吳麗娟，雷小文，劉珍妮，譚東海，謝華亮，鐘云平，黎觀紅，張泳楨，王文海，鄧茂林，李建軍*

(1. 贛州市畜牧水產(chǎn)研究所，341000，江西，贛州；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，330045，南昌；3. 瑞金市杰仕柏蚯蚓養(yǎng)殖有限公司，342500，江西，贛州)

0 引言

硒是生命體重要的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)動(dòng)植物體免疫、抗氧化及生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等方面均有積極的作用[1-2]。中國作為公認(rèn)的缺硒大國，72%的地區(qū)屬于低硒或缺硒地區(qū)，且土壤中有效硒含量只占總硒的1.7%～5.5%，植物難以吸收轉(zhuǎn)化利用[3]。食物是人體補(bǔ)硒的重要途徑，而土壤缺硒會(huì)通過食物鏈影響動(dòng)植物體中硒的含量。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國不同地區(qū)居民平均硒攝入量?jī)H為43.3 μg/d，遠(yuǎn)低于成人推薦硒攝入量60～400 μg/d[4-5]。因此，需要通過提高土壤及膳食中硒的含量來改善人體硒攝入不足的營(yíng)養(yǎng)問題。

有機(jī)硒一般以硒蛋白、硒氨基酸和硒多糖等形式存在，與無機(jī)硒相比，具有毒副作用小、活性強(qiáng)及吸收率高等優(yōu)點(diǎn)，是人體及動(dòng)植物最佳的營(yíng)養(yǎng)硒源。蚯蚓體含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、提高免疫功能和維護(hù)腸道健康的功能，是一種綠色安全高效的飼料添加劑[6-8]。蚯蚓糞是蚯蚓體的代謝物，富含氮、磷、鉀等可溶性鹽及植物生長(zhǎng)激素、腐殖酸、氨基酸、土壤酶、有機(jī)質(zhì)等物質(zhì)，且含有數(shù)量龐大、種類豐富的微生物群體[9-12]，同時(shí)兼具了生物有機(jī)肥、氨基酸肥和腐殖酸肥等肥料的特性，是一種高效的有機(jī)肥。蚯蚓體對(duì)硒具有很好的轉(zhuǎn)化作用，在蚯蚓基料中外源添加無機(jī)硒，蚯蚓體能將無機(jī)硒高效轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒[13-14]，且對(duì)蚯蚓糞中硒的含量也有積極作用[15]。岳士忠[16-17]指出低濃度的亞硒酸鈉(0 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)對(duì)蚓體生長(zhǎng)繁殖沒有影響，且隨著外源硒添加濃度的升高，蚓體總硒及有機(jī)硒含量也增加，但未分析高濃度對(duì)蚓體生長(zhǎng)繁殖情況及蚓糞中硒轉(zhuǎn)化效果。劉軍[18]研究表明，在牛糞中添加40 mg/kg的亞硒酸鈉可顯著提高蚓體和蚓糞中總硒及有效硒的含量，但未系統(tǒng)分析不同硒添加濃度對(duì)蚓體和蚓糞中硒的轉(zhuǎn)化效果以明確硒的最佳添加濃度。本研究以太平2號(hào)蚯蚓為試驗(yàn)材料，牛糞為蚯蚓養(yǎng)殖基料，探討不同濃度亞硒酸鈉對(duì)蚯蚓體及蚯蚓糞硒的轉(zhuǎn)化效果，并結(jié)合蚓體生長(zhǎng)的情況，尋求亞硒酸鈉適宜添加濃度，旨在為含硒蚯蚓體作為飼料添加劑和含硒蚯蚓糞作為有機(jī)硒肥的開發(fā)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蚯蚓(太平2號(hào))由瑞金市杰仕柏蚯蚓養(yǎng)殖有限公司提供，單條體重約為0.12～0.13 g；牛糞，經(jīng)陳化1個(gè)月，自然風(fēng)干，過4 mm篩，由瑞金市杰仕柏蚯蚓養(yǎng)殖有限公司提供；亞硒酸鈉購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理組，分別為Se0(發(fā)酵牛糞)，Se20(20 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)，Se40(40 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)，Se60(60 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)，Se80(80 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)，Se100(100 mg/kg硒添加量+發(fā)酵牛糞)。

1.3 試驗(yàn)方法

蚯蚓養(yǎng)殖：取適量亞硒酸鈉溶于去離子水中配制成硒濃度為2 g/L的溶液，分別取0 mL、50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL配好的硒溶液加入到5 kg(干重)牛糞中得到硒濃度分別為0 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg和100 mg/kg的培養(yǎng)基料，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，各組水分控制在55%～65%左右，陳化1周。參照劉向輝等[19]試驗(yàn)方法，采用模擬蚯蚓室外養(yǎng)殖方法，在溫室大棚中隔出長(zhǎng)80 cm×寬60 cm×高60 cm的蚯蚓飼養(yǎng)床，床底部鋪一層不漏水的塑料膜(防止硒流失)，然后放入陳化好的基料，每床分別接種500 g太平2號(hào)蚯蚓，做好標(biāo)記，同時(shí)，每床分別隨機(jī)挑選100條蚯蚓，稱重，并記錄；在大棚中培養(yǎng)58 d(18～20 ℃)，每天噴少量的水以保持基料的濕度(55%～65%)。

蚓體和蚓糞收集：采用懼光法，將蚯蚓和基料平鋪在塑料薄膜上，設(shè)置好燈光，逐層去除表層基料，反復(fù)多次，即可獲得蚓體和蚓糞。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 蚓體重量的測(cè)定 培養(yǎng)58 d后，收集所有蚓體，稱取總重，并記錄。

1.4.2 單條蚓體增重的測(cè)定 培養(yǎng)前和培養(yǎng)58 d后，每床分別隨機(jī)挑選100條蚯蚓，稱重，并記錄。單條蚓體增重百分比=(培養(yǎng)后百條重-培養(yǎng)前百條重)/100*100%。

1.4.3 蚓體和蚓糞總硒及無機(jī)硒含量的測(cè)定 培養(yǎng)58 d后，每床隨機(jī)挑15條蚯蚓，黑暗環(huán)境下清腸12 h，去離子水清洗干凈，濾紙擦干，冷凍干燥，備用。每床收集50 g蚓糞，自然風(fēng)干，備用。分別參照GB5009.93—2017中電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS法)測(cè)總硒含量和參照劉軍[18]試驗(yàn)方法測(cè)無機(jī)硒的含量。

蚓體有機(jī)硒的含量=蚓體總硒含量-蚓體無機(jī)硒含量；

蚓糞有機(jī)硒的含量=蚓糞總硒含量-蚓糞無機(jī)硒含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，采用One-Way ANOVA 進(jìn)行方差分析，采用最小顯著極差法(LSD)對(duì)差異顯著的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，P< 0.05表示差異顯著，P< 0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒處理對(duì)蚯蚓生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，與培養(yǎng)前的500 g蚯蚓重量相比，Se0、Se20、Se40、Se60、Se80和Se100 6個(gè)組的蚯蚓重量均有所增加。培養(yǎng)至58 d時(shí)，與未添加亞硒酸鈉的Se0相比，Se20和Se40蚯蚓重量分別增加1.07%和8.13%，其中Se40與Se0組相比差異極顯著(P<0.01)；而Se60、Se80和Se100的蚯蚓重量分別降低了14.37%、35.54%和17.76%(P<0.01)。

圖1 不同濃度硒處理對(duì)蚯蚓重量的影響

如圖2所示，與培養(yǎng)前相比，Se0、Se20、Se40、Se60、Se80、Se100 6組蚯蚓單體增重率分別為88.41%、108.14%、105.36%、60.21%、86.75%、83.27%。與對(duì)照組Se0相比，Se20和Se40組的蚯蚓單體增重率有上升的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；與Se20和Se40組相比，Se60組蚯蚓單體增重率顯著降低(P<0.05)；與Se60組相比，Se80和Se100組蚯蚓單體增重率有上升的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)；Se80和Se100組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同濃度硒處理對(duì)蚯蚓單體重量的影響

2.2 硒處理對(duì)蚓體中轉(zhuǎn)化效果的影響

如表1所示，蚓體培養(yǎng)58 d后，隨著硒添加濃度的升高，蚓體中總硒和有機(jī)硒含量均顯著增加。與對(duì)照組Se0相比，Se20、Se40、Se60、Se80、Se100 5個(gè)組蚓體總硒的含量分別極顯著提高了2.57倍、7.44倍、11.6倍、14.18倍、15.1倍，而蚓體有機(jī)硒含量分別顯著提高了4.93倍、8.04倍、14.2倍、18.22倍、18.67倍，其中Se100組蚓體總硒和有機(jī)硒含量均最高，分別為148.88 mg/kg和99.78 mg/kg。Se60組相較于Se20、Se40組，蚓體總硒和有機(jī)硒含量均極顯著提高(P<0.01)。Se80、Se100與Se60組相比，蚓體總硒含量分別顯著提高了22.23%(P<0.05)和30.13%(P<0.05)，蚓體有機(jī)硒含量分別提高了20.62%(P>0.05)和31.47%(P<0.05)，而Se80和Se100 2組間蚓體總硒與有機(jī)硒含量變化均不顯著(P>0.05)；由此可見，隨著硒添加濃度的升高，蚯蚓體中總硒及有機(jī)硒含量的增加速率變緩。另外，還可以看出，蚓體中有機(jī)硒占總硒百分比在51.38%～67.02%之間波動(dòng)。Se0、Se20、Se40 3個(gè)處理組有機(jī)硒占總硒百分比沒有明顯的差異，當(dāng)硒添加濃度達(dá)到60 mg/kg時(shí)，蚓體有機(jī)硒占總硒百分比相對(duì)于對(duì)照組Se0有顯著的提高(P<0.05)，且隨著硒添加濃度的升高，有機(jī)硒占百分比略微有所提高，但不顯著(P>0.05)。

表1 亞硒酸鈉處理對(duì)蚓體硒含量的影響/mg·kg-1

2.3 硒處理對(duì)蚓糞中硒含量的影響

如表2所示，隨著硒添加濃度的升高，蚯蚓糞中的總硒和有機(jī)硒的含量均顯著增加，但其增加速率逐漸變緩。當(dāng)硒添加濃度為100 mg/kg時(shí)，蚯蚓糞中總硒和有機(jī)硒含量達(dá)到最高，分別為115.48 mg/kg和95.97 mg/kg，與Se80相比，總硒含量呈極顯著增加(P<0.01)，有機(jī)硒含量呈顯著增加(P<0.05)。另外，從蚯蚓糞中有機(jī)硒占總硒百分比可以看出，通過外源添加亞硒酸鈉可顯著提高蚯蚓糞中有機(jī)硒的占比率，其中當(dāng)硒添加濃度為40mg/kg時(shí)，蚯蚓糞中有機(jī)硒占總硒百分比最高，為94.26%；之后，隨著硒添加濃度的升高，蚯蚓糞中有機(jī)硒占比呈下降趨勢(shì)。與Se40相比，Se100組中有機(jī)硒占比顯著下降了6.45%(P<0.05)。

表2 亞硒酸鈉處理對(duì)蚯蚓糞硒含量的影響/mg·kg-1

3 討論

3.1 硒處理對(duì)蚯蚓生長(zhǎng)的影響

硒是動(dòng)物體生長(zhǎng)的必要營(yíng)養(yǎng)元素，但硒劑量過大會(huì)對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制和毒害作用。大量試驗(yàn)研究表明，過量的硒對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)具有毒害作用。劉向輝等[19]研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg的亞硒酸鈉均對(duì)蚯蚓具有顯著的毒性作用，且亞硒酸鈉添加濃度越高，蚯蚓的死亡率也越大。孫曉斐等[16]和劉軍[18]研究結(jié)果也表明，硒添加濃度分別為100 mg/kg和200 mg/kg時(shí)，蚯蚓的生長(zhǎng)受到顯著的抑制作用。本試驗(yàn)得出類似的結(jié)果，即蚯蚓總重量隨著硒添加濃度的升高表現(xiàn)為先升后降，但均為正向增長(zhǎng)。其原因可能是由于低濃度硒對(duì)蚓體的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，但高濃度硒會(huì)破壞蚓體的代謝平衡，對(duì)幼蚓的生長(zhǎng)、成蚓及其產(chǎn)繭能力均產(chǎn)生了抑制和毒害作用，造成蚯蚓產(chǎn)繭率下降、幼蚓及部分成蚓逃逸或死亡[20-22]；另外可能是由于飼養(yǎng)環(huán)境的不同，使得本試驗(yàn)中所有組均為正向增長(zhǎng)。而Se100組總重量相較于Se80組稍有增加，分析原因可能是成蚓對(duì)高濃度硒產(chǎn)生一定的耐受作用，但這還需進(jìn)一步試驗(yàn)研究。同時(shí)，蚯蚓單體增重顯示了與蚓體總重量大體一致的規(guī)律，當(dāng)硒添加濃度為80 mg/kg及以上，蚯蚓單體增重有上升的趨勢(shì)。這可能是由于幼蚓及蚓繭對(duì)高濃度硒更敏感，而成蚓對(duì)高濃度硒耐受性更強(qiáng)，導(dǎo)致存活下來的蚯蚓基本為個(gè)體更大、耐性更強(qiáng)的成蚓。

3.2 硒處理對(duì)蚓體中轉(zhuǎn)化效果的影響

在本試驗(yàn)中蚯蚓體對(duì)硒表現(xiàn)出很好的轉(zhuǎn)化作用，且硒的轉(zhuǎn)化量隨著硒添加濃度的升高而增加。同時(shí)，蚓體中有機(jī)硒的含量也顯著增加，當(dāng)硒添加濃度達(dá)到100 mg/kg時(shí)達(dá)到最高，但增加率相對(duì)有所變緩，這可能是由于高濃度硒影響了蚓體的生長(zhǎng)代謝功能，而導(dǎo)致蚓體對(duì)無機(jī)硒利用率逐漸下降。另外，在本試驗(yàn)中蚓體有機(jī)硒含量占總硒百分比只有51.38%～67.02%，與前人報(bào)道[13,17](91%～93%)的有一定的差距，這可能是受飼養(yǎng)環(huán)境條件的影響限制，導(dǎo)致部分亞硒酸鈉進(jìn)入蚓體內(nèi)未被吸收利用，蚓體對(duì)無機(jī)硒的轉(zhuǎn)化利用率不高，后期還需結(jié)合蚓體轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化進(jìn)一步深入研究蚓體的轉(zhuǎn)化機(jī)制。

3.3 硒處理對(duì)蚓糞中硒含量的影響

現(xiàn)階段，為改善我國土壤缺硒的情況，部分地區(qū)主要通過施用無機(jī)硒肥和有機(jī)硒肥來提高土壤中硒的含量[23]。與有機(jī)硒肥相比，植物對(duì)無機(jī)硒肥轉(zhuǎn)化利用率更低，長(zhǎng)期的使用容易造成土壤中硒含量超標(biāo)，這既不利于植物的生長(zhǎng)，也會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染[24-26]。在本試驗(yàn)中，通過硒元素與蚯蚓堆肥的聯(lián)合利用，可有效提高蚯蚓糞中總硒及有機(jī)硒的含量，且有機(jī)硒含量占總硒百分比最高可達(dá)94.26%。這與前人的研究報(bào)道不同，即認(rèn)為硒元素與蚯蚓堆肥的聯(lián)合利用后，蚓糞中主要以無機(jī)硒為主[17-18]。從本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，未添加外源硒的蚯蚓糞中有機(jī)硒含量占總硒百分比也有80.99%，這說明經(jīng)蚯蚓代謝后的牛糞中可能存在一定比例富硒能力較強(qiáng)的微生物菌群，并在通過外源添加亞硒酸鈉進(jìn)行硒強(qiáng)化后，顯著提高了蚓糞中有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率。同時(shí)，蚯蚓體有機(jī)硒主要以硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)的形式存在[27-28]，本試驗(yàn)條件可能會(huì)刺激蚯蚓分泌有機(jī)硒轉(zhuǎn)化所需要的酶，并促進(jìn)其高效分解牛糞中的有機(jī)質(zhì)而產(chǎn)生了大量的氨基酸，為無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，但還需進(jìn)行深入研究。而硒添加濃度達(dá)到100 mg/kg時(shí)，有機(jī)硒含量的占比有下降的趨勢(shì)，這可能與高濃度硒抑制蚯蚓及微生物菌群的生長(zhǎng)代謝有關(guān)。因此，結(jié)合蚯蚓糞與硒的功能性作用，有可能將含硒蚓糞開發(fā)作為富硒農(nóng)作物的有機(jī)硒肥，并利用蚯蚓堆肥技術(shù)緩解土壤硒污染問題。

4 結(jié)論

在大棚飼養(yǎng)條件下，以發(fā)酵牛糞為基料，通過添加不同濃度的外源硒飼養(yǎng)蚯蚓58 d后，隨著硒添加濃度的升高，蚓體的生長(zhǎng)規(guī)律表現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的變化，但均為正向生長(zhǎng)。同時(shí)，蚓體和蚓糞中總硒和有機(jī)硒的含量，隨著硒添加濃度的升高而顯著增加，增加率表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)；當(dāng)硒添加濃度為100 mg/kg時(shí)，蚓體和蚓糞轉(zhuǎn)化效果最佳，蚓體中總硒含量為148.88 mg/kg，有機(jī)硒含量為99.78 mg/kg；蚯蚓糞中總硒含量為115.48 mg/kg，有機(jī)硒含量為95.97 mg/kg。綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，當(dāng)硒添加濃度為100 mg/kg時(shí)，蚓體和蚓糞中有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化效果最好。