV即表示1倍樹脂床體積，約2 500 mL），將流失液旋轉(zhuǎn)減壓濃縮（50℃，0.4 mPa）、真空干燥，于-20℃保存，得EGC粗品。EGC粗品用少量乙酸乙酯溶解后過(guò)濾，后向?yàn)V液中加入二氯甲烷，會(huì)產(chǎn)生大量沉淀，繼續(xù)加二氯甲烷直到不產(chǎn)生沉淀為止。將溶液靜置 30～60 min，5 000 r·min-1離心10 min，將濾渣干燥后冷凍保存，即純化后的EGC。

1.4 EGC的結(jié)構(gòu)表征

1.4.1 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

取純化的EGC單體，在25℃下真空干燥12 h。取真空干燥后的樣品，均勻分散在樣品臺(tái)上，吹去未粘住的樣品，并噴金3 min。噴鍍完成后用掃描電子顯微鏡觀察形貌[16]。參數(shù)設(shè)置：加速電壓 HV=1.00 kV；工作距離WD=6.9 mm；探頭類型ETD。

1.4.2 傅里葉紅外光譜（FTIR）檢測(cè)

將1 mg樣品與300 mg KBr混合后研磨并壓制成薄片，并使用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)試。掃描范圍為 400～4 000 cm-1，共掃描 64次[17]。

1.4.3 核磁共振氫譜（1H-NMR）

稱取 12 mg EGC樣品并轉(zhuǎn)移到 2 mL eppendorf管中，然后加入 0.5 mL NMR級(jí)DMSO溶劑，通過(guò)超聲溶解化合物。最后將澄清的溶液轉(zhuǎn)移到5 mm NMR管中，并使用核磁共振氫譜儀獲得數(shù)據(jù)[18]。

1.5 EGC對(duì)胰脂肪酶抑制效果的測(cè)定

參照 GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》和王菲菲[19]的方法并適當(dāng)修改。向兩個(gè)編號(hào)分別為A和B的100 mL的錐形瓶中分別加入4 mL底物溶液（PVA乳化液）和 5 mL磷酸鹽緩沖液（PBS，0.2 mol·L-1、pH=7.5），然后向A瓶中加入15 mL 95%的乙醇溶液，將A、B兩瓶在40℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，隨后向兩瓶中分別加入1 mL 10 mg·mL-1的胰脂肪酶溶液后立即混勻計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng) 15 min后向 B瓶中加入15 mL 95%的乙醇溶液終止反應(yīng)，再向 A、B瓶中分別加入 2～3滴酚酞溶液，用0.05 mol·L-1的 NaOH溶液滴定計(jì)算游離脂肪酸含量，按下式計(jì)算空白組胰脂肪酶活性。

式中：VA為A瓶消耗0.05 mol·L-1NaOH溶液的體積；VB為 B 瓶消耗 0.05 mol·L-1NaOH溶液的體積；50表示1 mL 0.05 mol·L-1的NaOH溶液相當(dāng)于脂肪酸50 μmol；15表示反應(yīng)時(shí)間15 min。

分別取 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg·mL-1EGC溶液或奧利司他溶液1 mL加入到A、B錐形瓶中，重復(fù)以上操作，測(cè)定并計(jì)算各計(jì)量組胰脂肪酶活性。按下式計(jì)算各組胰脂肪酶抑制率，并確定其半抑制濃度（IC50）值。

式中：Uck表示空白組酶活性，Us表示樣品組酶活性。

1.6 EGC對(duì)胰脂肪酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究

根據(jù)范金波等[20]的方法稍作修改，測(cè)定方法同1.5章節(jié)。將1 mL不同濃度的EGC溶液（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg·mL-1）與 4 mL PVA 乳化液（6、8、10、12、14 mg·mL-1）混合，然后在 40℃下培養(yǎng) 5 min后加入 10 mg·mL-1的胰脂肪酶溶液準(zhǔn)確反應(yīng)15 min。以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率（1/V）為縱坐標(biāo)，繪制不同質(zhì)量濃度下 EGC的Lineweaver-Burk圖，動(dòng)力學(xué) Cornish-Bowden方程如下用于確定抑制模式。

式中，[S]表示 PVA 乳化液濃度（mg·mL-1），Kic為競(jìng)爭(zhēng)性抑制常數(shù)，Kiu為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制常數(shù)，Km為米氏常數(shù)，V為酶促反應(yīng)速率mol·(L·min)-1，[C]表示 EGC 濃度（mg·mL-1）。

1.7 EGC對(duì)胰脂肪酶的熒光猝滅作用研究

F-7000熒光光度計(jì)（日本日立）用于測(cè)試樣品的熒光光譜。采用 PBS（0.2 mol·L-1，pH=7.5）配置胰脂肪酶溶液（0.5 mg·mL-1）和不同質(zhì)量濃度的EGC溶液（0.6、0.8、1.0、1.2 mg·mL-1）。EGC溶液分別與胰脂肪酶溶液按（V∶V=1∶1）充分混勻，將各反應(yīng)組溶液置于 40℃孵育 15 min，孵育后測(cè)定其熒光吸光度。熒光激發(fā)波長(zhǎng)為 280 nm，掃描范圍為290～450 nm，發(fā)射縫均為 5 nm[21]。

1.8 分子對(duì)接

使用 AutodockVina程序進(jìn)行胰脂肪酶和兒茶素單體EGC的半柔性分子對(duì)接。胰脂肪酶的結(jié)構(gòu)（PDB ID：1ETH）從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得[22]。對(duì)接前先去除蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)中的雜原子和水分子，在pH=7.4的生理?xiàng)l件下補(bǔ)加氫原子，然后進(jìn)行全蛋白對(duì)接[23-24]。根據(jù)獲得的結(jié)果，選擇結(jié)合親和力打分最高的對(duì)接構(gòu)象進(jìn)行相互作用的討論，使用ChimeraX和 LigPlus查看相互作用的三維和二維圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGC的結(jié)構(gòu)表征及與關(guān)鍵胰脂肪酶氨基酸殘基相互作用模式

用掃描電子顯微鏡、紅外光譜儀、1H-NMR等方法表征制備的EGC單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖1展示了EGC單體的微觀結(jié)構(gòu)和形貌。SEM圖像表明EGC單體分布不規(guī)則，主要為管狀結(jié)構(gòu)，表面光滑，與其同源物質(zhì)ECG顯微形貌相似[25]。

圖1 掃描電鏡（SEM）下的EGC晶體形貌Fig. 1 The EGC crystal morphology under SEM

圖2是EGC的紅外光譜結(jié)果，在3 406 cm-1附近的吸收峰主要是-OH伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，C-H伸縮振動(dòng)的特征吸收峰在 2 837 cm-1附近，1 500 cm-1附近的幾個(gè)吸收峰是苯的 C=C伸縮振動(dòng)峰，1 147 cm-1和 1 039 cm-1為 C-O伸縮振動(dòng)峰[26]。

圖2 EGC的紅外光譜結(jié)果Fig. 2 FTIR results of EGC

圖3是 EGC的1H-NMR結(jié)果，EGC的1H-NMR信號(hào)中含有較多活潑氫，因此很難識(shí)別自旋體系。δH7.96、δH8.90、δH9.11 和 δH4.65處的信號(hào)屬于 EGC分子上的-OH，容易產(chǎn)生O-H···O 型氫鍵[27]。EGC 分子與其他多酚類化合物類似，為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，帶羥基、酚羥基等活性基團(tuán)，推測(cè)EGC中的這些活性部位更容易通過(guò)氫鍵或疏水相互作用與酶中的關(guān)鍵氨基酸殘基發(fā)生相互作用[28]。胰脂肪酶的本質(zhì)是由多個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈糖蛋白，共分為兩個(gè)區(qū)域，一個(gè)是發(fā)揮催化功能的N端結(jié)構(gòu)，另一個(gè)是可結(jié)合輔助因子的C端區(qū)域[29]。研究表明，胰脂肪酶活性中心形成了1個(gè)天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸的三聯(lián)結(jié)構(gòu)，經(jīng)化學(xué)修飾后絲氨酸可以降低酶的活性，說(shuō)明絲氨酸是胰脂肪酶發(fā)揮催化作用的關(guān)鍵氨基酸[30]。絲氨酸中存在羥基、氨基、羧基等活性官能團(tuán)，可以與EGC分子中的羥基、酚羥基形成多個(gè)不同氫鍵，結(jié)合成更穩(wěn)定的復(fù)合物影響酶的活性。另外苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸等疏水性氨基酸在胰脂肪酶結(jié)構(gòu)中也發(fā)揮了重要作用，EGC還可與這些氨基酸形成氫鍵、范德華力、疏水相互作用等多種作用模式，從而改變了酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象，導(dǎo)致酶活性的改變[30]。

圖3 EGC的核磁共振氫譜結(jié)果Fig. 3 1H-NMR results of EGC

2.2 EGC對(duì)胰脂肪酶的抑制效果

人類消化系統(tǒng)中碳水化合物主要通過(guò)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水解為葡萄糖[31]，而脂肪的消化主要依靠胰脂肪酶水解為游離脂肪酸和單?；视王?，它能夠?qū)⑷梭w攝入的三?；视王ニ獾?40%～70%[32-33]。因此胰脂肪酶是脂肪消化的先決條件，其活性高低可以影響脂肪的消化反應(yīng)進(jìn)程。奧利司他等胰脂肪酶抑制劑是臨床用于輔助治療高血脂癥、肥胖癥的有效藥物，可通過(guò)阻止三酰基甘油水解，減少腸腔黏膜對(duì)膳食中脂肪的吸收，促使脂肪排出體外[34]。如圖4所示，不同濃度的EGC溶液對(duì)胰脂肪酶具有一定的抑制作用，且隨著EGC濃度的增加而增加。但抑制效果明顯弱于對(duì)照品奧利司他對(duì)胰脂肪酶的抑制效果，且EGC抑制胰脂肪酶的 IC50值為(1.620±0.085) mg·mL-1，高于奧利司他(1.013±0.072) mg·mL-1。但 EGC 是從天然植物中分離出的化合物，具有綠色、安全、副作用小的優(yōu)點(diǎn)，相比奧利司他更適合長(zhǎng)期用于輔助治療高血脂癥以及肥胖癥。且相比于其他天然產(chǎn)物中提取到的胰脂肪酶抑制劑，褚盼盼等[35]研究的苦蕎麥多糖對(duì)胰脂肪酶抑制作用的 IC50為 28.23 mg·mL-1、張靜等[36]研究的黑果枸杞花色苷提取物對(duì)胰脂肪酶抑制作用的 IC50為(2.84±0.45) mg·mL-1、安歡等[37]研究的苦瓜多糖對(duì)胰脂肪酶抑制作用的 IC50為 29.86 mg·mL-1，EGC表現(xiàn)出較強(qiáng)的胰脂肪酶抑制作用。相比其他兒茶素單體，EGC對(duì)胰脂肪酶的抑制效果低于其同源物質(zhì)EGCG，趙瑜等[38]、楊龍佳等[39]、Sergent等[40]、Grove等[41]分別報(bào)道了 EGCG以(0.55±0.02) mg·mL-1、1.32 mg·mL-1、0.8 μmol·L-1、7.5 μmol·L-1的IC50值抑制胰脂肪活性。此外Rahim等[42]通過(guò)研究幾種黃酮和非黃酮多酚體外抑制胰脂肪酶活性的模式發(fā)現(xiàn)，只有沒食子酸、EGC和EGCG顯示出較高的脂肪酶抑制潛力（IC50值分別為 387.2、237.3 μmol·L-1和 391.2 μmol·L-1）；沒食子酸乙酯和沒食子醇葡萄糖僅顯示出一定的抑制效果；而未酯化的黃烷-3-醇，如(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、(+)-沒食子酸對(duì)胰脂肪酶幾乎沒有抑制效果。這些結(jié)果表明EGC是一種有效的胰脂肪酶抑制劑，在降血脂、抗肥胖藥物和功能性食品的研究中具有潛在價(jià)值。

2.3 EGC對(duì)胰脂肪酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

建立基于動(dòng)力學(xué) Cornish-Bowden方程的Lineweaver-Burk圖來(lái)確定EGC抑制胰脂肪酶的抑制模式。如圖5所示，隨著EGC濃度的提高，EGC對(duì)胰脂肪酶的酶促反應(yīng)速率直線的斜率逐漸增大，與 Y軸的交點(diǎn)（1/Vmax）上移，即最大反應(yīng)速率（Vmax）減小。在所有EGC受試濃度下，直線在X軸上的截距（-1/Km）保持不變，即無(wú)論 EGC的濃度如何，米氏常數(shù)（Km）保持在恒定值，表明EGC對(duì)胰脂肪酶的抑制效率與底物濃度無(wú)關(guān)，EGC是胰脂肪酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制僅取決于抑制劑的濃度，抑制劑與酶活性位點(diǎn)以外的部位結(jié)合，與底物不形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[43-44]。因此EGC抑制胰脂肪酶的機(jī)制可能是與酶活性中心以外的關(guān)鍵氨基酸殘基結(jié)合，形成更穩(wěn)定的多元復(fù)合物或使酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，減慢三?；视王サ姆纸馑俣?，從而達(dá)到控制血脂的目的。

圖5 不同EGC濃度下的Lineweaver-Burk圖Fig. 5 Lineweaver-Burk plots of pancrelipase inhibition by various concentrations of EGC

2.4 EGC對(duì)胰脂肪酶的熒光猝滅效應(yīng)

熒光光譜實(shí)驗(yàn)被用來(lái)進(jìn)一步研究EGC與胰脂肪酶之間的相互作用。在一定的激發(fā)波長(zhǎng)下，色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸的存在可以使得胰脂肪酶具有熒光特性[45]。其中貢獻(xiàn)最大的是色氨酸與酪氨酸殘基，在280 nm波長(zhǎng)時(shí)內(nèi)源熒光被激發(fā)，并且這兩種氨基酸殘基所處的微環(huán)境還會(huì)影響其熒光強(qiáng)度與位置[46]。圖6顯示了不同濃度的EGC對(duì)胰脂肪酶的熒光猝滅效應(yīng)。EGC對(duì)胰脂肪酶具有熒光猝滅作用，熒光光譜在340 nm附近出現(xiàn)固有峰。隨著EGC濃度的增大，胰脂肪酶的熒光強(qiáng)度逐漸下降，且最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生輕微紅移，這種濃度依賴關(guān)系是EGC和胰脂肪酶相互作用的明顯證據(jù)[21]。在熒光光譜中，最大發(fā)射波長(zhǎng)的紅移也意味著蛋白質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這可能是EGC與胰脂肪酶中的氨基酸殘基發(fā)生相互作用的結(jié)果[47]。由于微環(huán)境由親水性變?yōu)槭杷裕瑢?dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，最終產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)。因此推測(cè)EGC可能通過(guò)氫鍵和疏水相互作用與酶中的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等結(jié)合形成更穩(wěn)定的多元復(fù)合物，導(dǎo)致酶構(gòu)象或極性的改變，從而抑制酶的活性。

圖6 不同濃度EGC對(duì)胰脂肪酶熒光特性的影響Fig. 6 The effect of EGC on the fluorescence characteristics of pancrelipase

2.5 分子對(duì)接

分子對(duì)接技術(shù)可以直觀地表示配體與受體的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合構(gòu)象，有助于其相互作用機(jī)理的分析。選擇結(jié)合親和力打分最高的 9組對(duì)接構(gòu)象進(jìn)行相互作用分析（圖7），如圖所示，與 EGC相互作用的氨基酸殘基為Asp206、Cys262、Asp258、Gln239、Lys233、Asn213、Asn263、Gln234、Cys238、Phe259、Ala261、Val260、Gly251、Leu214等，這些氨基酸殘基是驅(qū)動(dòng)胰脂肪酶與EGC結(jié)合的主要氨基酸。其中 Asp206、Asp258、Gln239、Cys262主要通過(guò) N-H···O、O-H···O 型氫鍵與胰脂肪酶相互作用，其余氨基酸殘基則主要通過(guò)疏水相互作用與胰脂肪酶相互作用。已有研究表明，胰脂肪酶活性中心是 1個(gè)天冬氨酸-組氨酸-絲氨酸的三聯(lián)結(jié)構(gòu)[30]，因此可以推測(cè)EGC主要與胰脂肪酶活性中心以外的必需基團(tuán)結(jié)合，如Asn263、Phe259、Gln234等，通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)的方式抑制胰脂肪酶活性，這與抑制動(dòng)力學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果一致。與其他多酚類化合物（如黃酮類、花青素類）相似，芳香六元環(huán)上的羥基在氫鍵的形成上起到了關(guān)鍵作用[48]，已有研究表明，隨著羥基數(shù)目的增加，多酚類物質(zhì)的生物活性越強(qiáng)，對(duì)胰脂肪酶的抑制效果更顯著[49]。EGC通過(guò)疏水相互作用與多個(gè)氨基酸殘基周圍的疏水腔結(jié)合，影響其微環(huán)境的極性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊現(xiàn)象，改變了酶的結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生了熒光光譜實(shí)驗(yàn)中的熒光猝滅現(xiàn)象，也影響了胰脂肪酶的生物活性，進(jìn)而降低其對(duì)底物的催化能力[23,49]。

圖7 EGC與胰脂肪酶的分子對(duì)接Fig. 7 Molecular docking for the interaction between pancrelipase and EGC

3 討論

茶葉具有降血脂功效已得到廣泛認(rèn)同，但是關(guān)于其有效成分的機(jī)制研究卻進(jìn)展不大。茶多酚是茶葉中兒茶素類、黃酮類、酚酸類和花色素類物質(zhì)的總稱，占干物質(zhì)含量的15%～25%[50]；其中兒茶素類化合物是最重要的組分。兒茶素類化合物可抑制多種與脂肪合成相關(guān)酶的表達(dá)及活性，并調(diào)節(jié)多種與膽固醇合成相關(guān)的酶的活性，其中研究最廣泛的是EGCG，體外試驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG可以通過(guò)抑制與物質(zhì)消化相關(guān)的酶以及與腸道細(xì)胞刷毛緣上特定轉(zhuǎn)運(yùn)因子形成復(fù)合物，降低胃腸道對(duì)葡萄糖和脂類的吸收與利用，減少三?；视王ニ猓瑥亩档陀坞x脂肪酸被機(jī)體重新吸收利用并最終合成脂肪的過(guò)程[51]。EGC作為EGCG的同源化合物，與 EGCG具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，含量?jī)H次于EGCG，是兒茶素以及茶多酚類化合物發(fā)揮生物活性的重要化合物。

本研究通過(guò)多種光譜技術(shù)研究了EGC的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以及與胰脂肪酶的相互作用。我們證實(shí)了EGC對(duì)胰脂肪酶具有非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，IC50為(1.62±0.085) mg·mL-1，抑制作用主要是通過(guò)氫鍵和疏水相互作用改變酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象與胰脂肪酶中的氨基酸殘基形成復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。EGC抑制胰脂肪酶的機(jī)制是深入理解多酚類化合物作為脂肪水解酶抑制劑的關(guān)鍵因素。通常食物中的脂肪進(jìn)入人體后會(huì)被胰脂肪酶水解為游離脂肪酸和單?；视王ィ@些物質(zhì)經(jīng)腸道吸收后會(huì)重新合成脂肪導(dǎo)致脂肪堆積以及血脂升高，通過(guò)抑制胰脂肪酶活性可以減少脂肪的分解從而達(dá)到降血脂的目的，因此抑制胰脂肪酶活性是研究脂肪分解代謝、降血脂機(jī)制以及開發(fā)降血脂藥物的關(guān)鍵[52-53]。EGC分子同時(shí)顯現(xiàn)出親水性和疏水性，而胰脂肪酶內(nèi)部非極性氨基酸的側(cè)鏈區(qū)域表現(xiàn)出疏水性，EGC中的酚羥基能夠與胰脂肪酶內(nèi)部的氨基酸殘基通過(guò)氫鍵以及疏水相互作用結(jié)合在一起，形成更穩(wěn)定的復(fù)合物，改變酶的結(jié)構(gòu)，降低了酶的分解速率，從而減少脂肪分解實(shí)現(xiàn)降脂的目的。因此本研究可以為利用EGC作為新型食品添加劑或胰脂肪酶抑制劑開發(fā)功能性食品以及降血脂、抗肥胖藥物提供理論依據(jù)。但是本研究?jī)H通過(guò)體外試驗(yàn)對(duì)EGC抑制胰脂肪酶的活性進(jìn)行探究，暫未進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，難以反映EGC在體內(nèi)的復(fù)雜作用機(jī)制。欲深入闡明EGC對(duì)脂肪代謝的作用機(jī)制，后續(xù)還需進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，深入了解其在體內(nèi)的復(fù)雜作用。

另一方面，通常綠茶鮮葉中的兒茶素含量約為200 mg·g-1，鮮葉中兒茶素組分含量由多到少分別為 EGCG、EGC、ECG、EC、GC、C[54]，由于 EGC抑制胰脂肪活性所需的有效濃度較高，通過(guò)日常飲茶難以真正達(dá)到相應(yīng)濃度。但是許多研究已表明，飲茶可以達(dá)到降脂效果且兒茶素對(duì)胰脂肪酶有較好抑制效果[55-57]，因此飲茶降脂功能的實(shí)現(xiàn)應(yīng)該是通過(guò)茶湯中的多種活性成分共同發(fā)揮作用。兒茶素作為最重要的活性物質(zhì)，其單體成分在降脂機(jī)制中的作用十分重要，根據(jù)兒茶素的構(gòu)成和比例，EGCG和EGC可能是發(fā)揮主要作用的單體，而這兩種單體都屬于黃烷-3-醇類化合物且結(jié)構(gòu)主鏈中都有一個(gè)沒食子?；糠帧Ｒ虼艘戎久钢蟹菢O性氨基酸的數(shù)量及比例、酚羥基的個(gè)數(shù)以及黃烷-3-醇的沒食子酰部分都是今后研究?jī)翰杷匾约岸喾宇愇镔|(zhì)對(duì)胰脂肪酶活性影響的關(guān)鍵。