楊麗萍 毛寶宏 梁勤 楊建忠 馬國珍

1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的一種主要病理學(xué)類型，約占85%～90%［1］。世界范圍內(nèi)，HCC仍然是發(fā)生和死亡上升最快的癌癥之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第三大病因［2，3］?，F(xiàn)有的研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）和/或丙型肝炎病毒（HCV）感染、酗酒、黃曲霉毒素污染等是HCC的主要危險(xiǎn)因素，在亞太地區(qū)，HBV感染是導(dǎo)致HCC的主要病因［4］。近年來，隨著HCC早期診斷與治療技術(shù)的不斷發(fā)展，HCC患者生存時(shí)間有所增加，但長期預(yù)后仍然較差。有研究顯示［5］，如果HCC患者能早期診斷并盡早進(jìn)入臨床治療，其5年生存率將超過60%。因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷能顯著降低HCC的疾病負(fù)擔(dān)，改善總體生存時(shí)間。目前，臨床最常用的HCC檢測生物標(biāo)志物為甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），但其診斷特異度不高，容易漏診，診斷價(jià)值受限。熱休克蛋白90α（heat shock protein 90a，Hsp90α）是細(xì)胞中與應(yīng)激損傷關(guān)系密切的一種分子伴侶蛋白，參與PI3K-Akt等相關(guān)通路，在HCC患者血清和組織中高表達(dá)［6］，可作為HCC的診斷和預(yù)后指標(biāo)。為此，本研究通過對血清Hsp90α、AFP及甲胎蛋白異質(zhì)體L3（AFP-L3）聯(lián)合檢測，分析其對HCC的診斷價(jià)值，為提高HCC的早期診斷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 以2020年1月至2021年8月在甘肅省中醫(yī)院肝病科連續(xù)就診的113例HCC患者及165例慢性乙型肝炎患者為研究對象。納入的HCC患者均符合原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，慢性乙型肝炎患者符合最新慢性乙型肝炎防治指南中的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他功能障礙性疾病；②轉(zhuǎn)移性肝癌；③合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染；④伴有自身免疫性疾??；⑤妊娠或哺乳期女性。選取同期在我院進(jìn)行體檢的188例健康人群為對照組，排除各系統(tǒng)疾病患者，注意年齡、性別等一般特征的可比性。所有研究對象均知情同意后納入本研究，并經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 清晨空腹抽取研究對象靜脈血3mL，于2小時(shí)內(nèi)送至檢驗(yàn)中心，以4000r/min的轉(zhuǎn)速持續(xù)離心10min，分離血清。采用羅氏公司cobas 8000全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)測定血清AFP-L3及AFP水平，當(dāng)檢測結(jié)果大于原液檢測上限時(shí)，手動(dòng)稀釋后重新上機(jī)測定。以酶聯(lián)免疫吸附法（普羅吉生物科技有限公司）測定血清Hsp90α水平。以上所有操作均嚴(yán)格按照儀器說明書逐步進(jìn)行，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品均由儀器配套試劑公司提供。以診斷性試驗(yàn)的可靠性（診斷符合率）與真實(shí)性（靈敏度、特異度、約登指數(shù)），評(píng)價(jià)分析其單獨(dú)或聯(lián)合作用下對HCC的診斷價(jià)值，用ROC曲線比較其應(yīng)用價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS 9.4軟件建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，組間差異比較用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的差異比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。用O－rigin 9.2軟件繪制ROC曲線評(píng)價(jià)血清Hsp90α、AFP-L3及AFP在單獨(dú)或聯(lián)合作用下對HCC的診斷價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組間基本情況 本研究共納入研究對象466例，其中HCC患者113例，慢性乙型肝炎患者165例，健康對照人群188例。60歲以上307例（65.88%），60歲以下159例（34.12%）；男性328例（70.39%），女性138例（29.61%）。經(jīng)組間均衡性檢驗(yàn)，三組研究對象年齡、性別、民族、文化程度及體質(zhì)指數(shù)間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明三組研究對象基線資料均衡可比。見表1。

表1 組間基本情況比較［例（%）］

2.2 組間血清腫瘤標(biāo)志物水平 經(jīng)方差分析，三組研究對象AFP、Hsp90α及AFP-L3差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較后結(jié)果顯示，肝細(xì)胞肝癌組與慢性乙肝組的血清AFP、Hsp90α及AFP-L3的水平均高于健康對照組（P<0.05）。見表2。

表2 組間血清腫瘤標(biāo)志物差異情況（）

表2 組間血清腫瘤標(biāo)志物差異情況（）

注：a：肝細(xì)胞肝癌組與健康對照組兩兩比較P<0.05；b：慢性肝炎組與健康對照組兩兩比較P<0.05

血清腫瘤標(biāo)志物 肝細(xì)胞肝癌組（n=113） 慢性乙肝組（n=165） 健康對照組（n=188） F P Hsp90α（ng/mL） 139.46±46.82a 73.41±16.40b 50.19±13.86 407.98 <0.001 AFP-L3（%） 27.49±11.58a 5.38±2.80b 2.34±1.09 686.12 <0.001 AFP（ng/mL） 247.48±119.13a 55.15±31.04b 11.23±4.40 549.013 <0.001

2.3 各腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合檢測對HCC的診斷價(jià)值分析 單一指標(biāo)檢測診斷HCC時(shí)，AFP-L3的診斷符合率最高（85.16%），其約登指數(shù)也最大（0.687）。進(jìn)一步聯(lián)合診斷分析顯示，當(dāng)Hsp90α、AFP-L3及AFP檢測均陽性（串聯(lián)試驗(yàn)）時(shí)，診斷肝細(xì)胞肝癌的靈敏度、特異度、診斷符合率、約登指數(shù)等均最大，分別為91.29%、93.42%、93.72%、0.847，提示三種血清標(biāo)志物串聯(lián)試驗(yàn)時(shí)，對肝細(xì)胞肝癌的診斷價(jià)值最高。見表3。

2.4 血清腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)或聯(lián)合檢測ROC曲線下面積比較Hsp90α、AFP-L3及AFP診斷HCC的ROC曲線分析顯示，三種血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測診斷HCC的曲線下面積最大（AUC=0.945），高于各指標(biāo)單獨(dú)或聯(lián)合檢測的曲線下面積，見表3與圖1。經(jīng)假設(shè)檢驗(yàn)，與AFP曲線下面積相比（AUC=0.812），Z=5.205，P<0.001；與Hsp90α曲線下面積相比（AUC=0.806），Z=5.093，P<0.001，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與AFP+Hsp90α曲線下面積相比（AUC＝0.921），Z＝1.357，P＝0.087，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明三種指標(biāo)聯(lián)合檢測的診斷價(jià)值更高，但AFP+Hsp90α聯(lián)合診斷與AFP+Hsp90α+AFP-L3聯(lián)合診斷的效能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Hsp90α、AFP-L3及AFP聯(lián)合檢測診斷HCC的ROC曲線圖

表3 Hsp90α、AFP-L3與AFP對HCC的診斷價(jià)值分析

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有20億人感染HBV，其中有2.6億人目前仍處于持續(xù)感染狀態(tài)，每年由HBV感染引起的肝硬化和肝癌患者達(dá)88.7萬人，其中與HBV感染相關(guān)的癌變占19.20%［9，10］。作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的癌癥之一，肝癌已成為繼肺癌和結(jié)直腸癌之后的世界第三大癌癥死亡原因［11］，而這其中絕大多數(shù)為HCC。由于缺乏早期癥狀和體征，大多數(shù)HCC患者在臨床上被發(fā)現(xiàn)時(shí)已是侵襲性腫瘤進(jìn)展階段，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后。因此，發(fā)現(xiàn)一組特異性高、可靠性強(qiáng)的HCC早期診斷標(biāo)志物已成為當(dāng)下一個(gè)緊迫任務(wù)。

AFP是目前HCC輔助性診斷中常用的血清標(biāo)志物，它會(huì)隨著肝細(xì)胞的再生而升高，在部分肝硬化及肝臟炎癥患者中也會(huì)出現(xiàn)不同程度的升高［12］，降低了AFP作為腫瘤標(biāo)志物的特異性。近年來，隨著人們對AFP糖基化形式的不斷研究，發(fā)現(xiàn)血清中不同AFP糖基化特征不僅反映其數(shù)量的改變，而且能定性評(píng)估原發(fā)性肝癌表達(dá)的蛋白質(zhì)［13］。美國FDA已將甲胎蛋白異質(zhì)體比率（AFP-L3%）作為高特異性指標(biāo)納入原發(fā)性肝癌的預(yù)警標(biāo)志，并將AFP-L3%≥10%作為診斷原發(fā)性肝癌的臨界值。Hsp 90α是一種分子伴侶蛋白，廣泛參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理活動(dòng)，在多種惡性腫瘤中均有異常表達(dá)。正常靜止的細(xì)胞不分泌Hsp90α［14］，但在輻射、缺氧等細(xì)胞環(huán)境改變的情況下，Hsp90α可分泌到細(xì)胞外，與Hsp70、轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）等組織損傷釋放的細(xì)胞因子共同影響腫瘤實(shí)體的微血管浸潤、侵襲、生長及轉(zhuǎn)移，這一過程很可能在肝細(xì)胞癌變的初期或前期就已啟動(dòng)［6，14］。也有研究證實(shí)，使用Hsp90α抑制劑可顯著減少Hsp90α的過表達(dá)，阻止肝腫瘤細(xì)胞的增殖與分裂［15］。由此表明，Hsp90α不僅可作為HCC的早期診斷標(biāo)志物，還可為其靶向治療提供理論支持。

本研究顯示，HCC患者血清Hsp90α與AFP-L3水平均高于慢性乙肝患者及健康人群。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，單一指標(biāo)診斷HCC時(shí)，AFP的靈敏度最低（72.26%），Hsp90α最高（80.25%），而AFP-L3的特異度較好（90.46%）且約登指數(shù)最大，這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果類似［16］，提示血清AFP-L3能很好區(qū)分肝臟的良惡性病變，而Hsp90α在HCC患者血清和組織中表達(dá)較高。三種指標(biāo)聯(lián)合診斷時(shí)，其靈敏度、特異度、約登指數(shù)均最大，經(jīng)ROC曲線下面積比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明聯(lián)合檢測能規(guī)避單一指標(biāo)的檢測缺點(diǎn)，使靈敏度和特異度具有良好的互補(bǔ)作用，減少了HCC的誤診和漏診，顯著提升了診斷符合率，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

HCC的早期篩查與診斷具有重要的臨床意義，能較早選擇理想的治療方案，提高患者的生活質(zhì)量，減輕了患者的疾病負(fù)擔(dān)。近年來，隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)研究的不斷深入，使HCC的早期篩查與診斷逐漸成為可能。目前已報(bào)道能用于早期診斷HCC的血清標(biāo)志物較多，但還沒有發(fā)現(xiàn)較為理想的組合篩查形式［17］。本研究結(jié)果表明，血清Hsp90α、AFP-L3及AFP聯(lián)合檢測可顯著提升HCC的診斷符合率，彌補(bǔ)單一檢測指標(biāo)的不足，提高了HCC的早期診斷價(jià)值，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。