鄒小瓊， 薛春紅， 王 平， 王燕靖， 李 鑫， 劉 暢， 農(nóng)蔚霞， 李 楓， 陳 芳， 張慶梅， 羅 彬， 謝小薰

膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的81%[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)分級標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤分為四級，其中Ⅰ～Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ～Ⅳ級為高級別膠質(zhì)瘤[2]。腫瘤發(fā)生是內(nèi)外因素長期影響及多基因相互作用的結(jié)果[3]。由于膠質(zhì)瘤早期癥狀隱匿，病情進(jìn)展快，多數(shù)患者在確診時已錯失最佳治療時機[4]。因此，進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤發(fā)病機理，探索潛在的特異性腫瘤標(biāo)志物和有效治療靶點，對膠質(zhì)瘤的早期診斷和臨床治療具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是近年來非編碼RNA領(lǐng)域的研究熱點。Kun-Peng等[5]的研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0081001可作為骨肉瘤診斷和預(yù)后預(yù)測的生物標(biāo)志物，且效能優(yōu)于堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶；還發(fā)現(xiàn)血清中該circRNA的表達(dá)水平可動態(tài)反映骨肉瘤患者的病情變化。另一研究顯示，circ-LDLRAD3聯(lián)合癌抗原19-9(cancer antigen 19-9,CA19-9)診斷胰腺癌具有良好的敏感性和特異性[6]。還有研究顯示胃癌患者血漿的hsa_circ_0000419表達(dá)水平與腫瘤分期、淋巴和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、神經(jīng)周圍浸潤顯著相關(guān)，其有作為胃癌預(yù)后指標(biāo)的潛質(zhì)[7]。circRNA在膠質(zhì)瘤方面的研究剛起步，有文獻(xiàn)報道外泌體hsa_circ_0072083可通過增加Nanog同源盒轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)替莫唑胺的耐藥，這為改善替莫唑胺治療膠質(zhì)瘤的療效提供了新思路[8]。鑒定更多circRNA的功能作用將可為腫瘤診斷和靶向治療提供更多選擇。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0021350在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)上調(diào)。鑒此，本研究旨在探討hsa_circ_0021350在膠質(zhì)瘤診斷和治療中的潛在價值。

1 資料與方法

1.1組織標(biāo)本來源 選擇2016年1月至2022年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科經(jīng)手術(shù)獲取的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本40例，正常腦組織標(biāo)本10例。膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中高級別膠質(zhì)瘤(WHO分級為Ⅲ～Ⅳ級)22例，低級別膠質(zhì)瘤(WHO分級為Ⅰ～Ⅱ級)18例。其中男性22例，女性18例，中位年齡為42.5歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后病理檢查證實為膠質(zhì)瘤；(2)術(shù)前未接受放療或化療；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)生命體征不穩(wěn)定者；(2)合并其他腫瘤者；(3)合并嚴(yán)重的器質(zhì)性疾病或凝血障礙者。正常腦組織標(biāo)本來源于顱腦外傷行內(nèi)減壓手術(shù)患者。所有組織標(biāo)本經(jīng)手術(shù)切取后凍存于-80 ℃液態(tài)氮。通過醫(yī)院病歷系統(tǒng)收集所有患者的一般臨床資料以及病理檢查結(jié)果。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(編號：20220098)，研究對象或家屬均簽署知情同意書。

1.2細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SF126購于國家生物醫(yī)學(xué)實驗細(xì)胞資源庫，并在本實驗室傳代保存。使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和1%的青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為：5% CO2，95%飽和濕度，37 ℃。

1.3總RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取組織標(biāo)本總RNA；采用RNA提取試劑盒(Vazyme，美國)提取細(xì)胞總RNA。采用超微量分光光度計(OSE-260)測定RNA純度，選擇260/280 OD值為1.8～2.0的樣本，經(jīng)HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(Vazyme公司，美國)試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4核糖核酸外切酶RNase R消化實驗 應(yīng)用核糖核酸外切酶RNase R驗證circRNA的存在。提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF126總RNA，并將其分為2份，一份用RNase R消化處理(RNase R+)，將1 μl的RNase R加到2.5 μg的總RNA中，37 ℃孵育20 min后，70 ℃ 20 min滅活酶；另一份不做任何處理(RNase R-)。

1.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR) 以上述(方法1.4)經(jīng)RNase R+和RNase R-處理的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以之為模板，應(yīng)用發(fā)散引物(hsa_circ_0021350的引物)和收斂引物(sox6 mRNA的引物)分別進(jìn)行RT-PCR，所用引物由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系：2×Rapid Tap Master Mix 12.5 μl，ddH2O 9.5 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl。反應(yīng)條件為95 ℃變性3 min，95 ℃ 15 s， 54 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，35個循環(huán)，72 ℃ 5 min，最后延伸。將RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行可視化檢測。

表1 引物序列

1.6實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 應(yīng)用hsa_circ_0021350的引物進(jìn)行qRT-PCR(試劑盒購自Vazyme公司)。反應(yīng)體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl，ddH2O 7.2 μl，上、下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目標(biāo)因子的相對表達(dá)量，均重復(fù)3次獨立實驗。

1.7TA克隆測序 將qRT-PCR擴增產(chǎn)物hsa_circ_0021350送上海生物工程股份有限公司進(jìn)行TA克隆測序，檢測產(chǎn)物的序列是否與circBase(http://www.circbase.org/)上的序列一致，以及確定hsa_circ_0021350中是否存在環(huán)化位點。

2 結(jié)果

2.1hsa_circ_0021350鑒定結(jié)果 通過circBase獲取hsa_circ_0021350的序列，查詢顯示hsa_circ_0021350來自人類第11號染色體上sox6基因的第5和第6個外顯子的反向剪接(NM_017508)，長度為242 bp(見圖1?)。將hsa_circ_0021350和sox6 mRNA的qRT-PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果分別與circBase上的對應(yīng)序列進(jìn)行比較，結(jié)果證實這兩種擴增產(chǎn)物是hsa_circ_0021350和sox6 mRNA，且hsa_circ_0021350存在circRNA專有的環(huán)化位點(見圖1?)。

圖1 hsa_circ_0021350在基因組及基因sox6的定位及環(huán)化位點確定圖

2.2circRNA的環(huán)狀特性鑒定結(jié)果 RNase R消化實驗聯(lián)合RT-PCR實驗結(jié)果顯示，在RNase R-組，發(fā)散引物和收斂引物均能擴增出目的基因，分別為hsa_circ_0021350(171 bp)和sox6(107 bp)，其瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰明亮。在RNase R+組，僅發(fā)散引物可擴增出清晰的凝膠電泳條帶，收斂引物擴增產(chǎn)物的凝膠電泳條帶消失，提示線性sox6 mRNA被RNase R消化。進(jìn)一步對比發(fā)現(xiàn)RNase R消化前后，hsa_circ_0021350的電泳條帶無明顯變化，提示hsa_circ_0021350對RNase R的抵抗性高。此外，基因組DNA(genomic DNA,gDNA)僅收斂引物可擴增出電泳條帶，排除hsa_circ_0021350是基因重組產(chǎn)物的可能。見圖2。

<>表示hsa_circ_0021350；><表示sox6 mRNA圖2 RNase R-組、RNase R+組、gDNA組中hsa_circ_0021350與sox6的表達(dá)情況圖

2.3膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織的hsa_circ_0021350表達(dá)水平比較 高級別膠質(zhì)瘤和低級別膠質(zhì)瘤hsa_circ_0021350的表達(dá)水平均高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.368，P<0.001)，且高級別膠質(zhì)瘤hsa_circ_0021350的表達(dá)水平較低級別膠質(zhì)瘤更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 低級別膠質(zhì)瘤、高級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織hsa_circ_0021350表達(dá)水平比較圖

2.4膠質(zhì)瘤組織hsa_circ_0021350表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 以hsa_circ_0021350表達(dá)水平的中位數(shù)將膠質(zhì)瘤患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析結(jié)果顯示，hsa_circ_0021350的表達(dá)與膠質(zhì)瘤分級、ki67陽性率具有顯著關(guān)聯(lián)性(P<0.05)，但與患者年齡、性別、腫瘤大小、Karnofsky評分，以及P53、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen,EMA)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(recombinant O-6-methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)等相關(guān)分子的表達(dá)情況無顯著關(guān)聯(lián)性(P>0.05)。見表2。

表2 hsa_circ_0021350表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

3 討論

3.1目前，臨床上對于膠質(zhì)瘤的治療主要以手術(shù)治療為主，輔以放射治療和化學(xué)藥物治療，近年來這些治療方式都取得了一定進(jìn)展。然而，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤位置的特殊性，臨床上常出現(xiàn)外科手術(shù)不能完全切除腫瘤情況。另外，術(shù)后殘留的腫瘤細(xì)胞對放射治療和化學(xué)藥物治療存在抵抗性，這使得膠質(zhì)瘤的治療效果不佳，患者的病死率和復(fù)發(fā)率仍然較高[9]。鑒此，近年來越來越多的研究提出通過靶向治療提高膠質(zhì)瘤患者的生存率，而目前一些靶向藥物在膠質(zhì)瘤治療中初顯良好的應(yīng)用前景[10-11]。開發(fā)膠質(zhì)瘤的靶向藥物需要特異性的靶分子，尋找和鑒定潛在的靶分子，分析它們表達(dá)的特性及臨床意義，可為膠質(zhì)瘤的靶向治療及診斷帶來新思路。

3.2circRNA是一類在臨床診療中具有應(yīng)用前景的分子，早在20世紀(jì)70年代研究人員就在病毒中發(fā)現(xiàn)了circRNA，但當(dāng)時認(rèn)為這是一種錯誤的剪切產(chǎn)物[12]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，眾多的circRNA被發(fā)現(xiàn)。circRNA的5′和3′端共價結(jié)合形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，不易降解，比線性RNA更加穩(wěn)定[13]。有研究顯示，circRNA的半衰期中位值為18.8～23.7 h，而它們的同源線性RNA的半衰期中位值為4.0～7.4 h[14]。circRNA除了在生物體細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性之外，其在不同物種之間也顯示出高度保守性，因此具有作為疾病診斷生物學(xué)標(biāo)志物的巨大潛力?，F(xiàn)已知有許多circRNA呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)，主要通過可變剪接、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、編碼蛋白、抗病毒免疫反應(yīng)和微小RNA(micro RNA，miRNA)海綿作用等方式在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[15-17]。目前越來越多的研究表明，circRNA與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Zhou等[18]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_01844能促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和遷移，而上調(diào)hsa_circ_01844能誘導(dǎo)凋亡，對膠質(zhì)瘤起抑制作用。還有研究顯示，hsa_circ_0082375可通過調(diào)節(jié)Wnt7B促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展[19]。hsa_circ_CLIP2可通過miR-195-5p/高遷移率組盒3(high mobility group box 3,HMGB3)軸調(diào)控膠質(zhì)瘤生長[20]。

3.3本課題組前期對5例正常腦組織和5例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中進(jìn)行了高通量測序，共篩選出了879個差異表達(dá)的circRNA，包括224個高表達(dá)的circRNA和655個差異性低表達(dá)的circRNA，其中hsa_circ_0021350是差異性高表達(dá)的circRNA，且目前國內(nèi)外均未見有相關(guān)文獻(xiàn)報道。故本研究采用qRT-PCR檢測hsa_circ_0021350在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，并分析其臨床意義，以探究其在膠質(zhì)瘤臨床診斷和治療方面的作用。對于qRT-PCR技術(shù)而言，引物特異性至關(guān)重要，因此本課題組首先通過克隆測序確認(rèn)了所采用的發(fā)散引物所擴增的qRT-PCR產(chǎn)物為hsa_circ_0021350。鑒于circRNA與普通的線性RNA有不同特性，我們進(jìn)一步通過RNase R消化聯(lián)合RT-PCR實驗證實了hsa_circ_0021350的環(huán)狀特性及其穩(wěn)定性。以上這兩項鑒定確保了qRT-PCR法測定膠質(zhì)瘤中hsa_circ_0021350表達(dá)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示，hsa_circ_0021350在膠質(zhì)瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，提示hsa_circ_0021350可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0021350的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤分級、ki67陽性率具有顯著關(guān)聯(lián)性。ki67被廣泛認(rèn)為是一種潛在的增殖預(yù)后標(biāo)志，有成為癌癥診斷標(biāo)志物的應(yīng)用潛力[21-22]。ki67的陽性率越高，提示腫瘤惡性程度越高，患者預(yù)后越差[23]。這也提示hsa_circ_0021350可能與膠質(zhì)瘤的增殖相關(guān)，可能是判斷膠質(zhì)瘤惡性程度和預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

3.4本研究也存在一些不足：(1)納入樣本量較少，未能分析患者的生存預(yù)后；(2)未能分析膠質(zhì)瘤患者血液中hsa_circ_0021350的表達(dá)情況；(3)研究結(jié)果尚不夠深入，hsa_circ_0021350的具體作用機制仍有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，hsa_circ_0021350在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，且可能與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展相關(guān)，可能成為膠質(zhì)瘤患者的有價值的診斷標(biāo)志物及治療靶標(biāo)，但結(jié)論及具體機制尚需進(jìn)一步驗證。