蔣皓云，金祺祺綜述 吳重陽審校

作為一種腫瘤來源的碎片化游離 DNA，循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)在外周血中富集，并可反映整個腫瘤基因組的信息。其檢測方法從PCR技術(shù)到NGS和ddPCR技術(shù)的轉(zhuǎn)變，使得ctDNA 定量檢測的準確性得到明顯提高。通過監(jiān)測實體腫瘤血漿ctDNA來構(gòu)建的基因圖譜，不僅彌補了組織評估腫瘤相關(guān)基因改變的不足，并已被證明在實體腫瘤早期識別與診斷、腫瘤分子異質(zhì)性評估、靶向治療的遺傳決定因素的鑒定、腫瘤動力學監(jiān)測、早期治療反應(yīng)評估和微小殘留監(jiān)測、腫瘤耐藥性演變的及時評估、疾病進展監(jiān)測等方面具有廣泛潛力。盡管目前血漿ctDNA不是系統(tǒng)性彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)的常規(guī)監(jiān)測指標，但是血漿ctDNA在系統(tǒng)性DLBCL的治療前、治療中及治療后均有不少探究。已有報道發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中，富含表征腫瘤特征的多種生物標志物。本文就CSF中ctDNA及其他潛在生物標志物在PCNSL中的研究進展進行綜述，為這種微創(chuàng)性檢測方式在PCNSL患者中的合理、規(guī)范應(yīng)用提供參考,以期進一步提高PCNSL患者的診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后判斷。

1 原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤

原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma, PCNSL)被定義為僅累及腦、脊髓、軟腦膜及眼的結(jié)外非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)，占所有原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)腫瘤的2%，其發(fā)病率為0.5/10萬，約90%以上的PCNSL在組織學上被歸類為DLBCL[1]，與系統(tǒng)性DLBCL比較，PCNSL 表現(xiàn)出更具侵襲性的生長模式，并且預(yù)后較差，5年和10年生存率分別為29.9%和22.2%[2]。原發(fā)性玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤(primary vitreoretinal lymphoma,PVRL)是PCNSL的一個特殊亞型，年發(fā)病率為0.46/10萬[3]，PVRL腫瘤最初僅出現(xiàn)在眼內(nèi)，病變早期可在玻璃體和視網(wǎng)膜內(nèi)查找到淋巴瘤細胞，隨著疾病進展可累及到顱內(nèi)，PVRL患者中腦部受累者可高達80%[3]。

PCNSL的臨床表現(xiàn)主要與病灶累及的部位呈多灶性相關(guān)，其常見癥狀包括認知功能障礙、人格改變、精神運動減慢和定向障礙[4-5]。MR是目前首選的影像學篩查手段，其診斷金標準仍然是立體定向活檢術(shù)，并行組織病理學和免疫組織化學染色，然而立體定向活檢的不足包括：(1)具有創(chuàng)傷性，據(jù)報道出血率約4%，病理學診斷陰性率為8%～9%[6]；(2)大約 1% 的腦活檢手術(shù)存在嚴重的并發(fā)癥，包括血腫、癲癇發(fā)作和腦水腫及活檢相關(guān)死亡[6]；(3)在某些情況下，由于腫瘤位置較深(腦干)或病灶較小，活檢難度大；(4)臨床中通常使用類固醇來控制PCNSL患者癥狀，而皮質(zhì)醇可能導(dǎo)致腫瘤體積短期內(nèi)縮小，甚至消失，降低立體定位活檢的成功率。因此，對于臨床上高度懷疑PCNSL，但又不適合行立體定向活檢的高危患者，迫切需要一種非侵入性的檢測及預(yù)測手段來彌補立體定向活檢術(shù)的不足，以輔助PCNSL患者的診斷，同時結(jié)合CSF的微創(chuàng)檢查，提高患者的療效監(jiān)測及預(yù)后判斷。

2 ctDNA概述

循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA) 指由腫瘤細胞產(chǎn)生并釋放到外周血液循環(huán)(或腦脊液、尿液、腹腔液、唾液、胃液等)的游離DNA，攜帶包括基因點突變、拷貝數(shù)異常、染色體異常等多種腫瘤遺傳信息[7]，克服腫瘤的時間、空間異質(zhì)性。檢測ctDNA 技術(shù)的能力與腫瘤負荷相關(guān)，傳統(tǒng)PCR、ddPCR通過靶向檢測多種等位基因，提高了分析敏感度[8-9]；NGS非靶向識別拷貝數(shù)異常、單核苷酸取代和結(jié)構(gòu)重排，不斷改進的NGS技術(shù)，例如Safe-SeqS、CAPP-seq等大大提高了ctDNA檢測的準確度和敏感度[10-11]；還有針對特定的基因點突變的實時PCR[12]、用于結(jié)直腸癌篩查的Epiprocolon-Septin9甲基化檢測[13]等多種檢測方法。用于評估具有 EGFR 抗性或 EGFR 致敏突變的ctDNA 檢測已經(jīng)進入臨床實踐，被指南推薦指導(dǎo)非小細胞肺癌治療[14-15]。不少研究通過定性和定量分析腫瘤患者血液、腦脊液、尿液等體液中ctDNA，強調(diào)了其作為指導(dǎo)腫瘤臨床決策(包括輔助診斷、預(yù)后預(yù)測、療效評估、疾病監(jiān)測等)的生物標志物的潛力[16-21]。

液體活檢(liquid biopsy)是指利用血漿、尿液、唾液、CSF等體液中的生物標志物來分析腫瘤的技術(shù)，因其微創(chuàng)、可重復(fù)檢測性在實體腫瘤及淋巴瘤中受到廣泛關(guān)注。目前常用的可用于液體活檢的生物標志物有循環(huán)腫瘤細胞、ctDNA和外泌體等。而ctDNA檢測因其可實時反映腫瘤負荷及基因組信息，因此常被認為是反映腫瘤特性的可靠指標。約90%以上的PCNSL病理類型為DLBCL，血漿ctDNA的價值在系統(tǒng)性DLBCL患者治療前、治療中、治療完成后已有探究，持續(xù)動態(tài)監(jiān)測治療前后及治療期間 ctDNA的變化，可以提供患者腫瘤分子遺傳學的整體情況，這種遺傳演變包括治療過程中突變譜的動態(tài)變化，以及因選擇某種靶向治療而出現(xiàn)的異質(zhì)性[22-26]。這種在分子水平上對靶向藥物獲得性耐藥機制的理解可用于規(guī)劃藥物治療組合，以抑制導(dǎo)致治療失敗的克隆擴增，從而延緩疾病進展或復(fù)發(fā)。在血漿ctDNA的應(yīng)用中，已被證實主要有以下2個因素影響其檢測敏感度：(1)ctDNA的濃度：ctDNA通常需要在大量脫落的正常 DNA 中檢測出腫瘤 DNA，包括腫瘤代謝體積、淋巴瘤惡性程度和腫瘤負荷等多種因素會影響ctDNA濃度[27-28]；(2)ctDNA檢測方法：如上所述，不同的檢測技術(shù)使得ctDNA檢測的準確度和敏感度提升。

3 ctDNA及其他生物標志物與PCNSL

3.1 腦脊液ctDNA 已有研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(包括位于腦實質(zhì)、深部腦組織及脊髓)的腫瘤，其腫瘤細胞可將DNA脫落于CSF中，分析經(jīng)純化CSF 中的 DNA 可獲得腫瘤的特異性突變。另外，部分初診的PVRL患者若有CNS侵犯，CSF中也有可能檢測到ctDNA。PCNSL的發(fā)生與多種分子信號改變有關(guān)，多種基因異常表達最終導(dǎo)致B細胞增殖、分化失控及凋亡受損。目前已經(jīng)描述的各種PCNSL 的發(fā)病機制，包括 NF-κB、JAK/STAT、TLR和 BCR信號通路的失調(diào)。并且涉及到的常見突變基因包括MYD88、CD79b、CARD11等，具體描述如下。

研究發(fā)現(xiàn)，40%～80%PCNSL患者的NF-κB 通路基因(如MYD88、CD79b)發(fā)生改變，NF-κB是BCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游通路。約58%的PCNSL患者可檢測到MYD88突變[29-30]，c.794T>C(L265P)的單個堿基取代導(dǎo)致氨基酸從亮氨酸變?yōu)楦彼?，p.L265P氨基酸取代是 CNS 淋巴瘤中最常見的 MYD88突變[31]。MYD88 L265P取代在非血液系統(tǒng)CNS腫瘤的組織中幾乎未被檢測到[32]，F(xiàn)erreri等[33]發(fā)現(xiàn) CSF中MYD88 L265P突變狀態(tài)區(qū)分新診斷PCNSL與其他CNS疾病的敏感度和特異度分別為72%和99%，這表明該突變是PCNSL鑒別診斷的敏感、特異標志物；此外，MYD88 L265P 對玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤的診斷有100%的特異度[34]。陳錕等[35]報道CSF中MYD88 L265P突變與PCNSL患者的短無進展生存時間(PFS)相關(guān)，是提示預(yù)后不良的因素。另外，已有研究報道了CSF中ctDNA 的消除與PCNSL 患者的持續(xù)治療反應(yīng)相關(guān)[36]。這使得MYD88 L265P突變成為目前唯一在液體活檢分析中明顯可行的分子標記。

CD79b是BCR近端銜接子，BCR能引發(fā)細胞內(nèi)相關(guān)信號生成的關(guān)鍵是免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)，ITAM是含CD79a和CD79b的BCR復(fù)合體中高度保守的多肽。8%～23% 的系統(tǒng)性DLBCL中存在CD79b突變，且多見于ABC亞型[29，37]。據(jù)報道CD79b的突變頻率在PCNSL中高達 83%[38]，明顯高于系統(tǒng)性DLBCL；此外，CD79b和MYD88基因在PCNSL中經(jīng)常發(fā)生共突變[39]，這可作為PCNSL的分子特征。CD79b突變對于PCNSL的預(yù)后影響仍存在爭議[29,40]，但相關(guān)研究均是基于組織樣本進行突變基因檢測。此外，對于其動態(tài)監(jiān)測在PCNSL病程中的意義仍需進一步探究。到目前為止，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)CSF中CD79b突變在PCNSL的相關(guān)分析。

CARD11是一種支架蛋白，位于BCR信號通路上，介導(dǎo)獲得性免疫。CARD11突變是ABC亞型系統(tǒng)性DLBCL的常見突變，與NF-κB的持續(xù)激活相關(guān)[41]，據(jù)報道CARD11突變及其蛋白過表達(免疫組化)與系統(tǒng)性DLBCL的不良預(yù)后相關(guān)[42]。CARD11在PCNSL的突變頻率不等(18%～30%)[38]，但是目前尚未報道 CARD11 監(jiān)測在PCNSL預(yù)后方面的附加價值，其在液體活檢中的意義也有待探索。因CARD11位于BCR信號通路下游，其研究的一個前景在于預(yù)測藥物反應(yīng)，MYD88突變聯(lián)合監(jiān)測CARD11突變判斷PCNSL患者對布魯頓酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase，BTK)抑制劑的反應(yīng)性可作為其應(yīng)用方向之一[43]。

在有關(guān)PCNSL基因突變譜的研究中，還有影響其他通路的基因如MYC、EVT6、PIM1、TOX等。MYC是一種原癌基因，其蛋白是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)涉及多種生物過程的許多基因，包括細胞生長分化、增殖和凋亡，既往研究表明，MYC信號可以使腫瘤微環(huán)境失調(diào)并逃避宿主免疫反應(yīng)[44]。尹文娟等[45]發(fā)現(xiàn)MYC基因拷貝數(shù)增加為不良預(yù)后因素，在Gomes Candido Reis等[46]的報告中，MYC基因表達和蛋白質(zhì)表達之間存在中度相關(guān)性(kappa 0.41～0.60)，且MYC過表達與PCNSL患者不良預(yù)后相關(guān)。陳紅[47]研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)MYC蛋白表達≥40%是PCNSL患者的獨立預(yù)后因素。

EVT6是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，在造血及細胞惡變中起作用，6%～21%的PCNSL患者發(fā)生了EVT6突變；PIM1是體細胞超突變靶點，多項研究報道了其在PCNSL的突變頻率從3%～71%不等[48]。TOX基因在B細胞分化和T細胞發(fā)育中起作用，大多數(shù)研究報道了該基因的純合缺失，在PCNSL中的頻率范圍為3%～30%[49]。到目前為止，還沒有針對上述基因的靶向治療，它們在液體活檢中的作用尚待進一步探究。

PCNSL發(fā)病率較低，但療效差且易復(fù)發(fā)，目前該疾病缺少顯著有效的治療方案，但隨著新型檢測技術(shù)的出現(xiàn)及對PCNSL病理生理學的深入了解，針對上述基因靶點的檢測，新的靶向藥物及聯(lián)合治療方案不斷涌現(xiàn)。另外，療程中動態(tài)監(jiān)測基因突變負荷及克隆演變，有助于早期識別復(fù)發(fā)；同時，這種在分子水平上對靶向藥物獲得性耐藥機制的理解可用于規(guī)劃藥物治療組合，及時調(diào)整治療方案延緩疾病復(fù)發(fā)或進展，有助于改善患者預(yù)后。

3.2 其他生物標志物

3.2.1 miRNA：微小核糖核酸(microRNA, miRNA) 是相對較小的非編碼 RNA，長度為 18～24 個核苷酸，通過與靶標 mRNA 結(jié)合來抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達，從而觸發(fā)降解或翻譯下調(diào)，參與細胞增殖、分化、代謝、凋亡和腫瘤發(fā)生等多種生物學過程。有研究表明，miR-125a、miR-125b、miR-17-92 簇(包括miR19b 和 miR-92a)和 miR-155在系統(tǒng)性DLBCL的發(fā)病機制中有顯著的影響[50]。Baraniskin等[51]發(fā)現(xiàn)，與其他CNS疾病患者相比，PCNSL患者CSF中miR-15b、miR-19b、miR-21、miR-92a、miR-106b 和 miR-204濃度升高；且CSF中miR-21升高的患者，miR-19b 和 miR-92a 也同時升高。所以，將上述3種miRNA聯(lián)合，診斷PCNSL的特異度和敏感度分別為96.7%、95.7%。CSF中miRNA 的濃度與治療和隨訪期間的 PCNSL 疾病狀態(tài)顯著相關(guān)，證明它有作為治療監(jiān)測和隨訪生物標志物的能力[52]。這些數(shù)據(jù)表明，CSF中 miRNA 有可能用作 PCNSL 的非侵入性診斷生物標志物。另外，CSF中miRNA與其他潛在生物標志物(MYD88、白介素10等)聯(lián)合，可進一步提高診斷的敏感度及特異度。隨著時間和檢測手段的改進，CSF中miRNA在PCNSL微創(chuàng)診斷的臨床應(yīng)用價值可能會得以實現(xiàn)。

3.2.2 IL-10和IL-6：研究發(fā)現(xiàn)，白介素 10 (interleukin 10,IL-10) 及其受體在PCNSL中過度表達，IL-10作為一種參與炎性反應(yīng)和免疫抑制的細胞因子，在淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮不同的作用，并且可調(diào)節(jié)細胞的生長和分化。IL-6是一種多效性細胞因子，促進淋巴細胞的生長并調(diào)節(jié)免疫功能[53]。Nguyen-Them等[54]發(fā)現(xiàn)，PCNSL患者CSF中IL-10 和IL-6 水平明顯高于其他CNS腫瘤。依據(jù)CSF中IL-10水平設(shè)取不同截斷值，可發(fā)現(xiàn)其診斷敏感度及特異度不同，敏感度為65.4%～94.7%、特異度為88.9%～100%。Song等[55]分析了22例PCNSL患者的CSF樣本，將IL-10臨界值設(shè)定為8.2 ng/L 時，診斷敏感度和特異度分別為95.5% 和 96.1%；同時，將CSF中IL-10/IL-6 比值取0.72時，可將敏感度提高到95.5%，特異度提高到100.0%。趙暉等[56]發(fā)現(xiàn)IL-10的臨界值選擇8.47時,診斷敏感度和特異度分別為48.9%、95.6%,IL-10/IL-6的臨界值選擇1.38時,診斷敏感度可提升至73.3%,特異度為64.8%。CSF中IL-10、IL-6可能成為PCNSL診斷的有效指標，但是有效的截斷值尚待統(tǒng)一。此外，腦脊液IL-10的變化與病程相關(guān)，并且可早于影像學預(yù)測復(fù)發(fā)或進展[57]。由于血腦屏障，相較于血清IL-10、IL-6檢測，CSF中IL-10、IL-6水平的變化更能反映腫瘤狀態(tài)，CSF中IL-10、IL-6或許可成為預(yù)后預(yù)測和動態(tài)監(jiān)測的微創(chuàng)指標。

4 小 結(jié)

總之，對于臨床上高度懷疑PCNSL，但不適合行立體定向活檢的患者，及早進行CSF中ctDNA檢測，同時聯(lián)合其他生物標志物(IL-10、IL-10/IL-6、miRNA)，能夠提高診斷的精確度，以免治療延誤。同時，對于臨床上已經(jīng)確診的患者，通過動態(tài)監(jiān)測CSF中ctDNA的變化，可及時、及早幫助臨床指導(dǎo)治療、進行療效監(jiān)測及早期預(yù)測復(fù)發(fā)等。然而，CSF中ctDNA檢測仍然存在諸如有效臨界值的設(shè)定、作出臨床決定的最佳時間點等爭議，因此臨床中心之間的合作、檢測精確性的提高及更多創(chuàng)新性臨床試驗的開展，將是提高液體活檢技術(shù)在PCNSL臨床效用的關(guān)鍵。