周曉，張 濤，繆 銘

（食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生改變，不健康生活方式導(dǎo)致的慢性病正成為中國(guó)居民的第一大健康威脅，其中糖尿病和超重肥胖的問(wèn)題不斷凸顯。我國(guó)居民糖尿病患病率增速驚人，2015～2017年我國(guó)18 歲以上人群糖尿病患病率已高達(dá)11.2%[1]。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟數(shù)據(jù)顯示，2019年我國(guó)糖尿病患者數(shù)量達(dá)到1.16 億。《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2020年）》顯示我國(guó)居民超重、肥胖現(xiàn)象進(jìn)一步惡化，城鄉(xiāng)各年齡段居民超重肥胖率持續(xù)上升，已有一半以上的成年人超重或肥胖，糖尿病與肥胖不僅造成患者身體與精神上的損害，也會(huì)給個(gè)人和國(guó)家?guī)?lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。

在慢性病的預(yù)防與治療中，選擇合理的膳食進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)治療十分重要。我國(guó)居民以米面制品作為主食，其主要成分淀粉是人類(lèi)膳食能量的主要來(lái)源，為機(jī)體提供了50%～70%的能量，而淀粉消化與吸收速率對(duì)餐后血糖代謝調(diào)節(jié)具有重要意義。1981年Jenkins 等提出血糖生成指數(shù) （Glycemic Index，GI）的概念，通過(guò)餐后血糖反應(yīng)水平來(lái)衡量碳水化合物[3]。但GI 的測(cè)定需要進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)，成本高，操作難度大。膳食淀粉作為最主要的血糖型碳水化合物，可更方便、更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)膳食淀粉的質(zhì)量，反映膳食淀粉對(duì)人體健康的影響。學(xué)者們研究出一系列適用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢驗(yàn)淀粉消化與吸收性能的體外測(cè)試方法。了解淀粉的消化機(jī)制，并通過(guò)有效的評(píng)價(jià)手段對(duì)淀粉進(jìn)行分類(lèi)分級(jí)，為不同營(yíng)養(yǎng)需求的人群進(jìn)行消費(fèi)指導(dǎo)，對(duì)我國(guó)糖尿病、肥胖等慢性疾病的防治具有重要意義。

1 淀粉營(yíng)養(yǎng)片段的測(cè)定

1992年Englyst 等對(duì)淀粉在小腸中的消化行為進(jìn)行體外模擬，根據(jù)淀粉的生物利用度對(duì)其分類(lèi)：前20 min 內(nèi)消化記為快消化淀粉（Rapidly Digestion Starch，RDS），20～120 min 內(nèi)消化為慢消化淀粉（Slowly Digestion Starch，SDS），剩余抵抗小腸中酶消化的淀粉被稱(chēng)為抗性淀粉（Resistant Starch，RS）。Englyst 法[4]與Guraya 法[5]是兩種經(jīng)典的淀粉營(yíng)養(yǎng)片段檢測(cè)方法，見(jiàn)表1。

表1 體外測(cè)定淀粉營(yíng)養(yǎng)片段方法Table 1 In vitro analysis of nutritional starch fractions

其他研究者在測(cè)定淀粉營(yíng)養(yǎng)片段時(shí)，考慮到底物特性、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒉僮鳁l件等，通常會(huì)在Englyst法和Guraya 法的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整。Ao 等人為了更好地觀察淀粉結(jié)構(gòu)改變對(duì)酶消化的影響，在Englyst方法上降低了酶與底物濃度[6]；繆銘將Englyst 法、Guraya 法和Shin 法[8]與體內(nèi)法測(cè)定SDS 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Englyst 法結(jié)果與體內(nèi)法最為接近[7]。因此在Englyst 法基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，簡(jiǎn)化了酶的選用，使用胰淀粉酶（290 U/mL）與糖化酶（15 U/mL）在pH 5.2條件下進(jìn)行體外模擬小腸消化，能更簡(jiǎn)單準(zhǔn)確地分析SDS。

2 淀粉消化進(jìn)程的評(píng)價(jià)

淀粉的營(yíng)養(yǎng)片段反映了特定時(shí)間段內(nèi)淀粉的消化性能，而平均消化速率 （Rate of Starch Digestion，RSD）和水解率（Hydrolysis Rate，HR）則可以通過(guò)自定義取樣點(diǎn)對(duì)整個(gè)淀粉酶水解過(guò)程進(jìn)行描述[9]。Granfeldt 等對(duì)不同取樣時(shí)間點(diǎn)的水解率繪制水解曲線，并提出水解指數(shù)（Hydrolysis Index，HI）概念[10]。水解指數(shù)HI 的計(jì)算與GI 類(lèi)似，但HI 測(cè)算時(shí)酶水解時(shí)間為180 min，GI 為120 min。HI 與GI之間存在明顯的正相關(guān)，Granfeldt[10]和Goni[11]認(rèn)為可以通過(guò)HI 得到預(yù)估血糖指數(shù) （estimated Glycemic Index，eGI），并研究出計(jì)算公式。eGI 的獲取比GI 更為簡(jiǎn)單，且eGI 的有效性已得到廣泛認(rèn)可，見(jiàn)公式（1）～（4）。

式中：CMal為麥芽糖質(zhì)量，mg；D為滲析液稀釋倍數(shù)；V為體系總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；t為反應(yīng)時(shí)間，h。

式中：mt為取樣時(shí)間點(diǎn)水解淀粉質(zhì)量，g；m為總淀粉質(zhì)量，g。

Ambigaipalan 等對(duì)多種類(lèi)型的蠶豆、黑豆和斑豆中淀粉水解進(jìn)程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源淀粉中HI 與eGI 大小依次為蠶豆＞黑豆＞斑豆，認(rèn)為豆類(lèi)淀粉消化特性的差異受到結(jié)晶層中雙螺旋數(shù)量以及顆粒內(nèi)部微晶分布的影響[12]。左慧玉等繪制了菠蘿蜜種子淀粉的水解曲線，發(fā)現(xiàn)擠壓處理后顆粒疏松多孔，結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，HI 與eGI 顯著增大，菠蘿蜜種子淀粉從中等升糖食物轉(zhuǎn)為高升糖食物[13]。

Goni 等根據(jù)幾種典型淀粉基食品的水解曲線擬合出淀粉水解一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程[11]，見(jiàn)式（5），推算的理論值與實(shí)驗(yàn)值之間具有較好的一致性。動(dòng)力學(xué)方程中k和C∞可作為淀粉基食品的特征參數(shù)，根據(jù)k和C∞即可預(yù)測(cè)任意時(shí)間淀粉水解率。對(duì)數(shù)形式的一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程LOS 模型 （logarithm of the slope）[14]也常用于分析淀粉的消化速率與消化程度，見(jiàn)式（6）。與一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程相比，LOS 圖為線性圖，可以在難以獲得準(zhǔn)確C∞的條件下，通過(guò)計(jì)算曲線的斜率k與y軸截距來(lái)計(jì)算。

式中：t為時(shí)間，min；C和C∞分別為t時(shí)刻和平衡時(shí)產(chǎn)物質(zhì)量濃度，mg/mL；k為動(dòng)力學(xué)常數(shù)，min-1。

Chen 等通過(guò)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程分析了糊化、脫支和濕熱處理對(duì)大米淀粉消化性能的影響，生淀粉糊化后C∞由85.93%增至102%，而糊化淀粉脫支處理后C∞下降，進(jìn)一步濕熱處理后，C∞降至44.69%，抗性淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至55.39%[15]。一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型也被用于研究全谷物粉中內(nèi)源性非淀粉組分如蛋白質(zhì)、脂肪、β-葡聚糖等對(duì)淀粉消化動(dòng)力學(xué)的影響[16-17]，揭示全谷物粉中淀粉慢消化的內(nèi)在因素。在研究純淀粉或者全粉中淀粉糊化后的消化行為時(shí)，一級(jí)動(dòng)力學(xué)通?？梢赃_(dá)到理想的擬合效果，因?yàn)樗鼈冊(cè)隗w外模擬實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，淀粉水解率已基本達(dá)到平衡，擬合后能得到準(zhǔn)確的C∞。但是對(duì)于復(fù)雜的淀粉基食品，如具有完整細(xì)胞壁包封的植物組織、具有蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的面條等，使用LOS 函數(shù)進(jìn)行分析更為合適。LOS 圖對(duì)底物消化行為的變化非常敏感，如果淀粉基食品以不同速率消化，線形圖將不連續(xù)，可將消化過(guò)程分為兩相甚至多相。Edwards 等首次將LOS 模型用于分析鷹嘴豆和硬質(zhì)小麥中淀粉的消化行為，發(fā)現(xiàn)純淀粉和面粉的消化是單相行為，而在具有細(xì)胞壁包封的大顆粒中（鷹嘴豆＞0.55 mm，硬質(zhì)小麥＞1.29 mm）的淀粉消化分為快慢兩相，更加精確地描述了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與粒徑對(duì)淀粉消化行為的影響[18]。Zou 等通過(guò)LOS 模型研究意大利面中淀粉的行為，證明了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是阻礙淀粉消化的主要因素[19]。Fan 等發(fā)現(xiàn)，漆酶的添加使面筋蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加連續(xù)，對(duì)黑青稞淀粉的包封更緊湊，導(dǎo)致快相中淀粉的消化速率k1顯著下降，但是對(duì)慢相的消化速率k2無(wú)影響[20]。

3 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

淀粉在消化道中會(huì)經(jīng)歷復(fù)雜的酶反應(yīng)，淀粉顆粒與酶在接觸過(guò)程中會(huì)受到各種阻礙：細(xì)胞壁與蛋白質(zhì)基質(zhì)的物理屏障作用、致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)、高黏度的食品體系以及非淀粉組分與淀粉酶之間的非特異性結(jié)合等。評(píng)估酶在反應(yīng)體系中的擴(kuò)散和酶-底物之間相互作用對(duì)淀粉消化機(jī)制的研究十分重要[21]。

米氏方程（Michaelis-Menten model），已廣泛應(yīng)用于酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究中，見(jiàn)式（7）。由于米氏方程中的vmax難以判斷，常采用林貝氏方程（Lineweaver-Burk model），即采用DNS 法測(cè)定淀粉水解過(guò)程中v和[S]，以1/v對(duì)1/[S]作圖，可獲得特征常數(shù)Km與vmax，見(jiàn)式（8）。通過(guò)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究可獲知酶活、pH、抑制劑和底物濃度等因素對(duì)淀粉消化速率的影響，對(duì)慢消化淀粉基食品的加工調(diào)控具有重要意義。Meraz 等研究發(fā)現(xiàn)，在不同的酶濃度條件下，米氏方程動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)和結(jié)果誤差范圍不同[22]。

式中：v為反應(yīng)速率，mol/（L·s）；vmax為最大反應(yīng)速率，mol/（L·s）；Km為米氏常數(shù)，mol/L；[S]為底物濃度，mol/L。

體外淀粉消化涉及多種酶，且前期消化速率較高，這使得米氏方程的應(yīng)用受到限制[23]。為了更好地研究不同淀粉體外消化體系中的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，學(xué)者們通過(guò)積分或其他數(shù)學(xué)方法對(duì)米氏方程進(jìn)行了一些調(diào)整。Amoto 等在米氏方程基礎(chǔ)上提出具有6 個(gè)參數(shù)的動(dòng)力學(xué)方程，可以預(yù)估初始可消化淀粉量[24]，這對(duì)體外模擬唾液-胃消化淀粉十分有意義；Vernon-Carter 等研究了葡萄糖對(duì)α-淀粉酶的影響，提出淀粉水解的結(jié)構(gòu)性模型，并確定產(chǎn)物葡萄糖的積累將導(dǎo)致淀粉最大水解率降低[25]，對(duì)于淀粉體外消化模型的優(yōu)化具有重要意義。

4 體外消化模型的優(yōu)化

4.1 靜態(tài)模型的標(biāo)準(zhǔn)化

淀粉體外消化特性的研究多數(shù)僅模擬小腸消化，但食品體系通常比較復(fù)雜，口腔咀嚼以及胃蠕動(dòng)和胃液的消化對(duì)食品物理性質(zhì)以及其他組分的影響不可忽略。同時(shí)，各實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行體外模擬消化的條件并不相同，導(dǎo)致各課題組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以比較。Englyst 等對(duì)1992年提出的淀粉營(yíng)養(yǎng)片段測(cè)定方法進(jìn)行了改良，用于谷物產(chǎn)品中RDS、SDS 與RS 測(cè)定，并通過(guò)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證了改良后Englyst方法具有良好的重復(fù)性[26]。具體操作步驟見(jiàn)表2。

表2 淀粉基食品中淀粉營(yíng)養(yǎng)片段的測(cè)試方法Table 2 In vitro analysis of nutritional starch fractions in starchy food

Minekus 等對(duì)食品靜態(tài)體外消化方法的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行了討論，發(fā)布了INFOGEST 方法[27]。Brodkorb 等對(duì)前人的結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)完善[28]，2019年發(fā)布了INFOGEST 2.0，見(jiàn)圖1。在INFOGEST 2.0 中，建議了樣品的處理方式、酶活的測(cè)定以及模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液中電解質(zhì)的濃度、酶用量和各階段消化時(shí)間等，以減小各研究單位所得結(jié)果的差異，利于橫向比較。在INFOGEST 方法中，實(shí)驗(yàn)條件的設(shè)置盡可能地還原體內(nèi)生理環(huán)境，并且在實(shí)驗(yàn)室具有很好的重現(xiàn)性，但是該方法并不適用于消化過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)分析，僅用于評(píng)估消化終點(diǎn)。在研究淀粉基食品的動(dòng)力學(xué)過(guò)程時(shí)，樣品一般先被研磨粉碎來(lái)模擬口腔咀嚼，再采用兩階段模型（two-stage modle system）模擬胃和小腸對(duì)淀粉的消化[29]。Do 等通過(guò)兩階段模型對(duì)分離純化淀粉和完整細(xì)胞中淀粉的水解曲線進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯淀粉的水解曲線在2 種情況下差異明顯，豆類(lèi)子葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)能阻礙消化酶對(duì)胞內(nèi)淀粉的可及性，降低淀粉在體外的消化速率和程度[30-31]。

圖1 靜態(tài)模擬消化的標(biāo)準(zhǔn)方法Fig.1 Flow diagram of a standardized static in vitro digestion method

4.2 動(dòng)態(tài)模型

體外消化的靜態(tài)模型因具有良好的可操作性，已廣泛應(yīng)用于淀粉消化性能研究中。但靜態(tài)模擬過(guò)程的消化條件過(guò)于理想化，如消化時(shí)間和pH 都已被固定，缺乏在時(shí)間和空間上對(duì)真實(shí)消化環(huán)境中酶-底物含量變化、pH 值、轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間、產(chǎn)物吸收等的模擬，導(dǎo)致靜態(tài)模型對(duì)淀粉體內(nèi)消化行為預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性有限，僅適合對(duì)特定條件下單一底物或成分簡(jiǎn)單的食品進(jìn)行消化模擬[32]。過(guò)去在實(shí)驗(yàn)中常常忽略唾液淀粉酶在酸性胃環(huán)境中的水解作用，但因食物對(duì)胃酸的緩沖和稀釋作用，在胃環(huán)境中唾液淀粉酶能保持活力直至pH＜4。為了更好地再現(xiàn)消化道環(huán)境，深入了解淀粉基食品在體內(nèi)的消化行為，研究體外消化的動(dòng)態(tài)模型十分必要。

英國(guó)的動(dòng)態(tài)仿生胃（DGM）用彈性膜模擬胃壁，通過(guò)水壓變化壓縮和松弛胃壁，不定時(shí)分泌人工胃液，并采用活塞裝置模擬胃蠕動(dòng)對(duì)食物的剪切作用[33]。此外一維動(dòng)態(tài)模擬系統(tǒng)還有美國(guó)的HGS、日本GDS 和荷蘭TNO 的TIMagc[34]。一維動(dòng)態(tài)模擬體系針對(duì)某一消化部位進(jìn)行模擬，動(dòng)態(tài)多維模擬體系則通過(guò)一系列裝置聯(lián)合模擬上下消化道，更接近人體真實(shí)的消化過(guò)程。如Mainville 等通過(guò)電腦監(jiān)控實(shí)時(shí)調(diào)控消化液的加入，首次實(shí)現(xiàn)模擬食物對(duì)胃酸的緩沖作用[35]。TIM 系統(tǒng)各消化單元間通過(guò)中空纖維膜連接，利用膜的透析作用模擬小分子消化產(chǎn)物的吸收過(guò)程[36]，充分考慮到消化過(guò)程中產(chǎn)物對(duì)酶水解的抑制作用。

Balance 等采用試驗(yàn)人員咀嚼—DGM 動(dòng)態(tài)胃消化—靜態(tài)小腸消化模擬了6 種谷物食品的體外消化，結(jié)果表明，通過(guò)淀粉水解曲線計(jì)算得到的體外GI 可以較好反映谷物在體內(nèi)消化后血糖的波動(dòng)，證實(shí)了DGM 的可行性[37]；Wu 等通過(guò)動(dòng)態(tài)體外小鼠胃模型（DIVRS）研究了糙米和精米在胃相中的消化行為[38]。食物進(jìn)入胃相后，pH 急升至接近中性，在隨后的2 h 緩慢降低至pH 3～4。而糙米因?yàn)辂熎拥拇嬖冢种屏私Y(jié)構(gòu)崩解導(dǎo)致最終更低的水解率和較長(zhǎng)的胃排空時(shí)間；Freitas 等使用法國(guó)DiDGI?系統(tǒng)對(duì)面包和意大利面2 種面食進(jìn)行體外動(dòng)態(tài)消化，STORM?軟件進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)和消化液分泌控制，發(fā)現(xiàn)唾液淀粉酶在胃相中仍能水解30%～80%的淀粉[39]。上述動(dòng)態(tài)模型通常比較復(fù)雜，對(duì)設(shè)備要求較高，為了提高動(dòng)態(tài)模型的實(shí)驗(yàn)室可操作性，Mulet-Cabero等使用實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)儀器構(gòu)建了一種半動(dòng)態(tài)消化模型，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置不同消化體積，并克服了INFOGEST 方法中對(duì)pH 緩沖、胃液分泌和胃排空模擬的缺失[40]。國(guó)內(nèi)動(dòng)態(tài)消化模型的研究還處于起步狀態(tài)，李志濤博士[41]研制的新型仿生胃腸道生物反應(yīng)器填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白，并成功應(yīng)用于研究加工方式對(duì)高抗性大米體外消化和發(fā)酵的影響。動(dòng)態(tài)體外消化模型見(jiàn)圖2。

圖2 動(dòng)態(tài)體外消化模型Fig.2 Dynamic in vitro digestion models

5 展 望

淀粉作為膳食中最重要的碳水化合物來(lái)源，其消化率及在胃腸道中消化的位置對(duì)機(jī)體健康至關(guān)重要。體內(nèi)試驗(yàn)是最理想的探究淀粉消化機(jī)制的方式，相較于體內(nèi)試驗(yàn)，體外消化模型在效率、重復(fù)性、成本和倫理上具有十分明顯優(yōu)勢(shì)。體外消化模型已被廣泛應(yīng)用于食品營(yíng)養(yǎng)研究中，但目前仍存在一些局限性，如大多數(shù)消化方法忽視了胃相的消化行為；缺乏體外數(shù)據(jù)與體內(nèi)數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析；不同人群體內(nèi)生化環(huán)境差異明顯，尤其是具有代謝疾病的人群，缺乏個(gè)性化體外消化模型的研究等。在我國(guó)有著大量慢性疾病群體，對(duì)慢消化性、抗性淀粉基食品的開(kāi)發(fā)需求不斷提高，但我國(guó)在體外消化模型的開(kāi)發(fā)上嚴(yán)重滯后。因此亟須食品科學(xué)家進(jìn)一步開(kāi)展大量試驗(yàn)，不斷改進(jìn)與我國(guó)膳食模式相符的體外消化模型，解決淀粉基食品分類(lèi)與分級(jí)的技術(shù)問(wèn)題，推動(dòng)我國(guó)健康事業(yè)的發(fā)展。