楊立輝，陳鵬宇，王有賢，劉寶玉，白慶榮，趙廷昌

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 長春 130118； 2.吉林省蛟河市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊 吉林蛟河 132500；3.巴彥淖爾市植保植檢站 內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000； 4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 北京 100096）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是葫蘆科一年生蔓生或攀援草本植物[1]，口感爽脆，具有清火利尿、清熱解毒的功效，富含蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，深受人們喜愛。黃瓜是世界十大蔬菜作物之一，在我國各地均有種植，栽培面積超過全國蔬菜栽培總面積的十分之一，栽培品種也逐漸豐富，具有極高的經(jīng)濟價值[2]。

在黃瓜栽培過程中，病害問題比較突出。常見的葉部病害主要有霜霉病、炭疽病、白粉病、灰霉病、靶斑病、細菌性角斑病等。其中由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&Kert）Wei]引起的黃瓜靶斑?。–ucumber target spot）又被稱為褐斑病、小黃點病等，是一種重要的氣傳性葉部病害[3]，成為近年來黃瓜生產(chǎn)上的重要病害之一。據(jù)統(tǒng)計，該病害的田間發(fā)生率一般是10%～25%，防治不力可達70%，甚至絕產(chǎn)，經(jīng)濟損失慘重[4]。發(fā)病時被侵染的葉片會出現(xiàn)水浸狀小點，后變?yōu)樾⌒蛨A斑，病健交界明顯，后期病斑繼續(xù)擴大，呈黃褐色，邊緣為深褐色，擴展受葉脈限制，呈不規(guī)則形，病葉易脫落[5]。該病害在發(fā)病初期又與黃瓜細菌性角斑病、霜霉病和炭疽病初期癥狀極其相似，不易辨別，經(jīng)常導(dǎo)致病害防治過程中不能精準用藥，防效不佳。

2021 年4 月，在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市寧城縣五化鎮(zhèn)山頭村發(fā)現(xiàn)大量的黃瓜葉斑病，病害發(fā)生迅速，危害極其嚴重，重病棚內(nèi)大部分植株枯死，損失慘重，但具體發(fā)病原因尚不明晰。筆者對上述地區(qū)發(fā)生的黃瓜葉斑病的病原菌進行分離純化及致病性測定，通過對病原菌形態(tài)鑒定及分子生物學(xué)鑒定確定了病菌的分類地位，同時測定了代表菌株對26種殺菌劑的敏感性，以便篩選到高效低毒的藥劑，為生產(chǎn)中該病害的科學(xué)防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及癥狀觀察

2021 年4 月，對內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市寧城縣五化鎮(zhèn)山頭村的黃瓜病害標本的發(fā)病癥狀及特征進行拍照記錄，蠟葉標本保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室。

1.2 試驗主要儀器

DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）、GXZ 智能型培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）、DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）、SW-CJ-2FD 潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、GI80DWS 高壓蒸汽滅菌鍋（上海言和）、光學(xué)顯 微 鏡（ZEISS ImagerA.2）、超 景 深 顯 微 鏡（VHS-600）、移液器（艾本德）、電子天平等。

1.3 病原菌的分離、純化及致病性測定

2021 年5 月，在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室進行病原菌的分離、純化及致病性測定。在超凈工作臺中將不銹鋼剪刀用酒精燈外焰灼燒滅菌，剪取黃瓜罹病葉片病健交界處4 mm×4 mm 大小的組織塊，在75%乙醇溶液中消毒1 min 后用無菌水漂洗3 次，風(fēng)干2.5 h，用滅菌的鑷子將組織塊轉(zhuǎn)移到PDA 平板培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿接種4～5 塊，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌落長出后，用滅菌的接種鏟挑取菌落邊緣菌絲塊，菌絲面朝下移入新的PDA 平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接3 次進行純化，菌種4 ℃保存?zhèn)溆肹6]。

將分離得到的菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其長出孢子后，用無菌水配制成濃度為1×106個·mL-1的孢子懸液。采用常規(guī)噴霧法，在溫室選取健康的黃瓜植株（碩寶，唐山恒豐種業(yè)有限公司）噴灑孢子懸浮液，以噴灑無菌水為對照。每個菌株隨機選取5 株黃瓜苗接種，試驗設(shè)置3 次重復(fù)，套塑料袋，保濕培養(yǎng)48 h 后撤袋。接種后3、5、7 d 觀察發(fā)病情況并拍照記錄。參照柯赫氏法則，選取發(fā)病的葉片再次對其進行組織分離，若分離物與接種菌株形態(tài)一致即可確認此分離物為該病害的致病菌[7]。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 病原菌的形態(tài)特征觀察 觀察病原菌在PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、顏色及生長狀況。使用光學(xué)顯微鏡（ZEISS ImagerA.2）觀察分生孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)并拍照，超景深顯微鏡（VHS-600）測量病原菌的100 個分生孢子大小。參照相關(guān)文獻與所觀察結(jié)果進行對比分析，初步鑒定病原菌的種類。

1.4.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 采用Biospin 真菌基因組DNA 提取試劑盒（BSC14S1，杭州博日科技股份有限公司）提取病原菌DNA。以總DNA 為模板，利 用 通 用 引 物 ITS1/ITS4（5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’/5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行PCR 擴增[8]。25 μL 的PCR 反應(yīng)體系如下：PremixTaq［RR901Q，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL以及ddH2O 9.5 μL；PCR 擴增程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共34 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，待出現(xiàn)清晰條帶后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將所得序列在NCBI 網(wǎng)站（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）上與GenBank 中相關(guān)序列進行同源性比對分析，確定病原菌的分類地位。

1.5 病原菌室內(nèi)藥劑敏感性測定

供試菌株：代表菌株HGBB-Ⅲ由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室分離鑒定并保存。供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL，于115 ℃高壓滅菌30 min；水瓊脂培養(yǎng)基（WA），瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL，于115 ℃高壓滅菌30 min。供試藥劑：化學(xué)藥劑共26 種，藥劑名稱、有效成分、劑型及生產(chǎn)廠家信息見表1。

表1 供試藥劑

2021 年6－8 月通過菌絲生長速率法測定病原菌菌絲生長對供試藥劑的敏感性。將每種藥劑用無菌水稀釋成1×103、1×102、1×101、1、1×10-1、1×10-2μg·mL-16 個質(zhì)量濃度，然后按1∶9 的體積比將藥液與PDA 培養(yǎng)基混合制成含藥平板。每種藥劑的各個濃度3 次重復(fù)。對照組（CK）用等量的無菌水代替。代表菌株HGBB-Ⅲ在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用打孔器取6 mm 直徑的菌餅放置到混藥平板上，在25 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，待CK 長至培養(yǎng)皿的2/3 時，采用十字交叉法對菌落直徑進行測量并記錄數(shù)據(jù)。將所得數(shù)據(jù)通過IBM SPSS Statistics 25 數(shù)據(jù)處理軟件進行分析，計算EC50并建立毒力回歸方程，比較不同藥劑的敏感性[9]。

抑菌率/%=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅原始直徑）×100[10]。

孢子萌發(fā)法測定病原菌孢子萌發(fā)對供試藥劑的敏感性：制備病原菌代表菌株HGBB-Ⅲ的孢子懸浮液，調(diào)整濃度為1×106個·mL-1?；焖幤桨宓闹谱髋c菌絲生長速率法相同，但需要將PDA 培養(yǎng)基換成WA 培養(yǎng)基。微量加樣器吸取100 μL 孢子懸液，用涂布器均勻的涂在WA 混藥平板上，每個濃度3 次重復(fù)，放置在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以芽管長度超過孢子最大直徑長度的一半、CK 萌發(fā)率達到90%以上作為標準。每個重復(fù)觀察300 個孢子的萌發(fā)情況并記錄，將所得數(shù)據(jù)通過SPSS 數(shù)據(jù)處理軟件進行分析，計算EC50并建立毒力回歸方程，比較病原菌的孢子萌發(fā)對不同藥劑的敏感性[11]。

孢子萌發(fā)率/%=（萌發(fā)孢子總數(shù)/孢子總數(shù)）×100。

孢子萌發(fā)抑制率/%=（對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率×100[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

由圖1 可知，病原菌以危害黃瓜葉片為主，正反面均可被侵染。發(fā)病初期為黃色水漬狀斑點，后期擴散成圓形或不規(guī)則形，葉片正面病斑粗糙不平、病斑整體淺褐色、病健交界處明顯、易穿孔，中后期多個病斑連接成片。

圖1 黃瓜靶斑病發(fā)病癥狀

2.2 病原菌的分離、純化與致病性測定

通過組織分離法對罹病葉片進行分離、純化后獲得20 個菌落形態(tài)一致的菌株。采用孢子懸浮液噴霧法將所得到的20 個菌株配成孢子懸浮液，噴灑到健康黃瓜葉片上進行致病性測定，3 d 后經(jīng)過孢子懸浮液處理后的葉片出現(xiàn)黃色點狀病斑（代表菌株接種情況見圖2），與田間發(fā)病初期癥狀基本相同；噴灑無菌水的對照組葉片無發(fā)病癥狀。將發(fā)病葉片重新進行組織分離，所得分離物的培養(yǎng)特征、孢子形態(tài)與接種菌株一致，因此可以確定分離得到的20 株菌均為黃瓜靶斑病的致病菌。

圖2 代表菌株HGBB-Ⅲ致病性測定結(jié)果

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)學(xué)特征 病原菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后，菌落近圓形，邊緣整齊，菌落中心呈灰綠色，邊緣呈白色散射狀，致密，有輪紋（圖3-A）。分生孢子梗直立或彎曲、多單生、有分隔、無分支（圖3-B）。分生孢子呈圓柱形，近倒棍棒狀，淺褐色，孢子大小為（17.52～174.20）μm×（2.48～6.63）μm，有油球，具有1 個或多個隔膜（圖3-C、D）。經(jīng)查閱相關(guān)文獻，對比形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)該病原菌與Corynespora cassiicola的形態(tài)極其相似。

圖3 病原菌HGBB-Ⅲ的形態(tài)特征

2.3.2 病原菌分子生物學(xué)鑒定 以獲得菌株的基因組DNA 為模板，用真菌通用引物ITS1/ITS4 進行PCR 擴增，測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 同源性比較并提交序列，獲得登錄號為OM943959。結(jié)果顯示，所測菌株的ITS 序列與GenBank 中Corynespora cassiicola（Accession No.JQ595296）序列的一致性為100%，進一步確定該致病菌為多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk & Curt）Wei]。

2.4 病原菌室內(nèi)藥劑敏感性測定

2.4.1 病原菌菌絲生長對供試藥劑的敏感性測定結(jié)果 由表2 可知，代表菌株HGBB-Ⅲ對26種藥劑的敏感程度不同。病原菌菌絲生長對25%咪鮮胺EC、40%肟菌·咪鮮胺EW、40%苯醚甲環(huán)唑SC 和10%苯醚甲環(huán)唑WG 的敏感性最高，EC50＜1 mg·L-1；對430 g·L-1戊唑醇SC、50%腐霉利WP、50%福美雙WP、50%異菌脲WP、75%肟菌·戊唑醇WG、40%唑醚·戊唑醇SC、32.5%苯甲·嘧菌酯SC、30%肟菌·戊唑醇SC 的敏感性略低，1 mg·L-1＜EC50＜10 mg·L-1；對12%苯甲·氟酰胺SC 等14 種殺菌劑的敏感性較差，EC50＞10 mg·L-1；70%甲基硫菌靈WP 對抑制黃瓜靶斑病多主棒孢菌菌絲生長基本無效。

表2 病原菌HGBB-III 菌絲生長對26 種殺菌劑的敏感性

2.4.2 病原菌孢子萌發(fā)對26 種藥劑的敏感性 由表3 可知，代表菌株C.cassiicolaHGBB-Ⅲ的孢子萌發(fā)對供試藥劑的敏感性不同。對50%福美雙WP的敏感性最高，EC50為0.039 mg·L-1；對42.4%唑醚·氟酰胺SC、200 g·L-1氟酰羥·苯甲唑SC、40%唑醚·戊唑醇SC、12%苯甲·氟酰胺SC 的敏感性較低，10 mg·L-1＜EC50＜100 mg·L-1；對40%肟菌·咪鮮胺EW 等21 種殺菌劑的敏感性較差，EC50＞100 mg·L-1。

表3 病原菌HGBB-III 孢子萌發(fā)對26 種殺菌劑的敏感性

3 討論與結(jié)論

多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（Berk&M.A. Curtis）C.T.Wei]是棒孢屬內(nèi)寄主最廣、發(fā)現(xiàn)最早的種，為模式菌種；最早由我國真菌分類學(xué)家魏景超于1950 年定名為多主棒孢菌[12-13]。該病菌主要侵染黃瓜，王爽等[14]和李俊香等[15]發(fā)現(xiàn)，海南省三亞市和廣西壯族自治區(qū)武鳴縣的甜瓜也可受到侵染；除此之外還能侵染380 屬530 余種植物，如番茄、大豆、橡膠、棉花等[16]。由該病菌侵染所引起的黃瓜靶斑病于1906 年[17]在歐洲首次報道，1960 年[18]在中國首次發(fā)現(xiàn)，目前在我國遼寧[19]、山東[20]、寧夏[21]、廣東[7]等多個省、自治區(qū)均有發(fā)生，但并未見內(nèi)蒙古自治區(qū)由多主棒孢菌（C.cassiicola）侵染引起黃瓜靶斑病發(fā)生與危害的報道。因此，筆者的研究對防控內(nèi)蒙古自治區(qū)此病害具有重大意義。

筆者發(fā)現(xiàn)C.cassiicola菌絲生長對25%咪鮮胺EC 的敏感性最高，EC50為0.028 mg·L-1，與徐麗慧等[22]、遲曉紅等[23]的研究結(jié)果一致；對40%苯醚甲環(huán)唑SC、10%苯醚甲環(huán)唑WG 和430 g·L-1戊唑醇SC的敏感性也較高，EC50分別為0.752、0.890 和1.331 mg·L-1；并且代表菌株對75%肟菌·戊唑醇WG 也較為敏感，與2020 年吳仁鋒等[24]報道75%肟菌·戊唑醇WG 對黃瓜靶斑病的田間防效可達86.5%相吻合。而張乃樓等[25]曾測定了遼寧省黃瓜靶斑病菌對97.3%苯醚甲環(huán)唑和98%戊唑醇原藥的敏 感 性，平 均EC50為（7.109±4.578）μg·mL-1和（9.398±4.944）μg·mL-1。筆者的研究中50%福美雙WP（天津市施普樂農(nóng)藥技術(shù)發(fā)展有限公司）對C.cassiicola代表菌株孢子萌發(fā)的抑制作用最高，EC50為0.039 mg·L-1，同時對菌絲生長的抑制效果也較好，EC50為1.708 mg·L-1；祁之秋等[26]發(fā)現(xiàn)50%福美雙WP 對靶斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用略為明顯，EC50為6.62 μg·mL-1；闞琳娜等[27]發(fā)現(xiàn)，50%福美雙WP 對黃瓜靶斑病的田間防效可達89.16%。綜合上述研究結(jié)果，福美雙可作為防控黃瓜靶斑病的首選藥劑。

福美雙在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)（http://www.icama.org.cn/hysj/index.jhtml）上登記主要用于防治黃瓜白粉病、霜霉病，也有復(fù)配制劑用于防治黃瓜炭疽病和黑星病[28]。筆者的研究結(jié)果表明，該藥劑不僅可以用于防治上述病害，在黃瓜靶斑病的防治上也具有非常大的優(yōu)勢。近年來，在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)黃瓜靶斑病防治難度加大，很多藥劑并不能取得較好的防治效果，病原菌田間抗藥性問題也日趨嚴重，通過病原菌對藥劑敏感性的測定，篩選出一些抑菌活性較高的藥劑進行混用或者交替使用是防治病害的有效途徑，也是延緩病菌抗藥性產(chǎn)生的有效措施，對生產(chǎn)中病害的防控具有重要意義。

筆者對來自于內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市寧城縣五化鎮(zhèn)山頭村的黃瓜病害標本進行組織分離，共獲得菌株20 株，經(jīng)柯赫氏法則驗證、形態(tài)及分子生物學(xué)鑒定，該20 株菌均為致病菌Corynespora cassiicola，所引起的病害為黃瓜靶斑病。選取26 種化學(xué)藥劑同時采用菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法進行室內(nèi)藥劑敏感性測定，結(jié)果顯示，代表菌株HGBB-Ⅲ孢子萌發(fā)對50%福美雙WP 最為敏感，可用于黃瓜靶斑病害的預(yù)防；菌絲生長對25%咪鮮胺EC、40%肟菌·咪鮮胺EW、40%苯醚甲環(huán)唑SC 和10%苯醚甲環(huán)唑WG 4 種藥劑敏感性較高，病害發(fā)生后的治療過程可用50%福美雙WP 與上述4 種藥劑進行混配使用，具體防治效果有待于進一步試驗驗證。