孫玉鳳 談家金 趙曉佳 袁裕超

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

松材線蟲病是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)所引起的一種侵染性病害，傳播速度快，短時(shí)間內(nèi)可造成大面積的松林毀壞[1]。松材線蟲主要以墨天牛屬昆蟲為媒介進(jìn)行傳播，通過(guò)寄生于松樹體內(nèi)而導(dǎo)致樹木迅速死亡[2-3]。自1982年松材線蟲首次在我國(guó)的南京中山陵被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，至今已蔓延至我國(guó)19個(gè)省市，且近年來(lái)有從南向北擴(kuò)散的趨勢(shì)，對(duì)我國(guó)森林資源造成極大破壞。根據(jù)國(guó)家林業(yè)和草原局公告(2021年第14號(hào))(2021年全國(guó)松材線蟲病新發(fā)縣級(jí)疫區(qū)公告)，我國(guó)2021年3—7月新增7個(gè)松材線蟲病縣級(jí)疫區(qū)[4]。由于松材線蟲寄生于松樹體內(nèi)，發(fā)病速度快，其防控已成為世界性的難題[5]。目前還沒有徹底根治的方法，可采取的防治方法有物理防治、化學(xué)防治、生物防治等，其中應(yīng)用最廣泛的是化學(xué)防治，但由于化學(xué)農(nóng)藥易造成環(huán)境污染，且線蟲易產(chǎn)生抗藥性，化學(xué)殺線劑的應(yīng)用受到一定的限制，因此更多的研究者們開始進(jìn)行生物防治研究[6-7]。近年來(lái)的研究表明，在健康植物體內(nèi)能夠篩選到對(duì)松材線蟲具有高效拮抗活性的內(nèi)生細(xì)菌[8-9]。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)NJSZ-13是從松樹體內(nèi)分離的一株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)殺線作用測(cè)定發(fā)現(xiàn)該菌株的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)松材線蟲的致死率能達(dá)到100%，菌體水懸液對(duì)松材線蟲的致死率能達(dá)到81.5%[10]。在實(shí)際應(yīng)用中細(xì)菌需通過(guò)菌體對(duì)松材線蟲起作用，因此本研究針對(duì)NJSZ-13菌懸液對(duì)松材線蟲的作用方式進(jìn)行研究。為了明確蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13對(duì)松材線蟲的作用機(jī)制，本研究在弄清菌株在線蟲蟲體位置的基礎(chǔ)上，揭示了菌株胞外蛋白酶的殺線作用，從而為進(jìn)一步探討蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13的殺線機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株來(lái)源于南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室。

松材線蟲AMA3蟲株分離自安徽省病死黑松(Pinusthunbergii)，現(xiàn)保存于南京林業(yè)大學(xué)松材線蟲蟲株資源庫(kù)。

NJSZ-13菌懸液：挑取NJSZ-13單菌落置于200 r/min、28 ℃條件下持續(xù)搖培，于10 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清，得到的菌體沉淀以原體積1/2的無(wú)菌水徹底懸浮，至最終菌濃度為3×108菌落/mL，即為供試菌懸液。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)有抗培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，青霉素10 mg/L，pH為7.2～7.4。

1.2 菌株NJSZ-13于松材線蟲蟲體上存在位置的鑒定

NJSZ-13菌懸液處理松材線蟲AMA3蟲株24 h后，挑取活的松材線蟲，加入200 μL無(wú)菌水清洗線蟲，3 000 r/min離心3 min，研究表明菌株NJSZ-13對(duì)青霉素耐藥，因此分三組處理，使用加入青霉素的抗性培養(yǎng)基檢測(cè)線蟲帶菌情況。A組吸取離心后的100 μL上清液涂布于抗性培養(yǎng)基，觀察菌株NJSZ-13是否生長(zhǎng)。B組依次使用0.05%硫酸鏈霉素、3%過(guò)氧化氫以及無(wú)菌水徹底清洗線蟲體表。清洗完成后使用無(wú)菌水重懸線蟲，混勻后吸取100 μL蟲液涂布抗性培養(yǎng)基，未長(zhǎng)菌落說(shuō)明線蟲表面消毒成功。C組將體表徹底消毒的松材線蟲研磨破碎，混合物涂布抗性培養(yǎng)基。以無(wú)菌水處理松材線蟲為對(duì)照，觀察線蟲體內(nèi)菌落生長(zhǎng)情況。若抗性培養(yǎng)基中長(zhǎng)出菌落，挑取單菌落進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，提取細(xì)菌DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及純化，將得到的PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

將滅菌玻璃紙覆蓋于固體NA培養(yǎng)基上，以避免線蟲進(jìn)入培養(yǎng)基。將含有g(shù)fp熒光質(zhì)粒的菌株NJSZ-13接種于玻璃紙上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)平板后，將松材線蟲懸液(約1 000條線蟲)分多點(diǎn)打到玻璃紙上，盡量使蟲鋪滿平板，以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。在培養(yǎng)皿底部劃線，將培養(yǎng)皿平均分成20個(gè)小塊，每隔24 h在解剖鏡下隨機(jī)選取5個(gè)小塊，使用Zeiss熒光顯微鏡觀察NJSZ-13在松材線蟲蟲體上的存在位置，每次觀察至少30條松材線蟲。

1.3 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后上清液的殺線活性測(cè)定

已有研究表明NJSZ-13菌懸液對(duì)松材線蟲存在較高的致死作用，為明確NJSZ-13對(duì)松材線蟲的作用方式，使用NJSZ-13處理松材線蟲后的上清液測(cè)定殺線效果。在1.5 mL離心管中分別加入1 mL NJSZ-13菌懸液與50 μL松材線蟲蟲液(約2 000條)，于25 ℃黑暗條件下靜置48 h，10 000 r/min、4 ℃條件下離心取上清液，將1 mL上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，加入50 μL松材線蟲蟲液(約2 000條)，25 ℃黑暗條件下靜置48 h后吸取20 μL(大約50條松材線蟲)于顯微鏡下觀察線蟲死亡情況，以針刺法判定線蟲的死亡，統(tǒng)計(jì)死蟲數(shù)并計(jì)算松材線蟲死亡率。分別以NJSZ-13菌懸液與無(wú)菌水處理松材線蟲48 h后線蟲的死亡率為對(duì)照，每處理重復(fù)5次。

線蟲死亡率=(線蟲死亡數(shù)/線蟲總數(shù))×100%。

在200 mL NJSZ-13菌懸液中加入大約10萬(wàn)條松材線蟲，200 r/min、28 ℃條件下持續(xù)搖培4 d，10 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清，向上清中加入硫酸銨使飽和度達(dá)到100%，4 ℃條件下靜置過(guò)夜，離心取沉淀物用1/10原濾液體積的PBS緩沖液進(jìn)行溶解，溶解完成之后，將溶液裝到截留分子量為8 000～14 000 Da的透析袋進(jìn)行除鹽，得到菌株NJSZ-13的胞外蛋白粗提液。將200 μL胞外蛋白粗提液和等體積線蟲液(約1 000條松材線蟲)混合，每隔24 h查看線蟲存活情況。以PBS緩沖液和沸水浴30 min的胞外蛋白粗提液為對(duì)照，每處理重復(fù)5次。

1.4 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后菌體繁殖量的測(cè)定

將50 mL菌懸液與等體積線蟲液(約5 000條/mL)混合。每隔24 h使用紫外分光光度計(jì)Lambda 365測(cè)定600 nm處的OD值，以O(shè)D值大小反應(yīng)菌體繁殖量的變化。以同等濃度的菌懸液和松材線蟲蟲液為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株NJSZ-13于松材線蟲蟲體上的存在位置

圖1顯示挑取NJSZ-13處理后的松材線蟲加入無(wú)菌水離心取得的上清液涂布抗性平板后長(zhǎng)出菌落(圖1A)，線蟲體表徹底消毒(圖1B)及研磨后(圖1C)涂布抗性平板，均無(wú)菌落生長(zhǎng)。挑取A組中的單菌落進(jìn)行測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，菌處理組的分離菌與蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13的序列結(jié)果一致，水處理組分離菌進(jìn)行序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該菌屬于腸桿菌屬(Enterobacterspp.)。結(jié)果表明，蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13未存在于松材線蟲體內(nèi)。

A為無(wú)菌水清洗線蟲涂布結(jié)果；B為體表消毒后涂布結(jié)果；C為研磨蟲液涂布結(jié)果。

gfp標(biāo)記NJSZ-13菌株處理松材線蟲后，線蟲蟲體熒光菌體數(shù)量隨時(shí)間變化結(jié)果如圖2所示，菌株NJSZ-13隨著時(shí)間的推移逐漸覆蓋蟲體。gfp基因標(biāo)記菌株處理24 h后，菌體附著于松材線蟲體表(圖2A)。處理48 h后，附著于松材線蟲體表的菌體增多(圖2B)。處理72 h，菌體已經(jīng)遍布于松材線蟲全身(圖2C)。對(duì)照組經(jīng)無(wú)菌水處理72 h后，松材線蟲依然存活，線蟲運(yùn)動(dòng)正常，體表無(wú)熒光(圖2D)。結(jié)果進(jìn)一步表明蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13作用位置位于松材線蟲體表。

A為菌株NJSZ-13處理24 h，菌體附著于線蟲體表；B為菌株NJSZ-13處理48 h，附著于松材線蟲體表的菌體增多；C為菌株NJSZ-13處理72 h，菌體覆蓋松材線蟲全身；D為無(wú)菌水處理72 h，線蟲運(yùn)動(dòng)正常。

2.2 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后上清液的殺線活性

NJSZ-13菌懸液處理松材線蟲后的上清液殺線活性如表1所示。離心所得的上清液處理線蟲48 h后，松材線蟲死亡率為13.58%，與無(wú)菌水對(duì)照無(wú)顯著差異，而NJSZ-13菌懸液處理松材線蟲48 h后，松材線蟲死亡率達(dá)到70.19%，與上清液相比差異顯著。該結(jié)果表明NJSZ-13菌懸液處理松材線蟲后的上清液對(duì)松材線蟲幾乎無(wú)殺線活性。要達(dá)到良好的殺線效果，菌株NJSZ-13需靠近甚至附著于松材線蟲蟲體。

表1 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后上清液的殺線活性

表2為菌株NJSZ-13處理松材線蟲后的上清液中分離出的胞外蛋白粗提物對(duì)松材線蟲的殺線活性結(jié)果。結(jié)果表明，菌株NJSZ-13的胞外蛋白粗提物具有較強(qiáng)的殺線活性，沸水浴處理后，殺線活性降低顯著。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外蛋白粗提物的殺線活性逐漸增強(qiáng)。處理24 h后，胞外蛋白粗提物的殺線率為50.31%，沸水浴處理后，殺線率降至13.23%，但仍然高于對(duì)照的1.92%；處理48 h和72 h后，胞外蛋白粗提物的殺線率分別提高至66.23%和82.48%，此時(shí)沸水浴處理的殺線率也分別增至23.88%和26.81%。表明菌株NJSZ-13主要通過(guò)分泌胞外蛋白酶殺死松材線蟲。

表2 蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13胞外蛋白粗提物的殺線活性

2.3 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后菌體繁殖量的變化

通過(guò)細(xì)菌懸浮液的吸光度可以反映細(xì)菌菌體的濃度。由圖3可見，菌株NJSZ-13處理松材線蟲AMA3后，菌蟲混合液和單獨(dú)菌懸液的吸光度總體上呈現(xiàn)前期下降明顯，后期逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)，但自始至終兩者都顯著高于單獨(dú)蟲懸液的吸光度。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株處理松材線蟲1 d后，菌蟲混合液的吸光度開始高于單獨(dú)菌懸液的吸光度，處理后3 d至10 d，菌蟲混合液的吸光度始終顯著高于單獨(dú)菌懸液的吸光度。由此表明，菌株NJSZ-13能夠以松材線蟲蟲體為營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。

*** 表示經(jīng)Tukey多重檢驗(yàn)在P<0.001水平差異顯著。

3 結(jié)論與討論

在自然界中，松材線蟲與微生物之間形成了十分復(fù)雜的關(guān)系。對(duì)于殺線蟲微生物而言，提高線蟲和其接觸機(jī)會(huì)顯然會(huì)提高其生防效果[11]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生防菌株NJSZ-13粘附在松材線蟲體表，可通過(guò)分泌胞外蛋白酶殺死線蟲以獲取營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行繁殖。

大多數(shù)芽孢桿菌其營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖速度快、易于存活定殖，形成抗逆性極強(qiáng)的內(nèi)生芽孢，并且能夠分泌一些抗菌蛋白[12]。目前關(guān)于殺線蟲細(xì)菌侵染線蟲機(jī)理的國(guó)內(nèi)外報(bào)道比較少，大多數(shù)為產(chǎn)胞外水解酶(幾丁質(zhì)酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶等)細(xì)菌[13]。1987年有學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌的伴胞晶體蛋白毒素(Cry5B、Cry6A、Cry14A、Cry21A)能殺死植物寄生線蟲[14]。Huang et al.發(fā)現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)G4菌株和嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)G2菌株都能夠分泌蛋白酶，純化后的蛋白對(duì)全齒復(fù)活線蟲(Resurrectednematodes)和松材線蟲均具有高效殺線活性[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株NJSZ-13處理松材線蟲后的上清液中分離出的胞外蛋白粗提物對(duì)松材線蟲具有較強(qiáng)的殺線活性，隨后將胞外蛋白粗提物進(jìn)行沸水浴處理后，殺線活性顯著降低，表明菌株NJSZ-13主要通過(guò)分泌胞外蛋白酶殺死松材線蟲。這與Huang et al.研究結(jié)果相似，不同的是大多數(shù)研究者分離出的蛋白酶均是從細(xì)菌發(fā)酵濾液中所得，本研究中的蛋白酶為菌株NJSZ-13菌體水懸液處理松材線蟲后的上清液中分離所得，這與菌株NJSZ-13菌懸液具有較高的殺線活性有關(guān)，后續(xù)工作中對(duì)分離到的胞外蛋白酶的結(jié)構(gòu)與功能還需進(jìn)行深入研究。

線蟲表皮由蛋白質(zhì)和甲殼素組成，外層被一層蛋白膜覆蓋，這是保護(hù)線蟲免受環(huán)境破壞的有效屏障[17]。因此，蛋白酶、膠原酶和幾丁質(zhì)酶在線蟲生物防治中一直受到重視。本研究證明菌株NJSZ-13主要通過(guò)分泌胞外蛋白酶殺死松材線蟲，為利用細(xì)菌進(jìn)行高效防治松材線蟲奠定了基礎(chǔ)，今后利用生物技術(shù)方法克隆毒性蛋白酶基因、構(gòu)建殺線蟲工程菌和轉(zhuǎn)基因植物也可能成為防治松材線蟲的有效途徑。在可持續(xù)發(fā)展的今天，利用細(xì)菌開發(fā)生物制劑，防治松材線蟲，已經(jīng)越來(lái)越凸顯出其研究和應(yīng)用價(jià)值。蠟樣芽胞桿菌中殺線蟲蛋白酶對(duì)松材線蟲毒殺活性的發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的化學(xué)殺線蟲劑相比有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)基因工程手段改良菌株提高其毒力，可以使殺線細(xì)菌在自然環(huán)境中更好地發(fā)揮作用，也有望獲得對(duì)松材線蟲有良好防治效果的生防制劑，對(duì)深入研究及開發(fā)防治松材線蟲的商品化生防細(xì)菌具有重要意義。隨著研究的不斷深入，利用蛋白酶防治松材線蟲應(yīng)用前景將非常廣闊，對(duì)其進(jìn)行深入的研究對(duì)于開發(fā)新的松材線蟲生防細(xì)菌制劑以及發(fā)展新的生防戰(zhàn)略具有重要意義。