吳穎，高蔚，張佑楊，翁婷，李晶晶

肺癌在我國的發(fā)病率有逐年上升的趨勢，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占80%。雖然目前肺癌的早期檢出率及治療有效率明顯增加，但是由于中晚期肺癌確診后仍缺乏有效的治療措施，5年存活率僅僅15.9%，絕大多數(shù)患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)與原發(fā)病灶的轉(zhuǎn)移[1]。因此，識別有效的潛在分子生物標(biāo)記物，對肺癌的預(yù)防、早期診斷、精準(zhǔn)治療及改善預(yù)后很重要。

在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中趨化因子發(fā)揮了比較重要的作用，已有多項研究[2-4]證實趨化因子一定程度上參與了乳腺癌、腎癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，它們不僅促進(jìn)了惡性腫瘤新生血管的形成，并可通過改變腫瘤微環(huán)境，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用[5-7]。CCL5是CC類趨化因子的一類，可通過介導(dǎo)上皮間質(zhì)軟化(EMT)，增強腫瘤細(xì)胞浸潤與轉(zhuǎn)移能力，在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[8]。參與EMT主要蛋白包括E-鈣黏附蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等。部分腫瘤細(xì)胞的TGF-β分泌量很高，TGF-β信號通路是介導(dǎo)EMT發(fā)生的重要途徑，而CCL5可將TGF-β作為效應(yīng)器發(fā)揮作用。但是CCL5-CCR5生物軸與肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移之間具體的作用機制及生物學(xué)功能尚不清楚。本研究通過敲低CCL5基因表達(dá)，抑制NSCLC細(xì)胞內(nèi)CCL5蛋白表達(dá)，觀察下調(diào)CCL5對肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)特征的影響，了解CCL5在肺腺癌發(fā)病過程中可能作用機制，并初步評估CCL5促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞EMT的可能發(fā)病機制，為肺癌靶向治療提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H358均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；小牛血清、DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；Trizol(總RNA抽提試劑)、脂質(zhì)體Lipofect 3 000、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitativereal-time PCR，qRT-PCR)試劑盒均購自美國Invitrogen公司；Transwell培養(yǎng)小室購自美國Millipore公司；Western blot一抗及二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；離心機購自美國Thermo Sciemific公司；熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman coulter。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549均在37℃，含5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗，取生長良好的A549細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。貼壁后按照Lipofectamine 3 000說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將siRNA-NC 、siRNA-CCL5轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，分別作為對照組(siRNA-NC組)、實驗組(siRNA-CCL5組)。轉(zhuǎn)染后將2組細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)待后續(xù)實驗，siRNA-CCL5基因序列號：CCGGCGAGATGCTTAAGTGTGACAACTCGAGTTGTCAC-ACTTAAGCATCTCGTTTTTG。

1.2.2 RT-PCR檢測CCL5mRNA表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后2組細(xì)胞，提取總RNA，測定RNA濃度及純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成CDNA，用PCR儀進(jìn)行擴增，檢測各組細(xì)胞CCL5mRNA表達(dá)水平并計算mRNA相對表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期2組A549細(xì)胞，消化、離心、懸浮，取出所需細(xì)胞的總量，以每孔4×103個細(xì)胞的密度接種在96孔板中。分別將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24、48、72 h細(xì)胞每孔加入CCK-8(10μL)+DMEM(90μL)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測量細(xì)胞在450 nm處的吸光度(opticaldensity，OD)值，并繪制生長曲線(72 h)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染后2組A549細(xì)胞培養(yǎng)48 h，應(yīng)用胰酶消化，離心，加入500 μL Binding buffer 重懸細(xì)胞，加入10 μL Annexin-V-FITC輕輕混勻后，加入5 μL PI 染色，室溫下避光反應(yīng)10 min，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式分析，細(xì)胞凋亡率為annexinV(+)/PI(+/-)細(xì)胞占總細(xì)胞比率。

1.2.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力 遷移試驗：取對數(shù)生長期2組細(xì)胞，胰酶消化，重懸，然后以4×104細(xì)胞數(shù)置于上室培養(yǎng)，下室加入DMEM培養(yǎng)基(含胎牛血清)，培養(yǎng)48 h后擦去未遷移細(xì)胞，用甲醇固定遷移細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染液染色，倒置顯微鏡下數(shù)出遷移細(xì)胞數(shù)目。侵襲試驗：提前用固定濃度的Matrigel凝膠包被小室上室底部膜，其他步驟同遷移實驗。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染的 A549細(xì)胞，血清饑餓24 h后，用5%血清刺激，誘導(dǎo)EMT，按照說明書，提取細(xì)胞總蛋白，檢測細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)水平。同樣方法，提取實驗組和對照組細(xì)胞蛋白, 行TGF-β蛋白檢測。

2 結(jié)果

2.1 CCL5在肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 RT-PCR檢測2種肺腺癌細(xì)胞系和人正常支氣管上皮細(xì)胞中CCL5的表達(dá)。CCL5mRNA在2種肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H358中都有表達(dá)，且均高于人正常支氣管上皮細(xì)胞16HBE中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CCL5在A549細(xì)胞中表達(dá)最高，因此選擇A549細(xì)胞構(gòu)建CCL5敲低的細(xì)胞系。見圖1。

圖1 CCL5在16HBE、H358、A549不同細(xì)胞系中mRNA表達(dá)水平

2.2 siRNA-CCL5對CCL5轉(zhuǎn)錄水平的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，與siRNA-NC組比較，siRNA-CCL5組CCL5mRNA水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

4A～4B Transwell遷移實驗檢測敲低CCL5后A549細(xì)胞遷移能力 4C～4D Transwell侵襲實驗檢測敲低CCL5后A549細(xì)胞侵襲能力圖4 敲低CCL5對A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響

表1 2組CCL5mRNA相對含量

2.3 敲低CCL5對A549細(xì)胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染后，實驗組在24、48、72 h時OD值小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明CCL5敲低可抑制A549細(xì)胞的增殖。見圖2。

2.4 敲低CCL5后 A549細(xì)胞的凋亡情況 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與siRNA-NC組比較，siRNA-CCL5組A549細(xì)胞凋亡率增加(0.78% vs 1.8%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

2.5 敲低CCL5對 A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響 Transwell遷移實驗顯示，對照組遷移平均細(xì)胞數(shù)為(252±13)個，高于實驗組(105±10)個(P<0.05)，見圖4A，4B。侵襲實驗顯示對照組侵襲平均細(xì)胞數(shù)為(198±15)個，高于實驗組(98±11)個(P<0.05)。見圖4C，4D。上述結(jié)果提示CCL5敲低后A549細(xì)胞遷移、侵襲能力均受到抑制。

圖2 CCK8法檢測敲低CCL5對A549細(xì)胞增殖能力的影響

圖3 敲低CCL5表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡的影響

2.6 敲低CCL5對 A549細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白、TGF-β的影響 Western blot 實驗結(jié)果顯示，和 siRNA NC 組相比, CCL5 siRNA 組Vimentin蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)，提示敲低CCL5基因可以減少A549細(xì)胞發(fā)生EMT。CCL5 siRNA 組TGF-β信號通路中的 TGF-β蛋白表達(dá)降低， 提示CCL5可能通過TGF-β通路促進(jìn)E-cadherin 蛋白表達(dá)增加。見圖5。

圖5 Western blot方法檢測敲低CCL5對Vimentin、E-cadherin、TGF-β蛋白表達(dá)的影響

3 討論

CCL5在多種惡性腫瘤性疾病中呈現(xiàn)高表達(dá)并參與了腫瘤進(jìn)展的數(shù)種病理學(xué)過程。其主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和特定類型的腫瘤細(xì)胞，可通過與受體CCR1、CCR3、CCR5等結(jié)合活化蛋白激酶C，促進(jìn)多種免疫細(xì)胞的募集[9-11]。CCL5的異常高表達(dá)可能與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后緊密相關(guān)。Aldinucci等[12]指出在血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病中CCL5-CCR5通路發(fā)揮重要作用； Liu等[13]研究證實巨噬細(xì)胞來源的CCL5通過p65/STAT3-CSN5-PD-L1途徑促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的免疫逃逸；Song等[14]指出RNA TMEM92-AS1通過與YBX1結(jié)合介導(dǎo)CCL5，從而促進(jìn)胃癌進(jìn)展。但CCL5蛋白表達(dá)在肺癌的研究目前相關(guān)研究報道極少。

本研究結(jié)果提示CCL5在人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞、H358中表達(dá)較人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE中升高，提示其可能在肺腺癌中發(fā)揮促癌基因的作用，與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步應(yīng)用shRNA敲低CCL5基因表達(dá)，觀察下調(diào)CCL5表達(dá)對細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示A549細(xì)胞增殖能力明顯降低，凋亡比率增加，因此推測下調(diào)CCL5可抑制A549細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，發(fā)揮抑癌作用，與An等[15]研究結(jié)果相似，該研究顯示在特定類型的乳腺癌中，乳腺癌細(xì)胞能夠自分泌CCL5促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，下調(diào)CCR5和CCL5表達(dá)水平，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。有研究[16]發(fā)現(xiàn)CCL5 mRNA在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，與肝癌的進(jìn)展及預(yù)后有相關(guān)性，同期細(xì)胞實驗證明巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌CCL5能促進(jìn)腫瘤相關(guān)細(xì)胞的增殖或募集; Yamaguchi等[17]研究顯示乳腺癌患者原發(fā)病灶、血液、轉(zhuǎn)移灶、轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中均高表達(dá)CCL5/CCR5，CCL5可能由間充質(zhì)干細(xì)胞分泌，一旦降低乳腺癌細(xì)胞中CCL5表達(dá)，細(xì)胞遷移受抑制，且 CCL5表達(dá)高低與腫瘤侵襲性、分期有明顯關(guān)聯(lián)，上述研究提示CCL5在肝癌和乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵性的作用。本研究Transwell實驗顯示敲低CCL5后，A549細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低，可能與A549細(xì)胞增殖周期停滯導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長的生物學(xué)行為受到影響有關(guān)。

腫瘤的發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，涉及多因素的相互作用。而細(xì)胞增殖和凋亡異常為腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移提供數(shù)量基礎(chǔ)。本實驗結(jié)果提示CCL5可能通過增強腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖能力，抑制凋亡在肺腺癌中發(fā)揮促癌基因作用。有研究[18-19]表明：趨化因子CCL5能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及增加腫瘤細(xì)胞侵襲、增殖的能力, CCR5高表達(dá)與乳腺癌的分期，分級相關(guān)，CCL5或許能成為治療乳腺癌的靶點。研究[20]顯示在肝癌患者中，基質(zhì)細(xì)胞分泌的CCL5通過PI3K-Akt通路刺激Huh7肝細(xì)胞的遷移和侵襲，對其增殖周期和凋亡有一定的影響，均與本文研究結(jié)果一致。

腫瘤細(xì)胞的EMT是惡性腫瘤生長轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。EMT啟動后，部分上皮細(xì)胞的表型蛋白如E-cadherin表達(dá)下降，而間質(zhì)細(xì)胞的表型蛋白如Vimentin表達(dá)升高，腫瘤細(xì)胞黏附能力減弱，遷移、侵襲、抗凋亡性和耐藥能力增強，因此，抑制EMT是腫瘤治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[21]。EMT過程中多條信號通路會出現(xiàn)異常表達(dá)，而TGF-β信號通路最為經(jīng)典。TGF-β可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生 EMT 改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力及發(fā)生免疫逃逸[22]。腫瘤細(xì)胞分泌的 CCL5 可增加腫瘤微環(huán)境中的間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo) EMT發(fā)生[23]。在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中CCL5/CCR5作用軸可能與TGF-β密切相關(guān)。CCL5可通過調(diào)控TGF-β促進(jìn)乳腺癌 EMT[24]。本研究結(jié)果提示CCR5低表達(dá)后，A549細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白水平上調(diào)，而Vimentin蛋白下調(diào)，說明EMT過程受到抑制，且隨著CCL5 敲低，TGF-β蛋白表達(dá)相應(yīng)降低，提示CCL5可能通過TGF-β通路增加A549細(xì)胞EMT，促進(jìn)肺癌的浸潤轉(zhuǎn)移。本研究僅通過肺腺癌A549細(xì)胞初步探討了CCL5增加EMT的可能作用機制，后續(xù)的研究將在其他肺癌細(xì)胞株及移植瘤小鼠中進(jìn)一步驗證。

綜上所述，體外敲低CCL5表達(dá)促進(jìn)A549的凋亡，并抑制其增殖，侵襲和遷移能力，可能是通過TGF-β通路抑制細(xì)胞EMT過程實現(xiàn)的。因此，CCL5作為促癌基因在NSCLC惡性生物學(xué)行為中具有重要作用。本研究對明確肺癌全身擴散、轉(zhuǎn)移的機制，進(jìn)一步開發(fā)新型分子靶向藥物奠定了一定理論基礎(chǔ)。